Biz pCAG-mCherry inşa sağlamak için Dr Takahiko Matsuda teşekkür ederim. YCM Schweppe Vakfı&#39;ndan bir Kariyer Geliştirme Ödülü ve Whitehall Foundation&#39;ın tarafından desteklenmektedir.

1. (Değil video) Hazırlık Tedarik <ol><li> 1X PBS içinde Penisilin / Streptomisin (Kalem / Strep) taze bir 1X seyreltme hazırlayın. En fazla 50 ml gereklidir. 0.22 um bir şırınga filtresi ile filtreleme. </li><li> Istenilen plazmid yapıları birleştirerek enjeksiyon yapıları hazırlayın. Biz, ~ 10 ul&#39;lik bir son hacim için uygun olan stokiyometri pCAG-bayrak vektör içinde hepsi yapıları koydu. Ayrıca, pCAG-GFP 14 ya pCAG-mCherry izleme elektroporasyon verimliliği ve electroporated hücreleri için ilave edilmelidir. Bu deney için pCAG-mCherry kullanın. Son olarak, embriyonik chick midbrains içine enjeksiyon verim görselleştirme% 0.05 nihai bir konsantrasyon plazmid DNA karışımı içine 0,22 um-süzüldü Fast Green boya ekleyin. </li></ol> 2. Yumurta Hazırlama (video) <ol><li> HH aşaması 11 embriyo elde etmek için, yumurta 100 inkübe edilmesi gerekir ° F (37.8 ° C)% 25-40 nem ile döllenme sonra yaklaşık 41 saat boyunca. Yerve onların tarafında yumurta bir kalemle çizgi ile her üst işaretleyin. Bir önceden ısıtılmış, nemlendirilmiş inkübatörde tepsiler yerleştirin. Yavaşça için inkübatör platformları dönüm işlevini ayarlayarak yumurta sallayın &quot;Otomatik&quot;. Nem ve su seviyesi her 24 saatte bir kontrol edin. </li><li> Sağ deney başlamadan önce, kuluçka yumurta çıkarıp oda sıcaklığında bekletin. Bu gelişme yavaşlatmak ve kalkınma üzerinde önlemek için yardımcı olacaktır. </li><li> % 70 etanol ile her yumurta yüzeyi temizleyin ve bir Kimwipe ile silin. </li><li> Seloteyip iki adet 4 cm al ve kalemle çizgi üzerinde büyük bir dikdörtgen yapmak için yumurta bunları yan yana sopa. Yumurta karşı bant Pürüzsüz. Penceresi yapılacaktır yerdir. Bant pencere açık kesildiğinde kapalı düşmesini kabuğu küçük parçalar önleyecektir. </li><li> 10 ml şırınga ve 18 ½ yumurta albümin üzerinden 5 ml çizmek için iğne kullanın. Rahatsız etmek gibi kabuğu delip sonra sarısı uzak iğne açıalbümin çıkarırken ya da embriyo zarar verebilir. Yumurtalar arasındaki% 70 etanol ile iğne temizleyin, ancak iğne sonraki yumurtaya delerek önce kuru olduğundan emin olun. </li></ol> 3. Cam Enjeksiyon İğnesi Hazırlama (video) <ol><li> Enjeksiyon iğne aşağıdaki ayarları kullanarak yapılan bir Kahverengi Mikropipet Çektirme (Sutter Enstrüman Model P-97) / Flaming: Isı 670, Pull 120, Vel 40, Zaman 165. Dünya Precision Instruments (API) 4 inç 1.0 mm cam kılcal ince duvarlı (API TW100F-4) iğneler hale getirmek için kullanılır. </li><li> Bir P10 pipet ve uzun ucu kapiller yükleme pipet (Eppendorf 5.242.956,003) kullanarak çekti cam iğne yükleyin. Enjekte edilecek kaç yumurta bağlı olarak, 5-10 uL yükleyin. Hava kabarcıklarının yokluğu plazmid çözeltisi sürekli bir sütun oluşturarak, yavaş cam iğne doldurun. </li><li> Mikromanipülatör (Narishige mm3) ve Picospritzer III mikroenjektör bağlı iğne tutucuya yüklenen iğne yerleştirin. Bir dissecti altında iğne görüntülemekmikroskop ve yeşil sıvı durur noktada iğne kırpın. Daha iyi iğne görselleştirmek için karanlık bir arka plan kullanmanıza yardımcı olur. Kırparak Uygun iğne uygulaması ile birlikte geliyor. </li></ol> 4. Ortabeyin / Nöral Tüp Enjeksiyon (video) <ol><li> Yumurta bir 2-2.5 cm çapında pencere kesmek için bahar makas kullanın. Albümin çizerken yapılan önceki iğne deliğinden pencereyi başlatın ve kesmek gibi elinizde yumurta döndürün. Yumurtalar arasındaki% 70 etanol içinde doymuş bir Kimwipe ile makas kapalı temiz emin olun. </li><li> Bir diseksiyon mikroskobu altında civciv embriyosu görüntüle. Bu gözler yetiştirmek için gerekli olabilir. Bu civciv embriyo altında PBS 0.22 um-filtre% 20 Türkiye mürekkep enjekte edilerek embriyo görselleştirmek için yardımcı olabilir. Bununla birlikte, mümkünse de sağkalım azaltma eğilimdedir olarak, bu basamak, kaçınılmalıdır olduğunu bulduk. </li><li> Embriyo iğne yoluna paralel olarak konumlandırılmış eğer Enjeksiyon uzak iğne başı, en iyi çalışır.Yavaşça delip Ortabeyin-arka beyin kavşağına 45 derecelik bir açıyla nöral tüp. Sadece ön beyin ve arka beyin bölgeye önemli difüzyon olmadan, plazmid DNA ve Fast Green boya ile Ortabeyin temsil nöral vezikül doldurmak için çok önemlidir. 