Başlamak için, sıkıca oturan bir kapağı olan bir cam tabak alın. Tabağa bir pamuk top yerleştirin. Bir davlumbaz altında, pamuğa üç ila beş mililitre etil eter ekleyin.
Çanağı hemen kapakla örtün. Drosophila'nın üçüncü instar larvalarını sinek şişelerinden almak için bir boya fırçası kullanın. Bir larvayı küçük, açık bir kaba aktarın.
Kabı etil eterli cam tabağa yerleştirin ve hemen tabağı sıkıca kapatın. Her 30 saniyede bir larvaların hareketliliğini kontrol etmek için bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Anestezi uygulanmış larvaları bir cam mikroskop lamı üzerine aktarın.
Larvaları bir damla böcek tuzlu suya batırın. Diseksiyon mikroskobu altında. Tuzlu suyun çoğunu bir kağıt mendille çıkarın.
Dev lif ablasyonu için larva dorsal tarafını yukarı veya TTMn ablasyonu için ventral tarafı yukarı gelecek şekilde konumlandırın. Sonra yavaşça bir cam kapak kaymayı larvaların üzerine indirin. Kapak fişinin yan tarafına tuzlu su ekleyin.
Cam sürgü ile kapak sürgüsü arasındaki boşluğu doldurmak için. Dev fiber ablasyonu için, diseksiyon mikroskobunda yüksek büyütme altında beynin konumunu kontrol edin. Beynin düz bir şekilde yattığından ve kütikülden görülebildiğinden emin olun.
Beyni kaplayan herhangi bir yağ dokusunu çıkarmak için, kapak kızağına hafif bir baskı uygulamak için forseps kullanın ve kapak kızağını bir yandan diğer yana hareket ettirin. Numuneyi çok fotonlu bir mikroskop aşamasına yerleştirin. Numuneyi epifloresan modunda bulmak için GFP filtresini kullanın.
Dev fiber ablasyonu için, ilgilenilen hücrelere odaklanın, ardından iki foton moduna geçin. Lazeri 870 nanometreye ayarlayın ve Galvano tarayıcı ile GFP eksprese eden hücreleri görüntülemek için dedektör kazancını ayarlayın, dairesel bir ilgi alanı kullanarak ablasyon alanını tanımlayın. Ardından, yazılımda ablasyon protokolünü kurmaya devam edin, bunu yapmak için sırayla bir edinim, stimülasyon ve ardından başka bir edinme çerçevesi ayarlayın.
Stimülasyon lazer gücünü daha düşük bir değerde başlatın ve stimülasyon protokolünü çalıştırın. Ablasyon başarılı olmadıysa ve sadece hücreyi ağarttıysa, lazer gücünü% 5'lik artışlarla veya ilmek sayısını birer birer artırın ve protokolü tekrar çalıştırın. Başarılı hücre ablasyonu görülene kadar bunu yapın.
Hücreyi başarılı bir şekilde kestikten sonra, kapak fişini çıkarın. Bir boya fırçası ile larvaları slayttan nazikçe alın, ardından larvaları bir gıda şişesine aktarın. Dev fiber ablasyon örneklerinde.
Ablasyon, beynin ablasyonlu tarafında GFP etiketli bir soma yokluğu ile doğrulandı. TTMn ablasyonlu larvalar için. Bir tarafta TTMn yokluğu, eksik soma ve dendritler nedeniyle kolayca tanındı.
