İnsan Meme Epitel Hücrelerini İzole Etmek için Meme Dokusunun Sindirimi

Dokuyu ayırarak başlayın. Yağ dokusunu meme dokusundan çıkarmak için iki çift forseps kullanın. Kalan meme dokusunun yaklaşık bir gram ağırlığında olduğundan emin olun.

Meme dokusunu beş mililitre% 75 etanol çözeltisi içinde beş saniye durulayın. Daha sonra, 20 mililitre yıkama solüsyonu ile her biri beş dakika boyunca iki kez yıkayın. Ardından, meme dokusunu daha küçük parçalara ayırmak için iki cerrahi bıçak kullanın.

Bir doku homojenatı elde etmek için 15 dakika boyunca sürekli olarak, parçalanmış dokuyu 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Toplam 20 mililitre sindirim çözeltisi için 10 mililitre dispas ve kollajenaz çözeltisi, üç mililitre% 0.25 tripsin ve yedi mililitre PBS ekleyin. Tüpü 37 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin ve tüpü her 20 dakikada bir sallayarak 1 1/2 saat inkübe edin.

Sindirim işlemini durdurmak için 20 mililitre nötralize edici çözelti ekleyin. Ardından, iyice karıştırmayı sağlamak için içeriği yaklaşık 15 kez pipetleyin. Karışımı 100 mikronluk gözenekli bir filtreden süzün.

Bundan sonra, beş dakika boyunca 156G'de santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı çıkarın. Peletin inkübasyonunu 20 mililitre nötralize edici çözelti ile tekrarlayın, ardından pipetleme ile karıştırın.

Beş dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücre peletini 10 mililitre başlangıç kültür ortamı ile yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 100 milimetrelik bir hücre kültürü kabında plakalayın.

Hücreleri 37 santigrat derecede% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe yetiştirin. Orijinal kültür ortamını her üç günde bir taze epitel hücre ortamı ile değiştirin. Hücreleri kontrol edin ve ortamı iki günde bir yenileyin.

Bu protokol kullanılarak, insan meme epitel hücreleri meme dokusundan izole edildi. İzolasyon sonrası analiz, ROCK inhibitörü Y-27632 ile tedavi edilen hücrelerin, kontrol grubuna kıyasla belirgin bir büyüme sergilediğini gösterdi. CCK-8 testi, Y-27632 içeren ortamdaki hücrelerin, kontrol ortamındakilerden önemli ölçüde daha yüksek bir oranda çoğaldığını ortaya koydu.

İmmünofloresan deneyleri, hücrelerin çoğunluğunun meme epitel hücre belirteçleri, CK7 ve GATA3'ü eksprese ettiğini ve sonraki pasajlarda diğer hücre tiplerinin ihmal edilebilir bir şekilde varlığını doğruladı. Ayrıca, qRT-PCR çalışmaları, tutarlı fenotip veya farklılaşma kapasitesini gösteren çeşitli pasajlar boyunca CK7 ve GATA3'ün tutarlı ekspresyon seviyelerini gösterdi.