İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücresi (HUVEC) Spheroidlerinin İn Vitro Anjiyogenezin Araştırılması için 3D Kollajen Matriksinde İmmünositokimyası

Başlamak için, filizlenmiş küresel HUVEC jellerini bir mililitre %4 paraformaldehit içinde bir saat boyunca sabitleyin. Jelleri bir mililitre PBS'de yaklaşık üç ila dört kez nazikçe yıkayın. Jelleri plakanın her bir oyuğunun yüzeyinden tamamen ayırın, ardından bunları yeni 24 oyuklu plakalara aktarın.

Kuyucuk plakasına bir mililitre bloke edici çözelti ekleyin, daha sonra oda sıcaklığında bir saat boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. İnkübasyondan sonra, inkübasyondan önce 500 mikrolitre birincil antikor solüsyonunu kuyucuklara pipetleyin. Ertesi gün, jelleri her biri beş dakikalık beş yıkama döngüsü boyunca PBS ile nazikçe yıkayın.

Bloke edici tamponda falloidin-FITC ile seyreltilmiş karşılık gelen ikincil antikorun 500 mikrolitresini ekleyin. Plakayı gece boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede inkübe edin. Jelleri PBS'de yıkadıktan sonra mikroskop lamlarına aktarın.

Bir kapak kızağı üzerine iki damla DAPI içeren montaj ortamı ekleyin ve her bir jelin üzerine yerleştirin. Kurutulmuş jelleri oje ile kapatın. Daha fazla analize kadar dört santigrat derecede saklamadan önce karanlıkta bırakın.