Başlamak için, 100 milimetrelik bir Petri kabında 10 mililitre tam büyüme ortamında 6MCA205 fibrosarkom hücrelerinin gücüne 3 kez 10 plaka koyun. Hücreleri ultraviyole ışıkla ışınlayın ve ölmelerine izin vermek için en az altı saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. İn vitro farklılaşmış dendritik hücreleri veya DC'leri iki kez, 1100G'de tam bir büyüme ortamında dört dakika boyunca yıkayın.
Tripan mavi boya dışlama testini kullanarak kemik iliğinden türetilen boş DC'leri sayın. Işınlanmış kanser hücrelerini 1100G'de beş dakika santrifüjleyin. Boş DC'lerin ışınlanmış apoptotik hücrelerle ko-kültürünü, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 24 saat boyunca 12 oyuklu bir plakada ikiye bir oranında ayarlayın.
Ertesi gün, hücreleri 15 mililitrelik tüplerde 10 mililitre tam büyüme ortamında beş dakika boyunca 1100G'de iki kez yıkayın. Hücre yüzeyi boyama için, kemik iliğinden elde edilen DC'leri 20 mikrolitre soğuk FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve karanlıkta dört santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Hücreleri FACS tamponu ile yıkadıktan sonra, 30 dakika boyunca canlılıkla sabitlenebilir yakın kızılötesi boya içeren 100 mikrolitre PBS ekleyin.
Hücreleri FACS tamponunda yeniden süspanse etmeden önce PBS ile bir kez yıkayın. FSCA ve SSCA özelliklerine göre ilgilenilen hücreleri tanımlayın. Ardından, hücre çiftlerini ve kümelerini analizden çıkarmak için FSCA ve FSCH'yi çizin.
Ölü hücreleri temizlemek için 780 ila 60 nanometre emisyon bandı geçiş filtre alanı ve SSCA çizin. 575 ila 26 ve 530 ila 30 nanometre emisyon bandı geçiren filtreleri kullanarak, iki parametre yoğunluk grafiğinde CD11C işaretleyici ve PKH67 floresan hücre bağlayıcı için hücre pozitifliğini tespit edin. Saydıktan sonra, CD8 T hücrelerini, 37 santigrat derecede iki ila beş ila bir oranında apoptotik MCA5 hücrelerini ve 72 saat boyunca% 5 karbondioksiti alan kemik iliği türevi DC'lerle kültürleyin.
EdU'yu 10 mikromolar final konsantrasyonunda ko-kültür ortamına ekleyin ve 16 ila 20 saat inkübe edin. CD8 çapraz astarını beş dakika boyunca 1100G'de iki kez santrifüjleyin ve karanlıkta dört santigrat derecede 20 dakika boyunca soğuk FACS tamponunda yüzey işaretleyicileri için lekeleyin. Hücreleri FACS tamponunda iki kez yıkadıktan sonra, canlılık ile sabitlenebilir su boyası içeren 100 mikrolitre PBS'de 30 dakika boyunca tekrar süspanse edin.
Hücre süspansiyonlarını akış tüplerinde PBS'de üç mililitre% 1 BSA ile bir kez yıkayın. Hücre fiksasyonu için 15 dakika boyunca 100 mikrolitre% 4 paraformaldehit ekleyin. Hücreleri 100 mikrolitre saponin bazlı geçirgenlikte inkübe edin ve reaktifi 15 dakika boyunca yıkayın.
500 mikrolitre reaksiyon kokteyli ekleyin ve karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Yıkadıktan sonra, hücreleri 100 mikrolitre saponin bazlı geçirgenlik ve yıkama reaktifinde tekrar süspanse edin. FSEA ve SSEA özelliklerine göre ilgilenilen hücreleri tanımlayın.
Ardından, hücre çiftlerini ve kümelerini analizden çıkarmak için FSEA ve FSEH'yi çizin. Ölü hücreleri çıkarmak için 525 ila 50 nanometre emisyon bandı geçişli filtre alanı ve SSCA çizin. 530 ila 30 ve 575 ila 26 nanometre emisyon bandı geçiren filtre yoğunluğu grafiklerini kullanarak, CD8a ve CD3 için hücrelerin pozitifliğini tespit edin.
660 ila 620 nanometre bant geçiren emisyon filtresi kullanarak tek parametreli bir histogramda Alexa Fluor 647 EdU birleşimi için hücreleri analiz edin. CD11c pozitif dendritik hücreler, apoptotik MCA205 kanser hücrelerini 37 santigrat derecede etkili bir şekilde yuttu ve erken kanser bağışıklık döngüsü aşamalarında sıcaklığa bağlı fagositoz gösterdi. Fagositozdan sonra, dendritik hücreler azalmış PDL1 seviyeleri ile birlikte artmış CD86 ve MHC-II seviyeleri gösterdi.
CD8 pozitif T hücrelerinin klonal genişlemesi, olgun dendritik hücreler tarafından aktive edildikten sonra yaklaşık% 20 proliferasyon oranı ile belirgindi. Çip üzerinde tümör modelleri kullanılarak, bu T hücrelerinin kanser hücresi salınan alarminlere karşı kemotaktik tepkisi gözlendi.
