Her anestezi uygulanmış fareye intravenöz olarak 100 mililitre normal salin içinde seyreltilmiş bir ila üç miligram florofor konjuge anti-fare CD45 antikoru enjekte edin. Her fare için özel bir doku ayrıştırıcı tüp içinde hazırlanmış dört mililitre buz gibi HEPES tamponunu buz üzerine yerleştirerek başlayın. Fareyi ötenazi yaptıktan sonra, rezeke edilen akciğerleri buz üzerinde soğutulmuş ilgili doku ayrıştırıcı tüpüne yerleştirin.
Tüpleri otomatik doku ayrıştırıcıya yerleştirin ve akciğer dokusu için önceden ayarlanmış ilk programı çalıştırın. Daha sonra, ayrışmış akciğer dokusunu içeren her tüpe 500 mikrolitre liferaz stok çözeltisi ve 500 mikrolitre aminoguanidin stok çözeltisi ekleyin. 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca bir somunlama karıştırıcısında inkübe edin.
Daha sonra, tüpleri tekrar ayrıştırıcıya yerleştirin ve akciğer dokusu için önceden ayarlanmış ikinci programı çalıştırın. Şimdi tek hücreli süspansiyonu doku ayrıştırıcı tüpünden 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik konik bir tüpe dökün. Doku ayrıştırıcı tüpünü beş mililitre tam EHAA ile durulayın ve süzgeçten 50 mililitrelik tüpe geçirin.
Süzgeci çıkardıktan sonra, hücre süspansiyonunun hacmini tam EHAA ile 50 mililitreye yükseltin. Özel doku ayrıştırıcı tüpleri kullanmak yerine, rezeke edilen akciğerleri buz üzerinde soğutulmuş ilgili 1.5 mililitrelik mikrofüj tüplerine yerleştirin. Tüm akciğerler alındıktan sonra, her bir akciğeri herhangi bir hücre ortamı olmadan yeni bir mikrofüj tüpüne aktarın.
Makas kullanarak, akciğerleri mikrofüj tüpü içinde küçük parçalar halinde kesin. Her tüpe bir mililitre liberase TM ve DNase I sindirim kokteyli ekleyin. Bir su banyosunda 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.
Ardından, numuneyi 50 mililitrelik konik bir tüpün üzerine yerleştirilmiş 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinin üzerine dökün. Kalan numuneyi süzgecin üzerine pipetleyin. Steril bir mililitrelik şırıngadan pistonun kauçuk ucu ile dokuyu ağa doğru ezin.
Süzgeci soğuk ayırıcı tamponla durulayın ve tüpte yedi mililitrelik son bir hacim toplayın. Otomatik veya manuel ayrışma yöntemini kullanarak, elde edilen hücre süspansiyonunu santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin, geride yaklaşık 100 mikrolitre süpernatan ve hücre peleti bırakın.
En sonunda, toplam hacmi 200 mikrolitreye çıkarmak için yaklaşık 100 mikrolitre Fc blok çözeltisi ekleyin ve peleti yeniden süspanse etmek için kuvvetlice girdap yapın.