25 ms Picospritzer mikroenjektör süresini set ile enjekte başlayın; bu iğne kırparak bağlı olarak değiştirilmesi gerekebilir. Genel olarak, 10-50 ms arasında kullanılacak. </li></ol> 5.. Elektroporasyon (video) <ol><li> Enjeksiyon iğnesi alın. Yer embriyo üzerinde yumurta PBS çözüm 1X Kalem / Strep 3 damla. </li><li> BTX EMC830 elektroporatörün ayarlarını da kontrol edin: <table border="1"><tbody><tr><td> GERİLİM: </td><td> 20 V </td></tr><tr><td> PULSE UZUNLUĞU: </td><td> 25 ms </td></tr><tr><td> # BAKLİYAT: </td><td> 3 </td></tr><tr><td> ARALIK: </td><td> 500 ms </td></tr><tr><td> POLARİTESİ: </td><td&gt; PARAMETRİK </td></tr></tbody></table></li><li> İki ayrı 3 mm elektrotlar arasındaki orta oturan embriyonik Ortabeyin ile, sinirsel tüpün alt aynı yatay bir seviyede 2 mm uzunluğunda L-şekilli platin elektrotlar yerleştirin. Nöral tüp alt ile elektrotlar hizalama ventral orta beynin verimli elektroporasyon için önemlidir. Orta beyin özel elektroporasyon başarmak için, kısa 2 mm uzunluğunda uçları ile iki ısmarlama platin L şeklinde elektrotlar ile orijinal BTX elektrotlar yerini aldı. Bu platin elektrot çapı 0.5mm platin teller (Alfa Aesar) yapılır. Bu platin elektrot yeterli uzunlukta çok ön beyin veya arka beyin bölgelerinin hedef olmadan uzun yaklaşık 0.9 mm olup, bir sahne 11 civciv embriyo, bir orta beyin fazlasını kapsamaktadır. BTX ayak pedalı bir kez basın. Hava kabarcıkları her başarılı elektroporasyon ile elektrot etrafında oluşturulmuş edilmelidir. Dikkatlice yumurtadan elektrotlar ve elektrikli silin% 70 etanol kaplı Kimwipe ile kapalı niteliğindeki dizelerde. Embriyo üzerinde yumurta 1X Kalem / Strep çözüm, başka bir 3 damla yerleştirin. </li><li> Şeffaf koli bandı x 5 cm parça 5 cm ile pencereyi kapatın. Iyi ve yumurta mühür yumurta içeriğini bant ile temas olmadığından emin olun. </li></ol> 6. Inkübe ve Hasat <ol><li> Inkübatör geri yumurta yerleştirin. Inkübatör platformların dönüm kapalı olduğundan emin olun. İstenen HH aşaması 23 elde edilene kadar, yumurtalar inkübe. </li><li> Hasat canlı embriyo ve her bir durum için ortak PBS dolu Petri içine yerleştirin. Ekran mCherry ifade ile yalnızca embriyolar tutarak, bir floresan diseksiyon mikroskop altında embriyo biçilir. </li><li> 24-iyi çanak bireysel kuyulara embriyo transferi. Taze yapılmış% 2 paraformaldehid (PFA) ile 1 mL, her sıra doldurmak ve 4 2-3 saat sabitlemek için izin ° C. </li><li> 10 dakika PBS içerisinde her biri için sabit bir embriyo üç kez yıkanır. Yer embriyolar sırayla in% 15 ve dengelenir kadar% 30 sakkaroz. Embriyolar ilk sakkaroz uçuyorlar, ama denge üzerine batar. </li><li> Her embriyo için mCherry ifade desen ve düzeyde notlar alarak, bir floresan diseksiyon mikroskop altında embriyo kontrol edin. OCT her embriyo Embed. Bu şekilde sonraki analizlerde (Şekil 1) için en uygun orta beyin kesitleri oluşturmak için şark embriyo çok önemlidir. </li><li> Leica CM3050S kriyostat kullanan 18 mikron kalınlığında orta beyin kesitler hazırlayın. Uygun hücre tipi işaretleri ile immünboyama tarafından orta beyin gelişimi ve dopaminerjik hücre farklılaşması analiz edin. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Embriyonik chick Ortabeyin electroporating ve analiz şematik bir temsilini Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Başarılı bir şekilde enjekte edilir ve electroporated civciv embriyolarının, mCherry ifadesi daha da geliştirilmesi sonra orta beyin bölgesinde görünür olmalıdır ( <strong&gt; Şekil 2A, B, C). MCherry diğer ortak electroporated genlerin ifadesi ile korele olduğunu varsayarsak, uygun mCherry ifade sergileyen embriyolar daha sonra sabit ve daha fazla çalışma (Şekil 2B) için orta beyin cryosections hazırlamak için gömülü olabilir. Genel olarak, ventral ortabeyin sinirsel progenitörlerin yaklaşık% 50 etkili bir şekilde yukarıda protokolü ile transfekte edilebilir. Electroporated nöral progenitörlerin dopaminerjik kaderin özellikleri mCherry eş yerelleştirme tarafından muayene edilebilir, örneğin Tirozin hidroksilaz (TH) (Şekil 3) dopaminerjik nöron işaretleri ile, gen Bayrak etiketli. Ventral orta beyindeki progenitör etki desenlendirme farklı progenitör alanı işaretleri ile eş immnostaining cryosections tarafından incelenebilir. Yetersiz mCherry ifade ektopik genlerin olasılıkla verimli ifade olmadığını göstermektedir. Bu koşul altında Embriyolar ileri çalışmalar için kullanılmamalıdır. Benzer şekilde, embriyolardeneysel işlemin sonuna kadar ayakta kalmadı veri toplama ve analiz için kullanılamaz. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4017/4017fig1.jpg" /> Şekil 1. Ovo elektroporasyon deneyde embriyonik civciv Ortabeyin çizimi. HH aşamada 11 embriyonik civciv embriyo (A) enjeksiyon işlemi görselleştirmek için hızlı yeşil karışık ilgi genler ile birlikte pCAG-mCherry ile enjekte edilir. DNA yapıları ile dolu sonra midbrains bir kare dalga elektroporatörün ile electroporated edilir. İstenen HH aşamada 23 ulaşılana kadar embriyolar daha inkübe edilir. Sonra mCherry pozitif embriyolar, hasat sabit ve gömülü (B) vardır. Orta beyin cryosections Şekil 1B beyaz çizgi ile gösterilen uçak kesim ile hazırlanmış ve bu Tirozin hidroksilaz (TH) (C) gibi orta beyin işaretleri ile immünboyama ile analiz edilir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4017/4017fig1large.jpg" target="_blank">tıklayınız</a>büyük rakam görüntülemek için. