Başlamak için, 200 mikrolitre FBSDMEM içeren iki düz tabanlı 96 oyuklu doku kültürü plakasının her bir oyuğuna 1000 hedef hücre tohumlayın. Ertesi gün, her bir kuyucuğun üstünden 100 mikrolitre süpernatanı dikkatlice pipetleyin. Kimerik antijen reseptörü T hücreleri veya transdüksiyonsuz T hücreleri 100 mikrolitre FBSDMEM içine farklı oranlarda ekleyin.
Bir plakayı %21 oksijen atmosferine, diğerini ise %1 oksijen atmosferi altında mobil bir karbondioksit oksijen nitrojen inkübatör odasına yerleştirin. 24 saatlik birlikte kültürlemeden sonra, tüm süpernatanı yeni bir U-tabanlı 96 oyuklu plakaya dikkatlice aktarmak için bir pipet kullanın. Sitokin tespiti için süpernatanı eksi 20 santigrat derecede saklayın.
Şimdi siyah düz tabanlı 96 kuyulu plakanın her deneysel kuyucuğuna 60 mikrolitre pasif lizis tamponu ekleyin. Verimli hücre lizizini sağlamak için plakaları 30 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin. Her deney kuyucuğuna 60 mikrolitre ateşböceği lusiferaz substratı ekleyin.
Lusiferaz aktivitesini hemen ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullanın. Son olarak, verilen denklem ile normalleştirilmiş sitotoksisite yüzdesini hesaplayın. Hipoksiye duyarlı HER2 hedefleme CAR, atmosferin hipoksik veya normoksik olup olmadığına bakılmaksızın hedef hücreleri etkili bir şekilde öldürebildi.
Buna karşılık, HER2-BBz-ODD CAR T hücreleri, tüm koşullar için normoksik koşullar altında önemli ölçüde daha zayıf sitotoksisite gösterdi.
