JoVE Journal

Biochemistry

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir.

Miyozin-7A'ya Özel Aktin Filamentinin Motilitesinin İn Vitro Kayma Testi Kullanılarak İncelenmesi

Transkript

Başlamak için, akış odasına 500 milimolar sodyum klorür motilite tamponunda bir oda hacmi saflaştırılmış insan miyozin-7a proteini ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Akış odasını, 150 milimolar sodyum klorür motilite tamponunda mililitre BSA başına bir miligramlık üç oda hacmi ile yıkayın. Bundan sonra, fazla sıvıyı emmek için çıkışta temiz bir mendil kullanarak sıvıyı çekin.

Daha sonra, akış odasından 150 milimolar sodyum klorür motilite tamponunda 10 nanomolar rodamin-falloidin etiketli F-aktin'in bir oda hacmini akıtın. Aktin filamentlerinin yüzeye bağlanmasını 100x objektifli bir floresan mikroskop altında izleyin. Görüş alanında yeterli sayıda filament varken, ancak üst üste binmeyi önleyecek kadar seyrek olan, izleme için optimum aktin filament yoğunluğunu sağlayın.

Daha sonra, bağlanmamış aktin filamentlerini ve fazla rodamin-falloidini çıkarmak için akış odasını üç oda hacmi 150 milimolar sodyum klorür motilite tamponu ile yıkayın. Hareketliliği başlatmak için, akış odasına son tamponun bir oda hacmini ekleyin. Ardından, rodamin-falloidin etiketli aktini görselleştirmek için 561 nanometre uyarma kullanarak görüntüleri bir floresan mikroskobunda kaydedin.

Slaytta istediğiniz aktin yoğunluğuna sahip bir alan bulun ve 30 dakika boyunca her 30 saniyede bir görüntü yakalayın. Ardından, Fast programını GitHub deposundan indirin ve yükleyin. ND2 dosya dönüştürme için ek bir modüle sahip Python 3 uyumlu sürüm olduğundan emin olun.

Yalnızca düzgün hareket eden filamentleri korumak için 33 tolerans değerini kullanarak Hızlı programını çalıştırın. Ardından, yeni oluşturulan TIFF görüntülerini analiz etmek için Hızlı programını kullanın. En uzun filament uzunluğunu ve maksimum filament hızını temsil etmek için x maksimum değerini 20.000 nanometre ve y maksimum değerini saniyede 20 nanometre olarak ayarlayın.

Ardından, alınan görüntünün piksel boyutunu 65 nanometre olarak ayarlamak için px kullanın. Filamentin analize dahil edilmesi için gereken minimum hız olarak minV'yi saniyede 0,1 nanometre olarak ayarlayın. Filamentlerin bağlanması için çerçeveler arasında izin verilen maksimum mesafeyi ayarlamak için, çerçeveler arasında ayrı filamentlerin bağlanmasını önleyerek maxD'yi kullanın.

Yalnızca düzgün hareketlere sahip filamentler dahil olmak üzere filament hızlarındaki dalgalanmalara karşı toleransı ayarlamak için pt kullanın. Son olarak, analiz için TIFF yığınlarını içeren klasörü belirtmek için d'yi kullanın. Aktin filament kayma testi, miyozin-7a'nın yavaş hareketliliğini gösterdi ve hareketi görselleştirmek için video oynatma 500 kez hızlandırıldı.

Miyozin-7a'nın hız dağılımı, saniyede beş nanometrenin altında bir tepe gösterdi ve yavaş hareketliliğini doğruladı.

Sitemizdeki deneyiminizi iyileştirmek için çerezleri kullanıyoruz

Sitemizi kullanmaya devam ederek ya da "Devam et" butonuna tıklayarak, çerezleri kabul edebilirsiniz.