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4017/4017fig2.jpg" /> Şekil 2,. Embriyonik chick Ortabeyin gelen cryosections hazırlanması. 41 saat inkübasyondan sonra, mCherry ve faiz genleri ifade HH aşamada 23 civciv embriyosu, PFA ile sabit sakaroz ile tedavi ve cryosectioning için OCT gömülü, (A, B ve C) hasat edilir. Chick embriyosu dikkatle Ortabeyin bölümlerin hazırlanması sağlamak üzere yönlendirilmektedir. Orta beyin bölümleri elde etmek için tipik bir embriyo morfolojisi ve kesme düzlemi (D) gösterilir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4017/4017fig2large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4017/4017fig3.jpg" /> Şekil 3. Electroporated Ortabeyin kesitler. MCherry ifade düzeyi yüksek olan embriyolardan Cryosections (A) antibod ile hazırlanan ve boyananilgi Bayrağı etiketli geni (B) ve orta beyin dopaminerjik nöron işaretleyici TH (C) kabul ler. PCAG-mCherry ve pCAG-Bayrak boş vektör kontrolü görevi ile electroporated Embriyonik midbrains. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4017/4017fig3large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Wightman, R. M., Robinson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+changes+in+mesolimbic+dopamine+and+their+association+with+'reward'.">Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with 'reward'.</a> J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).</li><li>Kelley, A. E., Berridge, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroscience+of+natural+rewards:+relevance+to+addictive+drugs.">The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs.</a> J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).</li><li>Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathophysiology+of+Parkinson's+disease.">Molecular pathophysiology of Parkinson's disease.</a> Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).</li><li>Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine,+depression+and+antidepressants.">Dopamine, depression and antidepressants.</a> Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).</li><li>Sesack, S. R., Carr, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+prefrontal+cortex+inputs+to+dopamine+cells:+implications+for+schizophrenia.">Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia.</a> Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).</li><li>Ang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+midbrain+dopaminergic+neuron+development.">Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development.</a> Development. 133, 3499-3506 (2006).</li><li>Andersson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+intrinsic+determinants+of+midbrain+dopamine+neurons.">Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons.</a> Cell. 124, 393-405 (2006).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Series+of+Normal+Stages+in+the+Development+of+the+Chick+Embryo.">A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo.</a> J. Morphol. 88, 49 (1951).</li><li>Bellairs, R., Osmond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The atlas of chick development. , (2005).</li><li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Shocking'+developments+in+chick+embryology:+electroporation+and+in+ovo+gene+expression.">'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).</li><li>Momose, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation.">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).</li><li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).</li><li>Nishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+in+vivo+gene+transfer+using+intraarterial+plasmid+DNA+injection+following+in+vivo+electroporation.">High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation.</a> Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).</li><li>Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Ovo+Electroporations+of+HH+Stage+10+Chicken+Embryos.">In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos.</a> J. Vis. Exp. (9), e408 (2007).</li><li>Chesnutt, C., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+short-hairpin+RNA+interference+in+the+chicken+embryo.">Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo.</a> Genesis. 39, 73-78 (2004).</li></ol>

