Başlamak için, sitrat antikoagüle edilmiş tam kanı 200 g'da 20 dakika santrifüjleyerek trombositten zengin plazma elde edin. Plazmaya indometasin ve PGE1 ekleyin ve 500 g'da 10 dakika santrifüjleyin. Mililitre başına 2x10^8 trombosit yoğunluğu elde etmek için elde edilen trombosit peletini modifiye Tyrode'un HEPES tamponunda 37 santigrat derecede yeniden süspanse edin.
Trombositleri 37 santigrat derecede 30 dakika dinlendirin. Trombosit süspansiyonuna beş mikromolar nihai konsantrasyona DETC ve 25 mikromolar nihai konsantrasyona deferoksamin ekleyin, ardından 200 mikromolar nihai konsantrasyona CMH ekleyin. Numuneleri Teflon kaplı karıştırma mıknatısları ile donatılmış agregasyon küvetlerine yerleştirin ve bunları agregometreye yükleyin.
Bir dakika sonra, trombin veya kollajen gibi uyaranları ekleyin ve 10 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, trombosit süspansiyonunu agregasyon küvetinden bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve 10 saniye boyunca 6.000 g'da hızlı bir şekilde döndürün. Kılcal mikro pipetlere 50 mikrolitre süpernatan yükleyin ve EPR sızdırmazlık mumu ile kapatın.
Numuneleri EPR tarayıcıya aktarın ve tarayıcıda parametreleri ayarlayın. Kaydedilen EPR tepe noktalarının eğrisinin altındaki alan olarak CMH radikaline CMH oksidasyonunu tahmin edin. Piyasada bulunan CM radikalini kullanarak bir kalibrasyon eğrisi elde edin.
Numunelerdeki EPR sinyal yoğunluğu, EPR tepe noktalarının yoğunluğu ile orantılıydı. Tespitin özgüllüğü, ROS temizleyicileri ve süperoksit anyonu üreten enzimlerin seçici inhibitörleri ile doğrulandı. Seçici inhibitörün varlığında trombin veya kollajen ile trombosit stimülasyonu için veriler VAS2870 NADPH oksidazların bu agonistlerin her ikisine de yanıt olarak trombosit süperoksit anyonlarının ana kaynağı olduğunu düşündürmektedir.
