Crohn hastalığı hastadan türetilen kolonoidleri 48 oyuklu bir plakada genişlettikten sonra, kolonoid kubbeye zarar vermeden ortamı kuyu kenarından nazikçe çıkarın. Her oyuğa 10 mikromolar ROC1 ve iki inhibitör Y-27632 ile desteklenmiş 300 mikrolitre enzimatik ayrışma reaktifi ekleyin. Bir P1000 pipet ucu kullanarak, kolonoid kubbesini kırmak için kuyu yüzeyini kazıyın ve hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı pipetleyin.
Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Toplanan kolonoidleri 37 santigrat derece su banyosunda beş dakika inkübe edin. Kolonoidleri üç dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın, tüpte yaklaşık 1.2 mililitre bırakın.
Daha sonra P1000 pipetinin ucunu tüpün dibinin hemen üzerinde tutarak süspansiyonun içine yerleştirin ve kolonoidleri ayırmak için süspansiyonu ucun içine ve dışına hızla pipetleyin. Bütün kolonoidlerin kalmadığından emin olmak için tüpü mikroskop altında gözlemleyin. Ve kolonoid parçaları yaklaşık 30 ila 40 mikrometre boyutundadır.
Ardından, 15 mililitrelik tüpe 10 mililitre buz gibi organoid yıkama ortamı ekleyin. Tüpü üç dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti bir mililitre buz gibi soğuk organoid yıkama ortamında yeniden süspanse edin.
Süspansiyonu 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve bir kolonoid fragman tüpü olarak etiketleyin. Karıştırdıktan sonra, numunenin 50 mikrolitresini yeni bir tüpe aktarın ve bunu bir hücre sayım tüpü olarak etiketleyin. Tüpü üç dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
Süpernatanı çıkarın ve peleti 10 mikromolar Y-27632 ile desteklenmiş 500 mikrolitre enzimatik ayrışma reaktifi içinde yeniden süspanse edin. Tek hücre sayım tüpünü 37 santigrat derece su banyosunda beş dakika inkübe edin. 400 mikrolitreye ayarlanmış bir P1000 pipet kullanarak numuneyi hızlı bir şekilde pipetleyin.
Ardından, tek hücreli bir süspansiyon sağlamak için numuneyi mikroskop altında gözlemleyin. Tek hücre sayım tüpüne bir mililitre organoid yıkama ortamı ekleyin. Daha sonra süspansiyonu santrifüjleyin ve peleti 50 mikrolitre organoid yıkama ortamında yeniden süspanse etmeden önce süpernatanı çıkarın.
50 mikrolitre tripan mavisi ekleyin ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Buna dayanarak, kolonoid fragman tüpündeki hücrelerin konsantrasyonunu hesaplayın. Gerekli hacmi yeni bir 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünde santrifüjleyin.
Ardından süpernatanı çıkarın. Peletleri bazal membran ekstraktında veya BME'de yeniden süspanse edin. Şimdi önceden inkübe edilmiş 96 oyuklu bir mikrotitre plakasında, oyuk başına 10 mikrolitre kolonoid BME solüsyonunu ters pipetleyin ve düzensiz tohumlamayı önlemek için solüsyonu düzenli olarak dikkatlice karıştırın.
Plakayı ters çevirin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. 20 dakika sonra, kubbeleri 200 mikrolitre önceden ısıtılmış organoid proliferasyon ortamı ile kaplayın ve üç gün boyunca inkübasyona devam edin.
