Pluripotent kök hücreleri veya PSC'leri altı oyuklu kültür plakalarında tutun ve hücre yoğunluğunu mikroskop altında doğrulayın. Kardiyomiyosit veya CM farklılaşması için, PSC'leri bir PSC hazırlama ortamında 96 oyuklu bir kültür plakasına tohumlayın. Kardiyak farklılaşmanın birinci aşamasında, PSC'ler %80 ila 90 birleşmeye ulaştığında, ortamı iki ila 20 mikromolar CHIR ile CM farklılaşma ortamına geçirin.
24 ila 48 saatlik CHIR tedavisinden sonra, ortamı yeni bir CM farklılaşma ortamıyla değiştirin. İkinci aşamada veya üçüncü günde, besiyerini beşinci güne kadar kültürde beş mikromolar IWR1 ile desteklenmiş CM farklılaşma ortamı ile değiştirin. Daha sonra ortamı CM farklılaşma ortamına değiştirin ve PSC'lerin kardiyak progenitör hücrelere veya CPC'ye farklılaştığı altı ila yedi güne kadar tutun.
10. günde veya 12. günde, hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS'de% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Boyama sırasında, hücrelere oda sıcaklığında 30 dakika boyunca geçirgen bir çözelti uygulayın. Numuneyi gece boyunca dört santigrat derecede CTNT birincil antikoru ile inkübe edin.
Daha sonra numuneyi, 37 santigrat derecede bir saat boyunca% 1 sığır serum albümini içeren PBS'deki ikincil antikorlarla tedavi edin. İkincil antikoru hücrelerden çıkardıktan sonra, çekirdekleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca Hoechst ile boyayın. Ardından, kurumayı önlemek için oyuk başına 100 mikrolitre PBS eklemeden önce hücreleri PBS kullanarak üç kez durulayın.
Canlı hücre kültürünü destekleyen otomatik bir mikroskop kullanarak farklılaşmanın farklı aşamalarının parlak alan ve CTNT immünofloresan görüntülerini toplamak için yazılımı açın ve yeni bir deneysel tasarım oluşturun. Görüntüleme için 5X'lik bir hedef ve 2X2'lik bir karışım seçin. Kanallar menüsünde, parlak alan için TL parlak alan kanalı ve immünofloresan görüntüleme için AF 488 ve H 33 42 kanalları ekleyin.
Görüntüleme kurulumunda ışık yolunu değiştirin. Z yığını menüsünde, tarama sırasında dilim sayısını ve aralıkları ayarlayın. Gezinme ve döşemeler penceresinde, döşeme bölgelerini taşıyıcıya göre ayarlayın ve 25 döşemeyi bir kuyu için beş sütuna beş sütuna ayarlayın.
Görüntü almak için önce hücre kültürü plakasını numune tepsisine koyun ve tepsiyi mikroskobun içine yükleyin. Numune canlı hücrelerden oluşuyorsa, kültür için uygun koşulları 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte tutmak için ısıtma sistemini ve karbondioksit pompasını açın. Önceden ayarlanmış deneysel projeyi açın.
Döşemeler menüsünü açın ve plakanın konumunu manuel olarak kalibre edin. Gezinme ve döşemeler penceresinde, gereken kuyuları seçin ve bu kuyular için döşeme bölgeleri oluşturmak için oluştur'a tıklayın. Döşemeler menüsündeki döşeme bölgelerini doğrula'ya tıklayın ve tüm kuyuları doğrulamak için otomatik odaklamayı çalıştırın.
Ardından her bir kuyucuğun odağını manuel olarak düzeltin. Denemeyi başlat düğmesine tıklayın ve otomatik görüntülemeyi bekleyin. Tipik olarak, 96 oyuklu bir kültür plakasının tamamını taramak yaklaşık 1.2 saat sürer.
İşleme çerçevesinde, görüntü dışa aktarmayı seçin, sıkıştırılmamış TIFF formatının dosya türünü veya PNG formatını seçin ve uygulayın.
