Başlamak için ana arabelleği hazırlayın. 0,22 mikrometre gözenek boyutunda bir filtre kullanarak filtreleyin ve tamponu 4 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, ana tamponu üç EDTA içermeyen proteaz inhibitör tableti, 2 milimolar ATP ve 0.1 milimolar DTT ile destekleyerek 75 mililitre ekstraksiyon tamponu hazırlayın.
Daha sonra miyozin VIIA eksprese eden donmuş bakteri hücresi peletine 75 mililitre ekstraksiyon tamponu ekleyin ve peleti çözülene kadar buz üzerinde ekstraksiyon tamponunda bırakın. Bundan sonra, çözülme işlemini hızlandırmak için peleti parçalamak için serolojik bir pipet kullanın. Şimdi, 5 saniye açık ve 5 saniye kapalı olan yarım inçlik bir uç kullanarak% 50 genlikte 10 dakika boyunca buz üzerinde yeniden süspansiyonu sonikleştirin.
Toplam lizatı 33.746 G'de 4 santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin. Santrifüjleme sırasında, 1,5 mililitre FLAG reçinesi hazırlamak için 3 mililitre %50 anti-FLAG afinite reçinesini 40 mililitre PBS ile yıkayın. Daha sonra reçineyi 800 G'de 4 santigrat derecede 2 dakika santrifüjleyin.
Reçineyi bozmadan PBS'yi dikkatlice çıkarın. Daha sonra, lizat santrifüjünden süpernatanı yıkanmış reçineye ekleyin ve 1 saat boyunca 4 santigrat derecede sürekli rotasyonla inkübe edin. Reçineyi 800 G'de 4 santigrat derecede 2 dakika santrifüjleyerek peletleyin.
Ve reçineyi rahatsız etmeden süpernatanı çıkarın. Daha sonra, reçineyi 40 mililitre ana tamponda tekrar süspanse edin ve 800 G'de 4 santigrat derecede 2 dakika santrifüjleyin. Reçineyi rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın.
Şimdi yıkanmış reçineyi iki polipropilen spin kolonuna aktarın. Her sütunu 2 mililitre ana tampon ile bir kez yıkayın. Ardından, ana tamponu çıkarmak için sütunu 1.400 G'de 4 santigrat derecede 2 dakika santrifüjleyin.
Bir elüsyon tamponu hazırlamak için, ana tampona mililitre başına 100 mikrogram FLAG peptid ekleyin. Her sütundaki paketlenmiş reçineye 300 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin. Reçinenin elüsyon tamponu tarafından tamamen nemlendirildiğinden emin olmak için pipetleme ile nazikçe karıştırın.
Daha sonra sütunları 1.400 G'de 4 santigrat derecede 2 dakika santrifüjleyin. Akışı temiz bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerinde tutun. Şimdi, nispi konsantrasyonlarını belirlemek için elüsyon fraksiyonları ile SDS-PAGE gerçekleştirin.
Jel çalışırken, verilen bileşim ile bir diyaliz tamponu hazırlayın. Sonra en konsantre fraksiyonları birleştirin. Numuneyi 10.000 moleküler ağırlıklı kesme diyaliz kasetine aktarın ve gece boyunca 4 santigrat derecede diyalize edin.
Ertesi gün, numuneyi diyaliz kasetinden dikkatlice boşaltın. PCR tüpü başına 15 mikrolitre ekleyin ve tüpleri hızlı dondurma için bir sıvı nitrojen kabına bırakın. Saflaştırılmış miyozin VIIA kompleksi, miyozin VIIA ağır zincirine karşılık gelen 200 kilo Dalton markörünün üzerinde bir bant ve RLC kalmodulin ve kalmodulin benzeri protein 4'ü temsil eden 22 ve 14 kilo Dalton markörleri arasında üç farklı bant gösteren SDS-PAGE ile doğrulandı.
