Başlamak için, anestezi uygulanmış fareyi stereotaksik bir cihaza yerleştirin. Cerrahi makas kullanarak kafa derisinin orta hattı boyunca sürekli bir kesi yapın ve kafatası yüzeyini ortaya çıkarmak için kafa derisinin bir kısmını kesin. Mikro matkap ile belirtilen bölgede kraniyotomiyi yapın ve dört noktayı sınır olarak ayarlayın.
Beyin dokusu görünür hale geldiğinde delmeyi bırakın. Enjektörü 80 nanolitre virüs enjekte edecek şekilde ayarlamak için kontrol panelini kullanın. Virüsü saniyede 1 nanolitre akış hızında dentat girusa enjekte etmek için kontrol panelindeki Inject düğmesine tıklayın.
Beyin dokusunu emmek için, künt iğnenin ucunu beyin dokusunun üzerine yakın bir şekilde döndürün ve aspirasyonu kolaylaştırmak için hafifçe bastırın. Beynin net bir görünümünü korumak için emme sırasında soğuk tuzlu su ile sürekli durulayın. Aspirasyon derinliğini izlemek için doku özelliklerini yakından gözlemleyin.
Kortikal doku soluk pembe renktedir. Altındaki korpus kallozum beyaz fibröz doku olarak görünür. Ve hipokampal CA1 tabakası koyu kırmızı ve gridir.
Doku yüzeyi pürüzsüz hale geldiğinde ve geniş bir CA1 alanı açığa çıktığında emmeyi durdurun. Sırıtma merceğine takılı tutucuyu delinmiş deliğin üzerine getirin. Sırıtış merceği beyin dokusunun yüzeyine temas ettiğinde, Z eksenini sıfıra ayarlayın.
Sırıtış merceğini dorsal ventral eksen eksi 1.32 milimetre deliğe yerleştirin. Tutucunun 5 ila 10 dakika beklemesine izin verin. Ardından tutucuyu kaldırın ve deliği tuzlu suyla durulayın.
Bir iğne kullanarak, ultraviyole reçineyi sırıtış merceğinin etrafına uygulayın. Reçinenin katılaşmasını sağlamak için alanı 15 saniye boyunca ultraviyole ışıkla aydınlatın. Tutucuyu sırıtış merceğinden dikkatlice çıkarın.
Açıkta kalan tüm kafatasını ultraviyole reçine ile kaplayın. Kafa plakasını kafatasının üzerine uygun pozisyonda yerleştirin. Tüm kafatasını ve kafa plakasını 15 saniye boyunca ultraviyole ışıkla aydınlatın.
Açıkta kalan sırıtış merceğini 3D baskılı bir koruyucu kapakla kapatın. M1.6 vidaları kullanarak kapağı kafa plakasına sabitleyin. Miniscope kontrol yazılımını açın ve Yapılandırma Dosyası Seç'e tıklayın.
Ardından vscode'u ve ardından Kullanıcı Yapılandırma Dosyaları'nı seçin. Şimdi, Çalıştır'ı tıklayın. Ardından, parlaklığı ayarlamak için LED güç düğmesini kaydırın.
Değeri sıfıra yakın ayarlamak için odak ayarlama düğmesini kaydırın. Taban plakasını mini dürbüne takın ve iyi görüntüleme kalitesine sahip bir görüş alanı elde etmek için mini dürbünün konumunu yeniden ayarlayın. Protez taban malzemesinin ilk katmanını mini skop taban plakasının etrafına dikkatlice uygulayın.
Çimentonun ilk tabakası sertleştiğinde, taban plakasından kafa plakasına ikinci bir çimento tabakası uygulayın. Tüm protez taban malzemesi sertleştikten sonra, ayar vidasını gevşetin ve mini dürbünü taban plakasından ayırın. Açıkta kalan sırıtış merceğini korumak için taban plakası kapağını taban plakasına yerleştirin ve ayar vidasını sıkın.
Görüntülemeden sonra, görüntüleme verilerini AVI'den HDF5 formatına dönüştürün. Rijit olmayan hareket düzeltmesini uygulayın ve hareket düzeltmeli filmi altörnekleyin. Tek hücre sinyallerini tanımlamak için alt örnekleme verilerine özü uygulayın.
Ardından, hücre kontrolünü uygulayın ve olası hücreleri manuel olarak seçin. Hücre kontrol penceresini kapatmadan önce Verileri Kaydet'i tıklayın. Son olarak, veri dosyalarını kaydedin.
Başarısız in vivo kalsiyum görüntülemede, görüntüleme alanında aktif hücre gözlenmedi. Başarılı in vivo kalsiyum görüntüleme, belirgin kan damarları olmayan 10'dan az aktif hücre gösterdi. Görünür kan damarlarına sahip 50'den fazla aktif hücre.
Ve berrak kan damarlarına sahip yüzlerce aktif hücre. Başarılı bir in vivo kalsiyum görüntüleme kaydından çıkarılan tek tek hücreler, gösterilen temsili kalsiyum izleri ile görüş alanına bindirildi. GCaMP6F ifadesinin konumu ve sırıtış merceğinin izi fare beyin diliminde doğrulandı.
