Başlamak için, fare hipokampal dilimlerinin konfokal görüntülerini elde edin. Görüntü dosyasını Neurolucida 360 yazılımında açtıktan sonra, 3B ortam penceresinin üst araç çubuğunda bulunan taşı/pivot noktası aracına sol tıklayın. Ardından, yeni pivot noktasını oluşturmak için istediğiniz dendrite sol tıklayın.
Bundan sonra, orijinal görünümü geri yüklemek için yönü sıfırla simgesine sol tıklayın. Ardından, dendriti izlemeye devam etmek için taşıma/pivot noktası aracına tekrar tıklayın. 3B ortam penceresindeki ağaç sekmesine sol tıklayın.
İzleme modu ve yönlü çekirdekler için Kullanıcı Kılavuzlu" izleme seçenekleri altındaki yöntem olarak Kullanıcı Kılavuzlu'yu seçin. Dendrit izlemeyi başlatmak için, dairesel bir çekirdek göründüğü anda dendrite sol tıklayın. Ardından, imleci dendritik segment boyunca hareket ettirin.
Sürekli çekirdek popülasyonunu sağlamak için, imleci dendrit üzerinde nazikçe ileri geri hareket ettirin. Ardından, algılanan çekirdekleri güvence altına almak için sol tıklayın. Çekirdekler dolmayı yakalarsa, manuel olarak yerleştirmek için bir çekirdeğin dendrit boyunca daha ileride göründüğü yere sol tıklayın ve izlemeyi durdurmak için sağ tıklayın.
Dendritik izlemenin hassasiyetini üç boyutta da kontrol etmek için 3B ortam penceresi içinde sol tıklayın ve sürükleyin, eğim, sapma ve yuvarlanma. Dendrit izlemenin amaçlanan yoldan saptığı noktaları bulun. Dendrit izlemedeki herhangi bir yanlışlığı düzeltmek için, ağaç menüsünde bulunan düzenleme sekmesine gidin.
İlgilenilen dendrite sol tıklayın ve ardından gerekli ayarlamaları yapmak için noktalara tıklayın. Ardından, yanlış yerleştirilmiş noktaları tıklama ve sürükleme yoluyla dendrit segmentine geri taşıyın. Kaldırmak için yabancı noktaya sol tıklayın ve ardından sil düğmesine tıklayın.
Noktalar dendrit segmentini yeterince kaplamıyorsa, üzerlerine sol tıklayarak ve kaydırıcıyı kullanarak kalınlığı değiştirerek boyutlarını ayarlayın. Bundan sonra, 3B ortam penceresindeki omurga sekmesine gidin. Dış aralık, minimum yükseklik ve minimum voksel sayısı için algılama ayarlarını yapın.
Dedektör hassasiyetini %70'e ayarlayın ve ardından ayarlanan hassasiyet seviyesine göre tüm dendritlerdeki dikenleri tanımlamak için Tümünü Algıla'ya sol tıklayın. Dendrite özel bir seçim için, en yakın daldaki tümünü algılamak için Resme Tıkla seçeneğini kullanın ve farklı dedektör hassasiyetleri uygulamak için her bir dendrite manuel olarak sol tıklayın. Dikenleri tespit ettikten sonra, kapsama alanını incelemek için dendriti üç yönde de tıklayın ve sürükleyin.
Algılanan dikenler yetersiz doldurulmuşsa, dedektör hassasiyetini %5 ila %10 oranında artırın ve bunları daha yüksek bir hassasiyet seviyesinde değiştirmek için Tümünü Algıla"ya tekrar tıklayın. Aşırı doldurulmuş dikenler tespit edilirse, dedektör hassasiyetini %5 ila %10 oranında azaltın ve omurga algılamasını daha düşük bir hassasiyetle güncellemek için bir kez daha Tümünü Algıla"yı seçin. Ardından, 3B ortamın omurga sekmesinde Mevcut Omurgaları Koru'ya sol tıklayın.
En yakın daldaki tümünü algılamak için resme tıklayın" seçeneği etkinse, seçimini kaldırdığınızdan emin olun. Daha fazla omurga analizi için belirli bir dendrite odaklanmak için, Pivot Noktasını Taşı'ya sol tıklayın ve ardından pivot noktasını ayarlamak için istenen dendrite tıklayın. Pivot noktası ayarlandıktan sonra, Pivot Noktasını Taşı seçeneğinin işaretini kaldırın"Doldurulmamış görünen bir dendritik omurgayı tanımlayın.
Dedektör hassasiyetini önceki ayarın ötesinde %10 ila %20 oranında artırın ve doğrudan omurgaya sol tıklayın. Omurga yerleşmezse, Seçilen konumda bir omurga tespit edilemiyor" mesajı görünecektir. Dedektör hassasiyetini kademeli olarak artırın, bir omurga tespit edilene ve yeterince doldurulana kadar potansiyel olarak %100'ü aşın.
Yetersiz doldurulmuş bir omurgayı düzeltmek için düzenleme sekmesine gidin ve üzerine sol tıklayın. Kaldır'ı seçin"sonra düzenleme sekmesinin seçimini kaldırın. Hassasiyeti %5 ila %10 oranında artırın ve omurgaya tekrar sol tıklayın.
Aşırı doldurulmuş bir omurga için, düzenle sekmesine gidin ve onu seçin. Kaldır'ı tıklayın"sonra düzenleme sekmesinin seçimini kaldırın. Hassasiyeti %5 ila %10 oranında azaltın ve omurgaya sol tıklayın.
Dendriti, komşu dendritlere, yanlış pozitiflere veya yanlış bir şekilde diken olarak tanımlanan dendritik segmentlere ait olabilecek herhangi bir diken açısından inceleyin. Bu yanlışlıkları silmek için "Kaldır" ı kullanın. Ardından, dendrit üzerinde tanımlanan dikenlere erişin.
Birden fazla dikenin tek bir konglomerada birleşmiş gibi göründüğü durumlarda, düzenle sekmesine erişin, konglomera omurgasını seçin ve değerlendirmek için Seçimi Gizle"ye tıklayın. Onaylanırsa, düzenleme sekmesinde Seçimi Göster'i seçin ve ardından dikenleri ayırmak için bölün. Tüm dikenler görsel olarak tanımlanmış ve doğru bir şekilde tasvir edilmişken, omurga sekmesine gidin ve Tümünü Sınıflandır"onları ince, mantar, güdük ve filopodia olarak kategorize etmek için.
Tüm omurga algılamalarını ve sınıflandırmalarını tamamladıktan sonra, izlemelerden toplanan verileri kaydetmek için 3B ortam penceresinin üst araç çubuğunda, Neurolucida Explorer'da "Kaydet ve Görüntüle"yi seçin. Explorer penceresinde, görünüm sekmesine gidin ve tüm dendritleri ve dikenleri vurgulamak için "Tümünü seç"e sol tıklayın. Ardından, üst araç çubuğunda bulunan analiz sekmesine ilerleyin.
Yapı açılır menüsüne sol tıklayın ve vurgulanan öğelerin ayrıntılı bir yapısal analizini başlatmak için Şube Yapı Analizi"ni seçin. Omurga yoğunluğu ve ortalama omurga hacmi analizi için her ağacı ve her dendriti seçin. Ardından, tıklayın Omurgalar"Ardından Omurga Detayları"Tamam"a tıklayınanalizi yürütmek için sonuçlar iki ayrı pencerede görüntülenecektir.
