Başlamak için, kültürlenmiş CAR ile dönüştürülmüş T hücrelerini, iki mililitre TGM içeren iki adet 12 oyuklu plakaya yerleştirin. Bir plakayı doğrudan 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit altında nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. Diğer plakayı, oksijen seviyesi %1'de önceden ayarlanmış mobil bir karbondioksit, oksijen nitrojen inkübatör odasına yerleştirin Her iki koşulda da her 24 saatte bir plakalardan 500.000 hücreyi 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine toplayın.
Tüpleri 500 G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücre peletine bir mililitre PBS'yi nazikçe pipetleyin. Peletlenmiş hücreleri 50 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
Daha sonra 50 mikrolitre bir ila 100 seyreltme fikoeritrin konjuge anti-bayrak antikoru ekleyin. İyice karıştırmak için süspansiyonu pipetleyin. İnkübasyondan sonra, her tüpe bir mililitre FACS tamponu ekleyin.
Karışık süspansiyonu 500 G'de beş dakika santrifüjleyin. Şimdi, süpernatanları her tüpten pipetleyin. Daha sonra hücreleri 200 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
Elde edilen hücre süspansiyonunu beş mililitre akış sitometri tüplerine aktarın. Yüzey kimerik antijen reseptör ekspresyonunu belirlemek için hücre süspansiyonu üzerinde akış sitometrisi yapın. Yeni tüpleri boş ve CAR olarak ayarlayın.
FSCA, FSCH, SSCA, SSCH, PE ve FITC kanalına tıklayın. Ardından, tek hücreleri, canlı hücreleri, GFP pozitif hücreleri ve PE pozitif hücreleri sırayla tanımlamak için dört dağılım grafiği oluşturun. 10.000 tek canlı hücre toplamak için parametreleri ayarlayın.
Veri al'ı tıklayın. Hücre toplama kararlı hale geldikten sonra, verileri kaydet'i tıklatın. Negatif kontrole göre kapıların yerini belirlemek için, fikoeritrin pozitifliğini ve medyan floresan yoğunluğunu ölçmek için EGFP ve fikoeritrin için pozitif hücreleri kapılayın.
İki hedefli CAR başına hipoksiye duyarlı, normoksik koşullara göre hipoksik koşullar altında önemli ölçüde yüksek CAR ekspresyonları gösterdi.
