Mitokondriyi izole etmek için, anestezi uygulanmış kafası kesilmiş fareyi buz üzerinde yüzüstü pozisyonda yerleştirin. Kalbi açığa çıkardıktan sonra, aortu aort kökünün yaklaşık dört ila altı milimetre yukarısından ve karotis dallanma noktalarının altından kesin. Aortu kanül edin ve koroner arterler kandan temizlenene ve organ beyazlamış görünene kadar yerçekimine bağlı bir basınç başlığı kullanarak kalbi buz gibi soğuk kardiyopleji solüsyonu ile perfüze edin.
Ventriküler miyokardı izole etmek için kulakçık, kıkırdak kapak dokusu ve yağ dokularını inceleyin. Parçalar yaklaşık bir milimetreküp olana kadar dokuyu keskin cerrahi makasla kıyın. Kıyılmış dokuyu, proteaz çözeltisini içeren bir ve iki döndürme etiketli önceden soğutulmuş santrifüj tüpüne aktarın.
25 mililitrelik son hacme buz gibi soğuk izolasyon tamponu ekleyin. Motorlu bir el rotorlu stator homojenizatörü kullanarak, dokuyu 18.000 RPM'de 20 ila 25 saniye boyunca buz üzerinde dağıtın. Homojenize dokuyu 8.000 G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.
Süpernatanı atın. Ve artık proteazı çıkarmak için peleti beş mililitre izolasyon tamponu ile nazikçe durulayın. Durulamayı attıktan sonra, 25 mililitrelik son hacme buz gibi soğuk izolasyon tamponu ekleyin.
Ardından peleti yeniden askıya almak için girdap. Doku homojenatını 800 G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Mitokondri içeren süpernatanı, önceden soğutulmuş etiketli 50 mililitrelik bir tüpe yavaşça dökün.
Şimdi süpernatanı 8.000 G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve pelet içeren mitokondriyi koruyun. Tüy bırakmayan bir mendil kullanarak, peleti bozmadan tüpün iç duvarındaki fazla süpernatanı emdirin ve tüpü buzun üzerine yerleştirin.
Tüpün dibine 80 mikrolitre buz gibi soğuk izolasyon tamponu ekleyin ve bir mikro pipet kullanarak mitokondriyi nazikçe yeniden süspanse edin. Yeniden askıya alındıktan sonra, mitokondriyi önceden soğutulmuş etiketli bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Bizon kinetik asit protein tahlilini kullanarak mitokondriyal protein konsantrasyonunu belirleyin.
Önceden soğutulmuş bir mikro santrifüj tüpünde, mitokondriyal stoğu bir izolasyon tamponu ile istenen çalışma konsantrasyonuna seyreltin. Mitokondriyal izolatların canlılığını ve kalitesini test etmek için, Oksigraf odalarına 2,3 mililitre solunum tamponu yükleyin. Oksijen tüketimi sinyalinin 37 santigrat derecede yaklaşık 10 dakika veya oran sıfıra yakın olana kadar dengelenmesine izin verin.
Dengeleme üzerine, tıpaları aşağı doğru itin ve fazla tamponu aspire edin. 10 mikrolitrelik bir Hamilton şırınga kullanarak, Oxygraph üzerindeki solunum tamponunda kalan kalsiyumu şelatlamak için bir milimolar EGTA ekleyin. Solunumu hızlandırmak için, tampona beş milimolar sodyum piruvat ve bir milimolar al-malat ekleyin.
Sonra bir bolus seyreltilmiş mitokondri ekleyin ve solunumun beş dakika boyunca gerçekleşmesine izin verin. Beş dakika işaretinde, üçüncü durum solunumunu başlatmak için 500 mikromolar ADP'lik bir bolus ekleyin. Solunum kontrol oranını hesaplamak için, üçüncü durum sırasındaki maksimum oksijen tüketimi oranını, ikinci durumda ADP'nin eklenmesinden hemen önceki oksijen tüketimi oranına bölün.
ADP ilavesinden hemen sonra oksijen tüketiminde hızlı bir artış gözlendi, bu da izole kardiyak mitokondride oksidatif fosforilasyonun başarılı bir şekilde başladığını gösteriyor. Gine domuzlarından, Sprague-Dawley sıçanlarından ve Friend lösemi virüsü B farelerinden elde edilen kalp mitokondrileri, iyi mitokondriyal izolasyon kalitesini gösteren yüksek solunum kontrol oranları göstermiştir. Sprague-Dawley Sıçanlarından elde edilen karaciğer ve böbrek mitokondrileri de başarılı izolasyonu destekleyen kabul edilebilir solunum kontrol oranları sergiledi.
HEK293 hücreleri, kabul edilebilir eşiğin üzerinde solunum kontrol oranı değerleri sergiledi ve bu hücrelerden mitokondriyal izolasyonun kalitesini doğruladı.