Yazarlar, ifşa etmek, potansiyel hiçbir çıkar çatışmaları var.

Embriyonik civciv orta beyin ve ovo elektroporasyon de düşük maliyet ve orta beyin dopaminerjik nöron gelişiminde gen fonksiyonlarının in vivo çalışma gerçekleştirmek için transgenik veya bayıltıcı hayvanların nesli hızlı bir alternatif sunuyor. Embriyonik orta beyin-spesifik DNA enjeksiyonu ile birlikte kısa 2 mm L şeklinde uzun bir platin elektrot kullanarak orta beyin dopaminerjik nöron progenitörlerin ilgi geninin etkin ifadesi ulaşmak için anahtardır. Buna ek ola...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Döllenmiş tavuk yumurtası </td><td> Charles River Laboratuvarları </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kuluçka </td><td> GQF İmalat </td><td> 1502 Sporcu </td><td></td></tr><tr><td> BTX Elektroporatör </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td> ECM830 </td><td></td></tr><tr><td> Elektrotlar </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td> 45-0162 L-şekilli genetrodes </td><td> ECM830 elektroporatörün ile kullanım için </td></tr><tr><td> Platin iridyum tel </td><td> Alfa Aesar </td><td> # 10056 </td><td> 0,5 mm çaplı 2 mm uzun elektrotlar yapmak için </td></tr><tr><td> Cam kılcal tüp </td><td> Dünya Hassas Çalgı </td><td> TW100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader pipet </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956.003 </td><td></td></tr><tr><td> Çini mürekkebi </td><td> Staples </td><td></td><td> Kullanmadan önce 20% süzmek </td></tr><tr><td> Mikroenjektör </td><td> Parker Otomasyon, Parker Hannifin İşbirliği </td><td> Picospritzer III </td><td></td></tr><tr><td> Floresan diseksiyon mikroskobu </td><td> Leica </td><td> MZ16F </td><td></td></tr><tr><td> Mikropipet çektirmenin </td><td> Sutter Enstrüman </td><td> D-97 </td><td></td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation in chick midbrain for studying gene function in dopaminergic neuron development

