Salmonella kültürlerini bakteri fajları ile enfekte etmek için, bir gece boyunca salmonella enterica kültürünü beş mililitre LB'lik bir son hacimde seyreltin ve buna 0.1 mililitre önceden hazırlanmış bakteri faj lizatı ekleyin. Daha sonra 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve 200 RPM'de inkübe edin. 50 mililitrelik bir konik santrifüj tüpünde, faj içeren bakteri kültürünü beş mililitre 0.22 mikron filtreli LB içinde 100 kez seyreltin. Süspansiyonu 2.377g'de 10 dakika santrifüjleyin.
Hücrelerin varlığından emin olmak için altta bir miktar hacim bırakarak süpernatanı dikkatlice boşaltın. Bakteri hücrelerini 10 mililitre 0.22 mikron filtrelenmiş LB ortamı ile yıkayın. Santrifüjlemeyi tekrarladıktan ve üç kez yıkadıktan sonra, peleti filtrelenmiş LB'nin beş mililitresinde yeniden süspanse edin. Elde edilen bakteri süspansiyonunun 50 mikrolitresini steril 0.45 mikronluk bir filtreden filtrelemek için bir vakum filtreleme sistemi kullanın.
Bakteri hücrelerinden faj salınımını kolaylaştırmak LB.To filtrelenmiş filtrenin 100 mililitresi ile filtreyi durulayın, sistemi sökmeden hücreleri içeren filtreyi inkübe edin. Filtreyi, daha önce gösterildiği gibi, vakumlu filtreleme sistemini kullanarak tekrar durulayın. Steril forseps kullanarak bakteri hücrelerini filtreden kurtarmak için filtreyi bir şişeye aktarın.
Ardından filtrenin üzerine iki mililitre 2x LB ekleyin ve hücreleri filtreden çıkarmak için birkaç kez pipetleyin. Bu süspansiyonun bir mililitresini 10.354g'de iki dakika santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri bir mililitre filtrelenmiş LB ortamı ile üç kez yıkayın.
Daha sonra hücreleri bir mililitre 2x LB içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra, ticari salmonella enterica lipopolisakkarit veya LPS'yi bir mililitre filtrelenmiş LB içinde 20 mikrolitre bakteri süspansiyonu ile karıştırın. Bakteri fajının yeniden enfeksiyonunu önlemek için karışımı 37 santigrat derecede iki saat boyunca 200 RPM'de çalkalayın. Bundan sonra, bir mililitre kültürü bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve süspansiyonu 10.354g'de iki dakika santrifüjleyin. Peletleri bir mililitre filtrelenmiş LB ortamı ile üç kez yıkayın.
Yıkadıktan sonra, peleti bir mililitre 2x LB içinde yeniden süspanse edin. Bu karışımın 20 mikrolitresini, mililitre ticari LPS başına 0.8 miligram içeren bir mililitre filtrelenmiş LB'ye ekleyin. Ve karışımı iki saat boyunca 37 santigrat derece ve 200 RPM'de inkübe edin. Daha sonra, bir mikrosantrifüj tüpünde bir mililitre kültürü 10.354g'de iki dakika santrifüjleme ile peletleyin.
Hücreleri filtrelenmiş LB ile üç kez yıkadıktan sonra, bir mililitre filtrelenmiş LB içinde yeniden süspanse edin. Bir vakum filtrasyon sistemi kullanarak, steril 0.45 mikronluk bir filtreden bir mililitre bakteri süspansiyonu geçirin ve filtreyi 100 mililitre filtrelenmiş LB kullanarak durulayın. Steril forseps kullanarak filtreyi bir şişeye aktarın. Filtrenin üzerine iki mililitre 2x LB ekleyin ve hücreleri filtreden ayırmak için birkaç kez pipetleyin. Filtrelenmiş LB ile üç kez yıkamadan önce bir mililitre hücreyi 10, 354g'de iki dakika santrifüjleyin. Toplanan hücreleri bir mililitre 2x içinde yeniden süspanse edin LB.To faj içermeyen inokulumu hazırlayın, bakteri süspansiyonundan 100 mikrolitre hücreyi, mililitre LPS başına 0.45 miligram içeren 900 mikrolitre LB'ye ekleyin.
200 RPM'de çalkalanarak 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Faj yeniden enfeksiyonunun olmadığını doğrulamak için bunu alikot olarak kullanın. Protokolün farklı aşamalarında titrasyonlar gerçekleştirilerek, tekrarlanan yıkama ve filtrelemenin kültürlerden bakteri fajlarını ortadan kaldırmak için yeterli olmadığı görülmüştür.
Bununla birlikte, ticari LPS ile bir inkübasyon adımı kullanılır kullanılmaz faj sayısı azaldı. Bakteri kültüründeki bakteri fajlarının tamamen uzaklaştırılması için çok önemli adım, ticari LPS ile ikinci inkübasyondu.
