Başlamak için altı nematod büyüme ortamı veya NGM agar plakası hazırlayın. Ertesi gün, plakalara 200 mikrolitre Escherichia coli OP50 kültürü ekleyin ve bir gün oda sıcaklığında inkübe edin. İnkübasyondan sonra, dört NGM agar plakasına 200 mikrolitre 0.025 molar D-glikoz ekleyin ve oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
Farklı aşamalı üç ila dört parça Caenorhabditis elegans Bristol N2'yi bir bakım NGM agar plakasından E.coli OP50 ile oturtulmuş yeni bir NGM plakasına aktarın. C.elegans solucanlarını üç gün boyunca% 95'ten fazla nem ile 20 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Üç gün sonra, tabağa damıtılmış su ekleyin ve bir Pasteur pipeti kullanarak solucanları toplayın.
Toplanan solucanları 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve süpernatanı tüpten çıkarmadan önce yerçekimi ile çökelmelerine izin verin. Ardından, tüpe damıtılmış su ekleyin. Tüpün hacmi beş mililitreye düştüğünde, 10 mililitre ağartma solüsyonu ekleyin ve tüpü yaklaşık altı dakika kuvvetlice çalkalayın.
Daha sonra, tüpü M9 tamponu ile 50 mililitre kapasiteye kadar doldurun ve üç dakika boyunca 1400 g'da santrifüjleyin. Süpernatanı beş mililitreye kadar çıkarın ve tüpe 45 mililitre M9 tamponu ekleyin. Son yıkamadan sonra, süpernatanı 15 mililitre işaretine kadar çıkarın ve kalan sıvıyı bir tabağa aktarın.
Yumurtaların serbest kalması için plakayı mikroskop altında gözlemleyin ve plakayı 14 saat boyunca% 95'ten fazla nem ile 20 santigrat dereceye yerleştirin. Kuluçka işleminden sonra, solucanları 15 mililitrelik bir tüpe toplayın. Otomatik bir pipet kullanarak, bir mikroskop lamına 10 mikrolitre senkronize solucan ekleyin.
Solucan sayısını sayın ve mikrolitre başına 500 ila 1000 solucan elde etmek için gereken hacmi hesaplayın. 500 ila 1000 larva birinci aşama veya L1 senkronize solucanları NGM agar plakalarına aktarın. Daha önce E.coli OP50 ve glikoz ile hazırlanmış ve tohumlanmış.
Solucanlar larva aşaması dördüne veya L4'e ulaşana kadar plakayı 20 santigrat derecede inkübe edin. 48 saat sonra, plakaya M9 tamponu ekleyin ve bir Pasteur pipeti kullanarak L4 larvalarını toplayın. Toplanan larvaları 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Üç deney grubu için tahlil programını tasarlayın.
Her gruptan yaklaşık 100 mikrolitre solucan süspansiyonunu 400 mikrolitre% 5 Lugol İyot Çözeltisi içeren 1.5 mililitrelik mikrotüpe aktarın. Tüpü bir karıştırıcıda beş dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Tüpü karıştırıcıdan çıkardıktan sonra, solucanların yerçekimi ile tortulaşmasını bekleyin.
Solucanları bir mililitre M9 tamponu ile üç kez yıkayın. Solucanları 100 mikrolitre M9 tamponunda tekrar askıya aldıktan sonra. Slayta yaklaşık 50 mikrolitre aktarın.
Kapak fişini sürgünün üzerine yerleştirin. Ardından, stereo mikroskopta parlak alan modunu seçin ve solucanları gözlemleyin. Grup başına en az 10 solucan içeren görüntüleri jpeg dosyası olarak kaydedin.
Son olarak, solucanların iyot lekelenmesine dayalı olarak glikojen içeriğini hesaplayın. Glikojen içerik analizinin görsel gözlemleri, açlık solucanlarının E.coli OP50 ile beslenenlere ve en yoğun lekelenmeyi sergileyen E.coli OP50 ve D-glikozlu olanlara kıyasla daha zayıf bir leke gösterdiğini ortaya koydu.