Ventral orta beyin kontrolü hareketi bulunan dopaminerjik nöronlar, duygusal davranış ve ödül mekanizmaları 1-3. Ventral orta beyin dopaminerjik nöronların disfonksiyon, Parkinson hastalığı, şizofreni, depresyon, demans ve 1-5 rol oynar. Böylece, orta beyin dopaminerjik nöron farklılaşma yönetmelik okuyan orta beyin gelişimi ve nöral progenitör kaderi özellikleri düzenleyen mekanizmalar çok önemli ipuçları sadece sağlamaz, ama aynı zamanda insan nörolojik bozukluklar çeşitli tedavisi için yeni tedavi stratejileri geliştirmelerine yardımcı olur. Dopaminerjik nöronların embriyonik ventral orta beyin içinde, ventriküler zon döşeyen sinirsel öncü hücrelerden ayırt. Sinir progenitörlerin gelişimi gen ifadesi programları 6,7 tarafından kontrol edilir. Burada (th Hamburger Hamilton (HH) evre 11 Ortabeyin özellikle genleri ifade elektroporasyon kullanan teknikleri raporirteen Somitlerin, 42 saat) civciv embriyolarının 8,9. Civciv embriyo gelişimi dış sonraki gelişim zaman noktalarında 10-13 belirlenen etkileri ile özgün embriyonik aşamalarında uygun deneysel manipülasyonlar, sağlar. Erken evre HH 13 (ondokuz Somitlerin, 48 saat) daha Chick embriyonik nöral tüp sinir sisteminin farklı hücre tiplerine farklılaşma yeteneğine sahiptirler multipotent nöral progenitörlerin oluşur. Bir CMV organizatörü ve bir civciv β-aktin artırıcı hem de içeren pCAG vektör, Bayrak veya embriyonik civciv nöral tüp 14 diğer epitop etiketli yapıları sağlam bir ifade verir. Bu yazıda, DNA embriyonik Ortabeyin bölgeye özel olarak inşa ve nasıl küçük ısmarlama elektrotlar ile elektroporasyon saptamak için nasıl enjekte dahil embriyonik orta beyin dopaminerjik nöron ataları, bölgesel açıdan kısıtlı gen elde etmek için özel önlemler üzerinde durulmuştur. C AnaliziDaha sonraki aşamalarda hödük Ortabeyin plazmid vektör aracılı kazanç fonksiyon-ve orta beyin gelişimi kaybı fonksiyon-çalışmaları için in vivo sistemde mükemmel bir sağlar. Deneysel sistem modifikasyonu kaderi haritalama analizi gerçekleştirmek için ve gen ifadesinin düzenlenmesinde araştırmak için sinir sisteminin diğer bölümlerine tahlil uzatabilir.

