Başlamak için, MSC'leri %1 penisilin ve streptomisin içeren insan MSC ortamı ile altı oyuklu bir plakada kültürleyin. Ardından, ARPE19 Mito-RFP hücrelerini sitoplazmik zarda hücre eser menekşe ile etiketlemeye devam edin. Bunu yapmak için, bir hücre eser menekşe reaktifi şişesine 20 mikrolitre dimetil sülfoksit ekleyin ve kullanmadan hemen önce iyice karıştırın.
ARPE19 Mito-RFP hücrelerini istenen %80 ila %90 yoğunluğa kadar büyütün Yükleme çözeltisini hazırlamak için, hücre eser menekşe stok çözeltisini önceden ısıtılmış DPBS'de seyreltin. Daha sonra kültür ortamını hücrelerden çıkarın ve bir mililitre yükleme çözeltisi ile değiştirin. Hücreleri 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.
Kuluçka işleminin sonunda, yükleme çözeltisini çıkarın. Hücreleri DPBS ile iki kez yıkadıktan sonra, iki mililitre taze, tam ortam ekleyin. Daha sonra, hücre iz menekşesinin asetat hidrolizine uğramasına izin vermek için hücreleri 37 santigrat derecede en az 10 dakika inkübe edin.
Daha sonra, her oyuğa 50 mikrolitre DPBS ekleyerek 24 oyuklu bir plaka hazırlayın. Kapak camını plakaya yerleştirin ve bir dakika dinlenmesine izin verin. Kapak sürgüsünün tabağın dibine yakın olduğundan emin olmak için negatif basınç kullanarak DPBS'yi kuyulardan çıkarın.
Hücre yoğunluğu% 80 ila 90'a ulaştığında, orijinal ortamı çıkarın ve hücreleri bir kez DPBS ile yıkayın, bir mililitre tripsin EDTA DPBS karışımı ekleyin ve 37 santigrat derecede üç ila dört dakika inkübe edin. Ardından, yapışan hücreleri ayırmak için altı kuyulu plakaya hafifçe vurun. Sindirimi sonlandırmak için bir mililitre taze, tam ortam ekleyin.
Daha sonra, tüm hücreleri bir pipet tabancasıyla nazikçe yeniden süspanse edin ve toplanan tüm hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Şimdi hücreleri beş dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri bir mililitre taze ortamda yeniden süspanse edin.
Sayım için bir sayma plakasına 10 mikrolitre hücre süspansiyonu yerleştirin. MSC'leri ve ARPE19 hücrelerini 24 oyuklu plakaya ekledikten sonra, hücreleri mikroskop altında gözlemleyin. Hücreler eşit şekilde dağılana kadar plakayı sallayın.
Onları 24 saat boyunca kültürde kuluçkaya yatırın. Dolaylı ko-kültür için, 24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 500 mikrolitre ortamda 10.000 ARPE19 hücresine bakın. Eki hücrelerin ekildiği kuyuya yerleştirin.
Oyuk başına üst hücre odasında 100 mikrolitre ortamda 10.000 mezenkimal kök hücre tohumlayın.
