Başlamak için, altı ila sekiz haftalık bir CD 45.1 pozitif SMARTA fare edinin ve intravenöz olarak 100 mikrolitre RPMI ortamında 200 mikrogram LCMV GP 61-77 peptidi enjekte edin. Splenositleri fareden aldıktan sonra, mililitrede eighT hücrelerine 10 kez bir hücre yoğunluğu elde etmek için% 2 RPMMI'de askıya alın ve hücrelerin bulunduğu tüpü buz üzerine yerleştirin. Yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 150 mikrolitre boyama tamponu ile birlikte 50 mikrolitre hücre süspansiyonu dağıtın.
96 oyuklu plakayı 800 G'de dört santigrat derecede bir dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice boşaltın. Plakayı girdaplayın ve her oyuğa 200 mikrolitre boyama tamponu ekleyin. Hücreleri peletledikten sonra, karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde yüzey antikor kokteyli ile yeniden süspanse edin ve inkübe edin.
İki kez yıkadıktan sonra, hücreleri 200 mikrolitre boyama tamponunda yeniden süspanse edin ve bunları bir akış sitometri tüpüne aktarın. SMARTA CD4 pozitif T hücrelerinin aktivasyon durumunu kontrol etmek için akış sitometrisi analizi yapın. Daha sonra, altı SMARTA CD4 pozitif T hücresini 24 oyuklu bir plakaya bir kez 10 kez tohumlayın.
Hücreleri dört santigrat derecede üç dakika boyunca 800 G'de döndürün ve süpernatan ortamı dikkatlice çıkarın. Daha sonra, her oyuğa bir mililitre retrovirüs ortamı ve sekiz mikrogram polibren ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede iki saat boyunca 800 G'de döndürün.
Retrovirüs ortamını attıktan sonra, hücreleri interlökin 2 ile desteklenmiş bir mililitre önceden ısıtılmış% 10 RPMI ile inkübe edin. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, mililitre başına 10 ila sekizinci hücrelerin bir katı hücre yoğunluğu elde etmek için hücreleri %2 RPMI ile yeniden süspanse edin.
Transdüksiyon verimliliğini değerlendirmek için, 50 mikrolitre hücre süspansiyonunu yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakaya alikotlayın. CD4, V alfa iki ve vektör etiketi ile ilişkili antikor içeren yüzey antikor kokteyli ile buz üzerinde inkübe edin. Hücreleri yıkayın ve daha önce gösterildiği gibi akış sitometrisi yapın.
Daha sonra, altı CD 45.1 pozitif SMARTA CD4 pozitif T hücresinin 10'unu intravenöz olarak bir C57BL / 6 alıcı fareye enjekte edin, ardından ertesi gün LCMV Armstrong'un altı plak oluşturan birimine bir kez 10 kez enjekte edin. Splenositleri fareden aldıktan sonra, istenen belirteçleri kontrol etmek için boyayın. Transkripsiyonel faktörleri tespit etmek için, hücreleri karanlıkta 20 dakika boyunca oda sıcaklığında 200 mikrolitre% 2 paraformaldehit ile inkübe edin.
Son olarak, erken akut LCMV enfeksiyonu aşamasında faktörleri tespit etmek için akış sitometrisi yapın. Enfeksiyondan sonraki üçüncü günde, MIGR1 SMARTA CD4 pozitif T hücreleri arasında foliküler yardımcı T hücreleri ve T-yardımcı 1 hücrelerinin dengeli bir çatallanması bulundu. MIGR1, BCL6, SMARTA, CD4 pozitif T hücrelerinde baskın bir foliküler yardımcı T hücresi yönlendirilmiş farklılaşma ve artmış BCL6 ekspresyon seviyeleri gözlendi.
