Başlamak için, donmuş, ısı stresli ve işlenmemiş beş günlük Columbia-0 Arabidopsis fidelerini sıvı nitrojen kabına toplayın. Fideleri bir homojenizatör kullanarak bir dakika toz haline getirin. Daha sonra tüpe 500 mikrolitre polizom ekstraksiyon tamponu ekleyin.
Numuneyi karıştırmak için tüpü ters çevirin ve girdaplayın. Ekstraksiyon çözeltisini 12.000G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, berrak, partikül içermeyen bir ekstraksiyon çözeltisi elde etmek için süpernatanı 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün.
Filtrelenmiş süpernatanı önceden hazırlanmış sükroz gradyanına yükleyin ve dengeye ulaşana kadar bekleyin. Ardından, maksimum hızlanma ve yavaşlama oranlarıyla dört santigrat derecede 3,5 saat boyunca 210.000G'de sallanan bir kova rotoru kullanarak gradyanı ultrasantrifüjleyin. Polizomal olmayan ve polisomal RNA, karşılık gelen sükroz gradyan çözeltisindeki yoğunluklarına göre ayrılır.
%70 sakaroz, %10gliserol ve %0.02 bromofenol mavisinden oluşan mikro hacimli şırınga pompası için kovalama solüsyonunu hazırlayın. Solüsyonu 30 ila 40 dakika boyunca iyice karıştırın. Takip eden çözeltiyi gradyana enjekte ettikten sonra, yazılımı kullanarak yoğunluk gradyan fraksiyonlayıcısını kontrol edin.
Ardından makineyi deiyonize su ile kalibre edin. Ultrasantrifüjlemeden sonra, tüpü yoğunluk gradyan fraksiyonatörüne yerleştirin. Tüp delme sistemini kullanarak, tüpü şırınga pompasına ve ultraviyole dedektörüne bağlayın.
Yoğunluk gradyan fraksiyonlayıcısını uzaktan yazılım kontrol moduna geçirin. Mikro hacimli şırınga pompasının enjeksiyon akış hızını dakikada üç mililitreye ayarlayın. Fraksiyonlayıcıyı kullanarak 254 nanometrede optik yoğunluğu ölçerek polizom profil grafiğini elde etme işlemini başlatın.
Polizom profil ölçümlerine dayanarak, polisomal olmayan ve polisomal RNA fraksiyonlarını ayrı ayrı toplayın. Toplanan RNA fraksiyonlarını önceden soğuk iki kez yüksek tuzlu çözelti ile iyice karıştırın. Daha sonra kitten sekiz mikrolitre seyreltilmiş ökaryotik poli-A RNA kontrolü stoğu ekleyin.
Yüksek tuzlu çözelti karışık RNA'yı, dört santigrat derecede beş saat boyunca 450.000G'de sallanan bir kova rotoru ile santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice dökün ve RNA peletini 500 mikrolitre önceden soğuk DEPC ile arıtılmış su ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, RNA örneğine 500 mikrolitre RNA ekstraksiyon reaktifi ekleyin.
Karıştırın ve 10 dakika inkübe edin. 100 mikrolitre kloroform ekleyin ve iyice karıştırın. Faz ayrılmasına izin vermek için 10 dakika inkübe edin.
Karışımı 12.000G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. RNA içeren üst berrak sulu tabakayı yeni bir tüpe aktarın ve eşit hacimde izopropanol ile hafifçe karıştırın. RNA'yı çökeltmek için karışımı eksi 20 santigrat derecede iki saat inkübe edin.
Çökeltmeden sonra tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı atın, RNA peletini altta bırakın. RNA peletini bir mililitre önceden soğuk %75 etanol ile yıkayın. Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 12.000G'de santrifüjleyin ve RNA peletini havayla kurutun.
Kuruduktan sonra, peleti 30 mikrolitre DEPC ile arıtılmış suda tekrar süspanse edin. RNA konsantrasyonunu, 220 ila 750 nanometrede tam spektrumlu bir spektrofotometre kullanarak, 260'ta optik yoğunluğa odaklanarak ölçün. Polizom profili, normal koşullar altında polizomal olmayan ve polizomal fraksiyonlar arasında belirgin bir ayrım gösterdi.
40 santigrat derecedeki ısı stresi, polisomal fraksiyonun sinyal yoğunluğunu önemli ölçüde azalttı ve bu etki, 22 santigrat derecede iki saatlik bir iyileşmeden sonra tersine çevrildi ve sinyali kontrol seviyelerine geri getirdi. RNA ekstraksiyon sonuçları, ısı stresinin polisomal fraksiyondaki RNA yüzdesini azalttığını ve bunun 22 santigrat derecede geri kazanımdan sonra restore edildiğini gösterdi.
