Başlamak için, taze insan atriyum örneğini steril HBSS içeren 100 milimetrelik bir cam plakada yıkayın. Kalan kanı çıkarmak için numuneleri plakada hafifçe sallayın. Numuneyi küçük bir hacimde HBSS ile ıslatılmış 100 milimetrelik bir plakaya aktarın.
Çapraz neşterlerle numuneyi iki milimetre büyüklüğünde küpler halinde doğrayın. Daha sonra, dört küçük miyokard parçasını 35 milimetrelik bir plakaya aktarın. Parçaların üzerine steril bir örtü camı yerleştirin ve hafif bir baskı uygulayın.
Plakaya 1,5 mililitre DMEM pipetleyin. Daha sonra kültür plakalarını% 5 karbondioksit takviyesi altında% 37 santigrat derecede inkübe edin. Kültürler% 85 birleşmeye ulaştığında, plakayı inkübatörden çıkarın ve kapak camını kaldırmak için steril forseps kullanın.
Ardından 35 milimetrelik yeni bir plakaya baş aşağı yerleştirin. Ardından durulamak için steril PBS ekleyin. Şimdi miyokard parçalarını çıkarın.
Ardından DMEM'i plakadan pipetleyin. Büyümüş hücreleri içeren plakayı durulamak için steril PBS kullanın. Durulamayı attıktan sonra, her plakaya bir mililitre% 0.25 tripsin EDTA ekleyin ve plakaları beş dakika boyunca% 5 karbondioksit ile% 37 santigrat derecede inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, plakaları inkübatörden çıkarın ve hücre ayrılmasını doğrulamak için bir mikroskop kullanın. Daha sonra, tripsinizasyonu engellemek için her plakaya iki mililitre tripsin durdurma çözeltisi veya TSS ekleyin. Hücre süspansiyonunu steril 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 400 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak aspire edin. Sonra pelete üç mililitre DMEM ekleyin ve tekrar süspanse edin.
Hücre süspansiyonunu 60 milimetrelik bir plakaya yerleştirin. Hücreleri 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksit takviyesi altında inkübe edin. Daha sonra, her 60 milimetrelik plakaya üç mililitre steril% 0.2 jelatin çözeltisi pipetleyin.
İnkübasyondan sonra, çözeltiyi aspire edin ve daha fazla kullanana kadar üç mililitre steril PBS ekleyin. Kardiyak fibroblast içeren plakayı inkübatörden çıkarın. DMEM'i plakadan çıkarın ve steril PBS ile durulayın.
Durulamayı attıktan sonra, her plakaya bir mililitre% 0.25 tripsin EDTA ekleyin. Hücre ayrılmasını doğrulamak için bir mikroskop kullanın. Ardından, her plakaya iki mililitre TSS ekleyin Tripsinizasyonu engellemek için.
Hücre süspansiyonunu steril 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 400 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak aspire edin.
Sonra pelete üç mililitre DMEM ekleyin ve tekrar süspanse edin. PBS'yi 60 milimetre jelatin kaplı plakadan çıkarın ve hücre süspansiyonunu plakaya yerleştirin. Fibroblastları 21 güne kadar bir birleşme durumunda kültürleyin.
21 günlük kültürden sonra, kültür ortamını aspire edin. Ardından plakaları üç mililitre PBS ile durulayın. PBS'yi aspire ettikten ve bir mililitre hücre giderme solüsyonu ekledikten sonra, plakayı ters çevrilmiş bir kontrast mikroskobu altında gözlemleyin.
İki dakika sonra, plakalardaki hücre giderme solüsyonunu seyreltmek için dört mililitre PBS'yi nazikçe pipetleyin. Seyreltilmiş çözeltiyi aspire edin. Ardından plakaları PBS ile nazikçe durulayın.
Son olarak, plakalara bir mililitre PBS ekleyin. Hücre dışı matris kaplı plakaları daha fazla kullanılana kadar dört santigrat derecede saklayın. Kültüre yerleştirilen küçük doğal miyokard parçalarından fibroblastların büyümesi üç ila beş gün içinde gözlendi.
Hücreden çıkarma, plaka yüzeyinde hücre dışı matris kaplaması ile sonuçlandı. İn vitro üretilen kardiyak hücre dışı matrisin bileşimi ve mimarisi, hücreden ayrılma nedeniyle korunmuştur.
