Başlamak için, HUVEC'leri sekiz mililitre endotelyal büyüme ortamı içeren 10 mililitrelik bir Falcon tüpüne ekleyin. Tüpe iki mililitre METHOCEL stok çözeltisi ekleyin ve iyice çalkalayın. Daha sonra, karışımın 25 mikrolitresini büyük, kare bir Petri kabının ters çevrilmiş iç yüzeyine aktarın.
Kapağı yavaşça 180 derece döndürün ve bir hücre kültürü kabının dibine yerleştirin ve gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, 0.28 mililitre 10X Medium 199 içeren bir şişeye 2.3 mililitre sıçan kuyruğu kollajen Tip I ekleyin. Bu karışımı buz üzerinde tutun ve eşit şekilde sarı olana kadar karıştırın.
Karışımı turuncuya dönene kadar sodyum hidroksite karşı titre edin. Ardından, nihai ürüne 50 mikrolitre HEPES tamponu ekleyin. Asılı kültürlenmiş hücreleri 20 mililitre PBS ile 50 mililitrelik bir Falcon tüpüne toplayın, ardından santrifüjleyin.
Süpernatanı attıktan sonra, sferoid pelete 0.1 mililitre FBS ve 0.4 mililitre endotelyal bazal ortam ekleyin. Peleti yeniden süspanse etmek için tüpe hafifçe vurun. Şimdi, iki mililitre METHOCEL stok çözeltisini pipetleyin ve iyice karıştırın.
Daha sonra, hazırlanan kollajen karışımından iki mililitre yeniden süspanse edilmiş sferoidlere ekleyin. Elde edilen karışımın 0,5 mililitresini 24 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına dağıtın ve inkübe edin. Daha sonra, 100 mikrolitre seyreltilmiş rekombinant insan vasküler endotelyal büyüme faktörünü plakanın kuyucuklarına pipetleyin.
Hücre kültürünü 12 saat boyunca% 5 karbondioksit takviyesi altında 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, ters çevrilmiş bir mikroskopla, kuyu kenarıyla, birbirleriyle temas halinde olmayan veya hasar belirtileri gösteren sferoidlerin görüntülerini yakalayın. Sadece bazal besiyeri veya rekombinant insan vasküler endotelyal büyüme faktörü ile uyarılan sferoidler açıkça ayırt edilebilirdi.
Düşük kaliteli jellerdeki sferoidlerin yere düştüğü ve dağıldığı görüldü. Negatif kontrol, orta derecede bir başlangıç filizlenme oranı gösterirken, insan vasküler endotelyal büyüme faktörü nispi filizlenme uzunluğunu iki veya üç katına çıkardı. Filiz sayısı da benzer bir dinamik aralık gösterdi.
