Kokültürden çapraz astarlanmış CD8'i geri kazandıktan sonra, 10 mililitre tam büyüme ortamında 10 dakika boyunca 1100 g'da santrifüjleyin. 100 mikrolitre ölü hücre çıkarma mikro boncuklarında 1 x 10'u toplam 7 hücrenin gücüne yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Ayırma kolonlarını manyetik ayırıcıya yerleştirin ve bunları bağlama tamponu ile durulayın.
Hücre süspansiyonlarını ayırma kolonlarına aktarın ve akışı toplayın. Sütunu yıkadıktan sonra, içinden geçen etiketlenmemiş hücreleri toplayın ve bunları daha önce toplanan akışla birleştirin. Santrifüjle zenginleştirilmiş canlı CD8, tam bir büyüme ortamında beş dakika boyunca 1100 g'da çapraz astarlanmıştır.
Sayımdan sonra, CD8 çapraz astarlı hücreleri, 12 oyuklu plakada ikiye bir oranında taze MCA205 hücreleri ile kültürleyin ve 72 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. CD8 efektörünü geri kazanmadan önce, altı saat boyunca kanser bağışıklık hücresi kokültürlerine monensin ve brefeldin ekleyin. Daha sonra CD8 efektörünü geri kazanın ve beş dakika boyunca 1100 g'da iki kez santrifüjleyin.
Soğuk FACS tamponunda hazırlanan üç farklı primer antikor karışımındaki hücreleri yeniden süspanse edin ve ışıktan koruyarak dört santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Mix C'den hücre damağına 100 mikrolitre fiksasyon solüsyonu ekleyin ve karanlıkta dört santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Hücreleri soğuk bir yıkama tamponunda yeniden süspanse edin ve dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.
Hücreleri FACS tamponunda iki kez yıkadıktan sonra, Vitality Fixable Aqua Dye içeren 100 mikrolitre PBS'yi 30 dakika boyunca hücre peletlerine ekleyin. FSCA ve SSCA özelliklerine göre ilgilenilen hücreleri tanımlayın. Ardından, hücre çiftlerini ve kümelerini analizden çıkarmak için FSCA ve FSCH'yi çizin.
660/20 ve 780/60 nanometre emisyon bant geçiren filtreleri kullanarak, iki parametreli yoğunluk grafiğinde CDAA ve CD3 için hücre pozitifliğini tespit edin, Ölü hücreleri çıkarmak için 525/50 nanometre emisyon bant geçiren filtre ve SSCA'yı çizin. Ayrıca, CD137 markörü için CD44, CD25 ve CD69 markörleri ve sırasıyla Mix A, B ve C için interferon gama pozitif ve granzim B için hücreleri analiz edin. Tümör öldürme tahlili için, kokültür ortamını gerçek zamanlı bir hücre ölümü miktar tayin boyası ile destekleyin.
Plakayı canlı hücre analiz sisteminde 37 santigrat dereceye kadar ısıttıktan sonra, 72 saate kadar her iki saatte bir veri taraması yapın. Hücreleri beş dakika boyunca 1000 g'da iki kez santrifüjleyin. Yüzey işaretleyicileri için hücreleri 20 mikrolitre soğuk FACS tamponu ile boyayın ve karanlıkta dört santigrat derecede 20 dakika inkübe edin.
Ardından, bir geçit stratejisi için hücreleri boyamak için canlılık boyası propidium iyodürü ekleyin. FSCA ve SSCA özelliklerine göre ilgilenilen hücreleri tanımlayın. Ardından, hücre çiftlerini ve kümelerini analizden çıkarmak için FSCA ve FSCH'yi çizin.
CD45 için negatif kanser hücrelerini tespit etmek için 450/50 nanometre emisyon bandı geçiş filtresi kullanın. Tek parametreli bir histogramda, 610/620 nanometre bant geçiren emisyon filtresi kullanarak, hücreleri propidyum iyodür dahil etme açısından ortalama floresan yoğunluğu olarak analiz edin. Çok parametreli akış sitometrisi sayesinde, erken aktivasyon belirteci CD69'un yüzey ekspresyon seviyeleri, geç aktivasyon belirteçleri CD44 ve CD25, CD137'nin membran ekspresyonu ve CD107, tümör reaktivite belirteçleri arttırıldı.
Hücre içi sitotoksik moleküllerin, granzim B'nin ve interferon gama pozitifinin seviyeleri kademeli ve önemli ölçüde artmış ve 72 saatlik kokültürde bir ekspresyon zirvesine ulaşmıştır. Aynı kökenli MCA205 hücreleri, önemli seviyelerde CD8 efektör aracılı ölüme maruz kaldı.
