Başlamak için, yeni hazırlanmış filtre sterilize edilmiş engelleme tamponunu, 10X reaksiyon tamponu bir ve ikisini bir çalışma platformuna yerleştirin. 2,5 mililitre bloke edici tampon ve beş mililitre ultra saf su içeren açık tüpleri bir kurutucuya yerleştirin ve vakum altında gazdan arındırın. 15 dakika sonra basıncı boşaltın ve tüpleri çıkarın.
Hazırlanan biotin-PEG akış hücresi düzeneğini bir mikroskop tablasına yerleştirin ve her iki ucunda yapışkan macun kullanarak sabitleyin. Akış hücresi çıkış borusunu iğne ile şırınga pompasına bağlayın. Objektif ısıtıcıyı 30 santigrat dereceye getirin.
Bir tüpte bir ila iki mililitre gazı alınmış suyu, akış hücresinin yakınındaki ayrı bir yapışkan macun parçasına sabitleyin. Giriş borusunu dibe ulaşana kadar boruya yerleştirin ve kanaldan su akıtın. Giriş borusunun yakınında sıkışan kabarcıkları çıkarmak için akış hızını artırın.
Mililitre streptavidin başına bir miligramlık 20 mikrolitrelik bir alikot'a 100 mikrolitre gazı alınmış bloke edici tampon ekleyin. Açık tüpü yapışkan macuna takın. Giriş borusunu sudan streptavidine aktarın ve akışı iki dakika boyunca dakikada 40 mikrolitre hızında başlatın.
Beş dakika sonra, fazla streptavidini bloke edici tamponla yıkayın. 25 nanomolar SYTOX Orange içeren bloke edici tamponda seyreltilmiş biyotinile DNA'daki akış. DNA'nın yüzeye gerçek zamanlı olarak bağlanmasını izlemek için 532 nanometre lazerle canlı görüntü kullanan görüntü.
Yüzeyde istenen DNA yoğunluğu elde edildiğinde, serbest DNA'yı yıkamak için 25 nanomolar SYTOX içeren bir bloke edici tampon içinde akıtın. Şimdi, akış ve biyotinile edilmiş anti-digoxigenin antikoru, 25 nanomolar SYTOX Orange içeren bloke edici tamponda seyreltilir. Biyotinile edilmiş anti-digoksigenin antikorunu ve SYTOX Orange'ı bloke edici tampon ile yıkayın.
50 mikrolitre ATP-gamma-S karışımını akış hücresine akıtın. 30 mikrolitre ATP-gama-S karışımında yaklaşık 100 nanomolar nihai konsantrasyona saflaştırılmış CMG helikaz ekleyin ve 20 mikrolitre için dakikada 20 mikrolitre hızla akıtın. 15 dakika inkübe edin.
Ardından, 80 mikrolitre için dakikada 40 mikrolitre ATP RPA karışımında akış yapın. Her lazeri 50 ila 100 milisaniye pozlama ile kullanarak, 488 nanometre lazerle EGFP RPA'yı görselleştirin ve elde edin, ardından 640 nanometre lazerle CMG elde edin. Son olarak, 532 nanometre lazerle SYTOX Orange lekeli DNA'yı görselleştirin ve elde edin.
DNA'nın CMG helikaz çözülmesi, zaman içinde izlenen sarı RPA'nın doğrusal büyümesi ile görselleştirildi ve çözülmemiş DNA ipliklerini gösterdi. Tek sarmallı DNA hasarı, verilerde daha az tam iz ile gösterildiği gibi, gözlemlenen başarılı çözme olaylarının sayısını azalttı.
