Başlamak için, 24 saat aç kalmış Monochamus alternatus ve Tribolium castaneum böceklerinin yüzeyini çamaşır suyu, etanol ve damıtılmış su ile sterilize edin. Mantar enfeksiyonunu indüklemek için önce çam dallarını veya buğday kepeğini 10 saniye boyunca konidiyal süspansiyona daldırın. Sonra böcekleri konidiyal süspansiyona batırın.
Kuruduktan sonra, bir böceği ve bir dalı 50 mililitrelik steril bir tüpe yerleştirin. Böcekleri nemlendirilmemiş bir inkübatörde 25 santigrat derecede geri getirin. Kuluçka işleminden sonra, ölü böcekleri 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve tüpün içine bir parça steril, nemli pamuk yerleştirin.
Mantar enfeksiyonları olan enfekte böcek gövdelerini anten, kafa, göğüs, karın, kanatlar ve bacaklar gibi pozisyonlara inceleyin. Olgun mantar kolonilerinin beş milimetrelik disk tapalarını kesin. Enfekte böcek dokularını iki gün boyunca dört santigrat derecede önceden soğutulmuş% 2.5 glutaraldehit içine yerleştirin.
Daha sonra, numuneleri beş dakika boyunca% 0.1 fosfat tamponunda üç kez yıkayın ve her biri 10 dakika boyunca artan etanol konsantrasyonlarında dehidre edin. Numuneleri vakumlu dondurarak kurutucuda kurutun ve ardından mantar yapılarını taramalı elektron mikroskobu altında gözlemleyin. Buğday kepeğine 10 saniye boyunca konidiyal bir süspansiyon uygulayın ve kuruduktan sonra bir Petri kabına aktarın.
T.castaneum böceklerini, buğday kepeği içeren Petri kabına yerleştirmeden önce 10 saniye boyunca konidiyal süspansiyona batırın. Kuluçka işleminden sonra, ölü böcekleri plakadan sayın. Mantar genomik DNA izolasyon kitini kullanarak parazitik entomopatojenik mantarların genomik DNA'sını çıkarın.
Verilen primer setlerini kullanarak, gene özgü amplifikasyon için bir PCR reaksiyon karışımı hazırlayın. Dizilemeden sonra, ClustalX 2 kullanarak nükleotid dizisini hizalayın. Son olarak, maksimum olabilirlik yöntemine dayalı olarak MEGA 6 kullanarak filogenetik analiz yapın.
Aspergillus austwickii, Akanthomyces attenuatus ve Scopulariopsis alboflavescens gibi parazitik mantarlar M. alternatus'ta önemli enfeksiyon semptomlarına neden olmuştur. SEM gözlemleri, böceklerin yüzeyindeki bu parazit mantarların morfolojik özelliklerini daha da destekledi. Entomopatojenik aktivite, parazitik mantarlarda kontrol grubuna kıyasla anlamlı derecede daha yüksek mortalite oranları göstermiştir.
Çok genli filogenetik ağaç, üç parazit mantar türü ile kendi cinsleri içindeki diğer türler arasındaki genetik mesafeleri gösterdi.
