Ticari Oligonükleotidler Kullanan DNA Enzim Aktivitelerinin İncelenmesi için Üre-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE)

Başlamak için, %20 akrilamid, yedi molar üre ve 1X TBE çözeltisinden oluşan bir stok hazırlayın. Bir jel için, 10 mililitre akrilamid ve üre çözeltisini 100 mikrolitre% 10 amonyum persülfat ve üç mikrolitre tetrametiletilendiamin ile birleştirin ve bir jel tekeri içine atın. Jel katılaştıktan sonra, jeli harici ısıtma ile jel başına 10 miliamperde 30 dakika boyunca 1X TBE tamponunda önceden çalıştırın.

Bir Pasteur pipeti kullanarak, fazla üreyi gidermek için 1X TBE'yi jel kuyucuklarına akıtın. Her reaksiyondan 10 mikrolitre yükleyin ve 45 ila 55 santigrat derecede bir ila 1.5 saat çalıştırın. Jeli, seçilen florofor için doğru ayarlarla görselleştirin.

Son olarak, ImageJ kullanarak ürünün ve alt tabakanın bant yoğunluğunu ölçün ve formülü kullanarak ürünün yüzdesini hesaplayın. DNA ligaz aktivitesi, bir üre PAGE jeli üzerinde gözlenen oligonükleotid boyutunda 20 nükleotidden 40 nükleotidlere bir artışa yol açtı. Bakteriyel DNA ligaz, hem çentikli hem de uyumsuz DNA substratlarını bağladı ve magnezyum tercihi ile ligasyon aktivitesi için hem magnezyum hem de manganez kullanabilir.