Crohn hastalığı hastadan türetilen kolonoidleri üç gün boyunca inkübe ettikten sonra, plakayı eğin ve ortamı kuyucukların kenarından çıkarın. 2.5 mikromolar floresan hücre ölüm boyası içeren sitokin tedavi ortamının oyuğu başına 200 mikrolitre ekleyin. Gerekli tedavi süresi boyunca kolonoidleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, plakayı dijital olarak ters çevrilmiş bir epifloresan mikroskobu aşamasına aktarın ve maksimum toksisite koşulunun kolonoidlerin tamamen parçalandığını onaylayın. İletim kanalını kullanarak, SYTOX pozitif hücrelere sahip bir kolonoide odaklanın. Ardından, GFP kanalına geçin.
Arka planı en aza indirirken floresan sinyalini en üst düzeye çıkarmak için ışık yoğunluğunu ve pozlama süresini ayarlayın. Optimize edilmiş görüntü ayarlarını kullanarak, numunelerin fazla veya az pozlanmadığından emin olmak için boya yok ve maksimum toksisite koşullarını gözlemleyin. Kolonoid kubbeyi kaplayan sabit bir ızgara desenini takip eden görüş alanlarını seçerek rastgele örnekleme yaklaşımı kullanarak kolonoidlerin iletim ve GFP görüntülerini elde edin.
Görüntüleri taşınabilir ağ grafiği formatında kaydedin ve dışa aktarın. Görüntü veri kümesi dosyalarını ImageJ araç çubuğuna sürükleyip bırakın ve dosyaları birleştirmek için sırayla Görüntü, Yığınlar ve Yığınlanacak Görüntüler'e tıklayın. Ardından, Görüntü ve ardından Tür ve 8 bit'i tıklatarak görüntü yığınını 8 bitlik bir dosyaya dönüştürün.
Freehand Seçimleri aracını tıklatın ve iletim görüntüsünde ilgilenilen bölgeyi manuel olarak seçin. Ardından, görüntü yığını arasında karşılık gelen GFP kanalı görüntüsüne geçiş yapın. Araç çubuğundan Analiz Et ve Ölçümleri Ayarla'yı tıklayın.
Ölçüleri Ayarla iletişim penceresinde, Ortalama gri değerini işaretleyin ve diğer kutuları işaretlemeden bırakın. GFP görüntüsü seçiliyken, Analiz Et ve Ölç'e tıklayın. Veri kümesi analiz edildikten sonra, sonuçlar penceresindeki tüm verileri kopyalayın ve bir elektronik tabloya yapıştırın.
Her koşul için teknik çoğaltma ortalama gri değerlerinin ortalamasını hesaplayın. Tedavi edilmeyen durumun ortalamasını her tedavi durumundan çıkarın. Ardından, her bir tedavi koşulunu, maksimum toksisite koşulunun arka plan çıkarılan ortalamasına bölün.
Tedaviden sonra hücre canlılığını hesaplamak için normalleştirilmiş değerleri birden çıkarın. Verilen denklemi kullanarak, perturbagen etkileşim katsayısını hesaplayın. Sekiz saatlik kolonoidlerin iletim floresan kaplama görüntüleri, sadece interferon gama artı TNF alfa ile muamele edilmiş kolonoidlerin floresan sinyali için pozitif olduğunu gösterdi.
24 saatte, interferon gama artı TNF alfa ile tedavi edilen kolonoidler, kolonoid morfolojisinde net bir bozulma ile floresan sinyali için pozitif geniş bölgeler gösterdi. BSA kontrollü kolonoidler için sekiz saatlik hücre ölüm seviyeleri düşüktü ve TNF alfa ile tedavi edilen koşullarda hafif bir artış oldu. 24 saatte, interferon gama artı TNF alfa ile tedavi edilen kolonoidler en yüksek hücre ölüm seviyelerini gösterdi.
CPI değerleri sekiz saatte hafif sinerjiye ve 24 saatte önemli bir sinerjiye işaret etti. Bu, interferon gama ve TNF alfa arasında zamana bağlı sinerjik bir etkileşimi doğruladı.
