GFP'nin hücre altı lokalizasyonunu gözlemlemek için, Nicotiana benthamiana'nın 48 saatlik agroinfiltrasyonundan sonra, düz bir yaprak seçin ve bir delgeç kullanarak altı milimetrelik bir delik açın. % 30 sükroz çözeltisini bir cam slayt üzerine damlatın. Yaprak örneğini arkası yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve üzerini bir kapak camı ile örtün.
Agroinfiltrasyondan üç gün sonra rekombinant GFP ifade eden sağlam, taze N.benthamiana yapraklarını toplayın ve yaprakları tartın. Kalıntıları temizlemek için yaprak bıçağını önceden soğutulmuş, sterilize edilmiş, çift damıtılmış suyla durulayın. 1.000 mililitrelik geniş ağızlı bir beherde 500 mililitre önceden soğutulmuş 100 milimolar fosfat tamponuna abaksiyal tarafı aşağı bakacak şekilde 20 gram daldırın.
Yaprakları 100 gözenekli naylon, ince gözenekli iplik ve plastik bir plaka ile örtün. Beheri bir vakum pompasına bağlayın. Bir dakika boyunca 0,8 megapaskal vakum uygulayın, ardından hızla atmosferik basınca geri dönün.
Yaprakları tampondan çıkarın ve emici kağıtla nazikçe kurulayın. Yaprakları sarın ve örgü iplikle sarın. Apoplastik yıkama sıvısını veya AWF'yi toplamak için, haddelenmiş yaprakları, tüp kapakları tarafından tutturulmuş ağ ipliği ile 50 mililitrelik santrifüj tüplerine uç tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
Yaprakları 500 g'da dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Yaprakları çıkarın ve bir pipet kullanarak AWF'yi toplayın. Nikel Sefaroz excel reçinesini, protein özü hacmine göre bire 1.000 oranında bir tüpe ekleyin.
Nikel reçinesini, reçine hacminin 10 katı çift damıtılmış su ve fosfat tamponu ile sırayla üç kez yıkayın. Tam bağlanmayı sağlamak için protein ekstraktını nikel reçinesi ile iki saat inkübe edin. Daha sonra, süpernatanttaki bağlanmamış proteinleri çıkarmak için dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 g'da santrifüjleyin.
Reçine hacminin 20 katı fosfat tamponu ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, GFP'leri elüte etmek için 250 milimolar imidazolün reçine hacminin 10 katı ekleyin. Karışımı 500 g'da dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin ve süpernatanı toplayın.
Western blot analizi, N. benthamiana'daki 30 kilodalton rekombinant protein GFP'lerinin geçici ekspresyonunu doğruladı. Floresan mikroskobu, aplast içinde GFP'lerin varlığını göstermiştir. Vakum infiltrasyon santrifüjlemesi ile ekstrakte edilen AWF proteinleri ayrıca GFP'ler içeriyordu.
Test edilen sekiz ekstraksiyon çözeltisinden, fosfat tamponu en fazla miktarda AWF ve GFP'yi ekstrakte etti. Değişen pH'larda fosfat tamponunun karşılaştırılması, nötr ila hafif alkali koşullarda gelişmiş AWF ve GFP ekstraksiyonunu ortaya çıkardı. Ek olarak, 100 milimolar fosfat tamponu, AWF ve GFP'lerin geri kazanılması için maksimum etkinlik gösterdi.
100 milimolar fosfat tamponu ile, bir gram taze yaprak başına 495 mikrogram toplam AWF proteini apoplasttan geri kazanıldı. Ekstrakte edilen AWF, toplam çözünür proteindeki GFP'lerin yaklaşık %18'ine karşılık gelen 10 mikrogram GFP içeriyordu. Nikel afinite kromatografisini takiben, GFP'lerin saflığı, AWF ekstraksiyonundan %84,3'e ulaştı ve bu, toplam çözünür protein ekstraksiyonu yoluyla elde edilen %44,9 saflıktan önemli ölçüde daha yüksek.