Watch this Scientific Journal Video about In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development at JoVE.com

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Işlevi ve orta beyin dopaminerjik nöron gelişimi sırasında genlerin düzenlenmesi değerlendirmek için, içeren bir yöntem tarif<em&gt; Ovo içinde</emEmbriyonik civciv ventral orta beyin dopaminerjik nöron ataları içine plazmid DNA yapıları&gt; elektroporasyon. Bu teknik, orta beyin gelişimi ve dopaminerjik nöron farklılaşma farklı yönlerini incelemek için ilgi genlerin etkili ifade elde etmek için kullanılabilir.

Dopaminerjik Nöron Geliştirme Gen Fonksiyonunun Çalışılması için Chick orta beyin içinde ovo Elektroporasyon yılında

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

in-ovo-electroporation-chick-midbrain-for-studying-gene-function

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

11.3K Görüntüleme.  Children's Hospital of Chicago Research Center. Işlevi ve orta beyin dopaminerjik nöron gelişimi sırasında genlerin düzenlenmesi değerlendirmek için, içeren bir yöntem tarif Ovo içinde elektroporasyon. Bu teknik, orta beyin gelişimi ve dopaminerjik nöron farklılaşma farklı yönlerini incelemek için ilgi genlerin etkili ifade elde etmek için kullanılabilir.

Video: In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Nörobilim

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

Dinamik Kelepçe Tekniği ile Sıçan orta beyin dopaminerjik nöronlar NMDA Reseptör İletkenlik Uygulama

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Embriyonik ventral orta beyin Organotipik Dilim Kültürler: dopaminerjik Nöronal Gelişim Eğitim Bir Sistem In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

Ventral Chick orta beyin içinde MikroRNA ovo İfade

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri dopaminerjik Nöron Farklılaşma Yönetmen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

Elektroporasyon tarafından Kemirgen Siyatik Sinir Schwann Hücreleri için Vivo Gen Transferi

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

Larva zebra balığı sonradan içini kaplamak saç hücrelerinin vivo kalsiyum görüntüleme

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the human brain. MEG is quiet and less likely to induce claustrophobia compared with magnetic resonance imaging (MRI). It is therefore a promising tool for investigating brain function in young children. However, analysis of MEG data from pediatric populations is often complicated by head movement artefacts which arise as a consequence of the requirement for a spatially-fixed sensor array that is not affixed to the child's head. Minimizing head movements during MEG sessions can be particularly challenging as young children are often unable to remain still during experimental tasks. The protocol presented here aims to reduce head movement artefacts during pediatric MEG scanning. Prior to visiting the MEG laboratory, families are provided with resources that explain the MEG system and the experimental procedures in simple, accessible language. An MEG familiarization session is conducted during which children are acquainted with both the researchers and the MEG procedures. They are then trained to keep their head still whilst lying inside an MEG simulator. To help children feel at ease in the novel MEG environment, all of the procedures are explained through the narrative of a space mission. To minimize head movement due to restlessness, children are trained and assessed using fun and engaging experimental paradigms. In addition, children's residual head movement artefacts are compensated for during the data acquisition session using a real-time head movement tracking system. Implementing these child-friendly procedures is important for improving data quality, minimizing participant attrition rates in longitudinal studies, and ensuring that families have a positive research experience.

This article introduces a child-friendly research protocol designed to improve data quality by reducing head movement during pediatric magnetoencephalography (MEG). We familiarize families with the MEG environment, train children to remain still using an MEG simulator, and correct for residual head movement artefacts using a real-time head movement detection system.

Beyin fonksiyonları çocuklarda Magnetoencephalography kullanarak eğitim

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...