Başlamak için, tohum, döngümüzün transfekte edilmiş HEK293 T hücrelerini Poli-D-Lizin kaplı 96 oyuklu bir plakaya böldü. Daha sonra, 1.7 mililitrelik bir Mikrofüj II'de üç taze Rhosin, Ehop-016 ve ZCL278 çözeltisi hazırlayın.1 ila 2.000 oranında seyreltilmiş renilla lusiferaz için canlı hücre substratı ekleyin, her çözeltiye 30 milimolar nihai konsantrasyona kadar. 0.55 ve 50 mikromolar ZCL278 çözeltileri yapmak için, kültür ortamında ilk 50 mikromolar ZCL278'i kullanarak seri seyreltmeler gerçekleştirin.
Daha sonra, transfekte edilmiş hücreler içeren 96 oyuklu plakanın her bir oyuğundan ortamı çıkarın. Her kuyucuğa 50 mikrolitre kimyasal ve substrat ortam karışımı ekleyin. Hücreleri bir saat, iki saat veya beş saat inkübe ettikten sonra, plakayı lüminesans plakası okuyucusuna yükleyin ve lüminesansı ölçün.
Başlamadan önce plaka okuyucunun açık olduğundan emin olun. Mikroplaka Okuyucu Yazılımına erişin ve yeni bir dosya oluşturmak için yeni oturuma tıklayın. Plaka okuyucunun sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlamak için inkübatöre tıklayın.
Sıcaklık seçeneğini kontrol edin ve 37 santigrat derece yazın. Plaka düzeni altında, bilinmeyen seçeneğini seçin ve ölçülecek kuyuları belirtmek için kuyuya tıklayın ve sürükleyin. Ardından protokole gidin, lüminesansı tıklayın ve varsayılan ayarları koruyun.
Kurulum tamamlandıktan sonra, plakayı kapağı kapalı olacak şekilde plaka okuyucuya yükleyin ve plakayı içeri sokmayı seçin. Başlat'a tıklayın ve bir dosya kaydetme penceresi görünecektir. Dosyayı yeniden adlandırın ve kaydet'i tıklayın.
Okuma tamamlandığında, plakayı plaka okuyucudan çıkarın ve ardından okuyucuyu tekrar takmak için çalıştırma plakasına tıklayın. Tamamlandığında, bir sonraki okumaya kadar plakayı nemlendirilmiş inkübatöre geri koyun. Tedavinin bir, iki ve beş saatinde, Rhosin ile tedavi edilen hücreler, kontrol DMSO ile tedavi edilen hücrelere kıyasla lusiferaz aktivitesinde önemli bir değişiklik göstermedi.
Rac GTPase İnhibitörü EHop-016, DMSO'dan önemli ölçüde daha düşük lusiferaz aktivitesi gösterdi. ZCL278 ile tedavi edilen hücreler, her üç zaman noktasında da kontrol DMSO'sundan önemli ölçüde daha düşük lusiferaz aktivitesine sahipti. Tedaviden bir, iki ve beş saat sonra ölçülen lusiferaz aktiviteleri doza bağlı bir yanıt gösterdi.
Daha yüksek ZCL278 konsantrasyonları, kontrol DMSO'suna kıyasla hala önemli değişiklikler gösterdi.
