Başlamak için, kadere özgü beyin organoidlerini kullanarak virüs etiketli assembloidler oluşturun. MEA yüzey ön işlemi için reaktifler hazırlamak için, 0.5 gram deterjan enzim tozunu 50 mililitre deiyonize suda çözün. Toz tamamen eriyene kadar karışımı iyice vorteksleyin ve biyogüvenlik kabini içinde steril bir tüp üstü vakum filtresi kullanarak çözeltiyi sterilize edin.
% 0.07'lik bir PEI çözeltisi hazırlamak için 500 mikrolitre% 7 polietilenimin veya PEI stok çözeltisini 49.5 mililitre 1X borat tamponu ile seyreltin. Çözeltiyi sterilize etmek için, biyogüvenlik kabininin içindeki 0,22 mikrometrelik bir filtre ünitesinden süzün. Daha sonra, steril bir MEA plakasının her bir oyuğuna% 1 deterjan enzim çözeltisinin bir mililitresini dağıtın ve iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Daha sonra deterjan enzim çözeltisini her bir kuyucuktan çıkarın ve kuyucukları kuyu başına 1,5 mililitre steril deiyonize su ile beş kez yıkayın. Ön koşullandırma için her kuyucuğu bir mililitre kültür ortamı ile doldurun. MEA plakalarını iki gün boyunca 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit inkübatörüne geri yerleştirin.
İnkübasyondan sonra, kültür ortamını kuyucuklardan çıkarın ve birincil kaplama için MEA elektrotlarını kaplamak için 50 mikrolitre% 0.07 PEI çözeltisi ekleyin. Plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra PEI çözeltisini her bir kuyucuktan tamamen aspire edin.
Her kuyuyu bir mililitre steril deiyonize su ile üç kez yıkayın. Suyu aspire ettikten sonra plakaları oda sıcaklığında kapağı açık olarak biyogüvenlik kabininde 15 dakika kurutunuz. Şimdi her bir oyuktaki elektrot alanını, ikincil kaplama için kültür ortamında seyreltilmiş 50 mikrolitre bir ila 20 hacim bazal membran matrisi ile örtün.
MEA plakalarını gece boyunca 37 santigrat derece inkübatöre geri yerleştirin. Ertesi gün, seyreltilmiş matris çözeltisini aspire edin ve yüzeyde ince bir tabaka bırakın. Kalın bir tabaka oluşursa, elektrot temas alanına bir P1000 pipet ucu kullanarak kültür ortamı ile kuvvetlice püskürtün.
Daha sonra geniş kesimli bir P1000 ucu kullanarak, çanaktan bir asambleid toplayın ve mümkün olduğunca az medya aktarırken bir kuyucuktaki elektrotların üzerine dikkatlice yerleştirin. Plakayı bir diseksiyon mikroskobu altında laminer akış başlığına yerleştirin ve steril bir P 20 ucu kullanarak, montajı dikkatlice istenen yere itin. Asambloid etrafındaki fazla sıvıyı çıkarmak için bir P 20 ucu kullanın.
İnkübasyondan sonra, plakayı inkübatörden çıkarın. Daha sonra bir diseksiyon mikroskobu altında gözlemleyerek, asambloidlerin üzerine kültür ortamında seyreltilmiş bir ila 50 bazal membran matrisinden iki ila üç küçük damla uygulayın ve plakayı 30 dakika daha inkübatöre geri koyun. Daha sonra, bir diseksiyon mikroskobu kullanarak assembloidlerin yakınına dikkatlice üç damla kültür ortamı ekleyin.
Ertesi gün, asembloidlerin diseksiyon mikroskobu altında yerleşip yerleşmediğini ve stabilize olup olmadığını kontrol edin. Toplam hacmi oyuk başına bir mililitreye getirmek için 750 mikrolitre kültür ortamı ekleyin ve plakayı inkübatörde en az iki gün boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Her hafta, her oyuktan 500 mikrolitre kültür ortamını dikkatlice çıkarın ve her oyuğa taze 700 mikrolitre nörofizyolojik bazal ortam ekleyin.
92. günde, muhtemelen nöron olgunlaşması nedeniyle 78. güne kıyasla artan ağ patlaması süresi gözlendi. Hücresel ve ağ aktivitesi 125. günde yavaş yavaş azaldı.
