Respirometri sisteminin kalibrasyonundan sonra, her odadan MiR05'i taze 2.1 mililitre MiR05 çözeltisi ile değiştirin. Respirometri yazılımında cihaz ayarlarını girin. Dosya adını ve kaydetme ayarlarını yapın.
Sonraki iletişim kutusunda, her bir odaya eklenen her bir numunenin ağırlığı da dahil olmak üzere numune bilgilerini girin. Şimdi, oksijen kalibrasyon penceresini açın, dosyadan kopyala'ya tıklayın ve kaydedilen hava kalibrasyonunu seçin file. Ardından, kalibre et ve panoya kopyala düğmesine tıklayın.
İnce forseps kullanarak, daha önce fareden izole edilmiş kas lifi demetlerini dikkatlice solunum çözeltisine aktarın. Tıpaları hazneye yerleştirin ve hazneyi yarı kapatmak için yarıya kadar dibe doğru itin. Tıpalardaki O-ringler hazne duvarına geçtiğinde, kapatmak için aşağı iterken bir döndürme hareketi kullanın.
Hazne yarıya kadar kapatıldığında, haznenin üst kısmında küçük bir hava kabarcığı görülür. 10 mililitrelik plastik bir şırıngayı bir oksijen tankından saf oksijenle doldurun. Uzun, künt iğneyi şırınganın üzerine yerleştirin, ardından iğneyi ilk hazneye yerleştirin ve yavaşça yaklaşık bir mililitre oksijen verin.
Hazne oksijen konsantrasyonunu izleyin. Konsantrasyon mililitre başına 350 ila 400 nanomole ulaştığında, hazneyi tamamen kapatmak için aşağı iterken durdurucuyu hafifçe çevirin. Hazneyi gözlemleyin ve hava kabarcığı kalmadığından emin olun.
Yerleşim menüsünden oksijen akışı verilerini doku kütlesine göre normalleştirmek için, birim numune düzeni başına düzen 06 özgül akıyı seçin. Solunum ölçümüne başlamak için oksijen ilavesini takiben oksijen konsantrasyonunun ve oksijen akışının stabilize olduğundan emin olun. 10 mikrolitrelik bir cam şırınga kullanarak, her odaya 2,5 mikrolitre 0,8 molar malat ekleyin.
Zaman çizelgesini işaretlemek için F4 tuşuna basın ve işareti M.Record kararlı oksijen akısı ile bir ila iki dakika boyunca etiketleyin. Aerobik glikolitik için, her odaya 10 mikrolitre iki molar glutamat ve beş mikrolitre iki molar piruvat ekleyin. Zaman çizelgesini işaretlemek için F4 tuşuna basın ve işareti GP ile etiketleyin. Bir ila iki dakika boyunca kararlı oksijen akısı kaydedin.
Yağ asidi substratları için her odaya 10 mikrolitre 2 molar glutamat ve 10 mikrolitre 10 milimolar palmitoilkarnitin ekleyin. Zaman çizelgesini işaretlemek için F4 tuşuna basın ve işareti GPC ile etiketleyin. Bir ila iki dakika boyunca kararlı oksijen akısı kaydedin.
25 mikrolitrelik bir cam şırınga kullanarak, her odaya 20 mikrolitre 0.5 molar ADP ekleyin. Zaman çizelgesini işaretlemek için F4 tuşuna basın ve işareti ADP ile etiketleyin. Bir ila iki dakika boyunca kararlı oksijen akısı kaydedin.
Şimdi, her odaya 20 mikrolitre bir molar süksinat ekleyin. Zaman çizelgesini işaretlemek için F4 tuşuna basın ve işareti bir ila iki dakika boyunca S.Record kararlı oksijen akışı ile etiketleyin. 10 mikrolitrelik bir cam şırınga kullanarak, her odaya beş mikrolitre dört milimolar sitokrom c ekleyin.
Zaman çizelgesini işaretlemek için F4 tuşuna basın ve işareti sitokrom c ile etiketleyin. Bir ila iki dakika boyunca kararlı oksijen akısı kaydedin. 10 mikrolitrelik bir cam şırınga kullanarak bir milimolar FCCP'nin 3 bir mikrolitre bolusunda titre edin.
FCCP baskısı, oksijen akışı seviyelerinde kısa bir azalmaya neden olur. Kaydetmeden önce oksijen akışının artmasını ve stabilize olmasını bekleyin. Zaman çizelgesini işaretlemek için F4 tuşuna basın ve FCCP ile işaretlemeyi etiketleyin.
Bir ila iki dakika boyunca kararlı oksijen akısı kaydedin. Test tamamlandıktan sonra, çıkarmak için durdurucuyu hafifçe çevirin ve yukarı doğru çekin. Hazneyi üç kez ultra saf suyla durulayın, ardından üç kez% 70 etanol ile durulayın.
Direnç hissedilene kadar tıpaları haznelere yerleştirin, ancak tamamen kapatmayın. Ardından, tıpaları kapatın. Tahlil dosyasını kaydedin ve cihazın yazılımla bağlantısını kesin.
Son olarak, respirometreyi kapatın. Düzgün hazırlanmış fare örneklerinde, ADP sonrası sitokrom c ilavesi, dış mitokondriyal zarın bütünlüğünü doğrulayarak oksijen akışını etkilemedi. Bununla birlikte, doku örnekleri uygun şekilde hazırlanmadığında, ADP sonrası sitokrom c eklenmesi, oksijen akışında %40'lık bir artışa yol açtı ve bu da dış mitokondriyal zarda hasara işaret etti.
