Biz projenin erken aşamalarında yardım için Jongmin Kim, Dan Siegal-Gaskins, Anu Thubagere ve protokol düzene yardım için Enoch Yeung, ve Clare Chen ve Barclay Lee teşekkür ederim. Bu malzeme Yaşam Dökümü programı, sözleşme numarası HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS da UCLA / Caltech Tıp Scientist tarafından desteklenen Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı (DARPA / MTO) tarafından kısmen desteklenen çalışma üzerine kuruludur Eğitim Programı dostluk ve bir DoD, Bilimsel Araştırma, Milli Savunma Bilimi ve Mühendisliği Yüksek Lisans (NDSEG) Bursu, 32 CFR 168A Hava Kuvvetleri Ofisi., bu belgede yer alan görüş ve sonuçlar yazarlara aittir ve temsil olarak yorumlanmaması gerektiğini resmen politikaları, açıkça veya ima, Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı veya ABD Hükümeti.

<ol>
	<li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly.">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12672-12677 (2003).</li><li>He, M. Y., He, Y. Z., Luo, Q., Wang, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+DNA+to+protein:+No+living+cells+required.">From DNA to protein: No living cells required.</a> Process Biochem. 46, 615-620 (2011).</li><li>Forster, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology+projects+in+vitro.">Synthetic biology projects in vitro.</a> Genome Res. 17, 1-6 (1101).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of biological engineering. 4, 8 (2010).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> Acs Synth Biol. 1, 29-41 (2012).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+messenger+RNA+inactivation+and+protein+degradation+in+an+Escherichia+coli+cell-free+expression+system.">Study of messenger RNA inactivation and protein degradation in an Escherichia coli cell-free expression system.</a> Journal of biological engineering. 4, 9 (2010).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Replication,+Synthesis,+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction.">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> Acs Synth Biol. 1, 408-413 (2012).</li><li>Siegal-Gaskins, D., Noireaux, V., Murray, R. M., Pao, L., Abramovitch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+resource+utilization+in+elementary+cell-free+gene+circuits.">Biomolecular resource utilization in elementary cell-free gene circuits.</a> , 1531-1536 (2013).</li><li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-grained+dynamics+of+protein+synthesis+in+a+cell-free+system.">Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system.</a> Physical review letters. 106, 048104 (2011).</li><li>Hoagland, M. B., Stephenson, M. L., Scott, J. F., Hecht, L. I., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+Ribonucleic+Acid+Intermediate+in+Protein+Synthesis.">Soluble Ribonucleic Acid Intermediate in Protein Synthesis.</a> J Biol Chem. 231, 241-257 (1958).</li><li>Wood, W. B., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Enzymatically+Synthesized+Ribonucleic+Acid+on+Amino+Acid+Incorporation+by+a+Soluble+Protein-Ribosome+System+from+Escherichia+Coli.">Effect of Enzymatically Synthesized Ribonucleic Acid on Amino Acid Incorporation by a Soluble Protein-Ribosome System from Escherichia Coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 48, 94 (1962).</li><li>Zubay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Vitro+Synthesis+of+Protein+in+Microbial+Systems.">In-Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems.</a> Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).</li><li>Pratt, J. M., Hames, B. D., Higgins, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transcription and Translation: A Practical Approach. , 179-209 (1984).</li><li>Kim, H. C., Kim, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+energizing+cell-free+protein+synthesis.">Methods for energizing cell-free protein synthesis.</a> Journal of bioscience and bioengineering. 108, 1-4 (2009).</li><li>Michel-Reydellet, N., Calhoun, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+stabilization+for+cell-free+protein+synthesis+by+modification+of+the+Escherichia+coli+genome.">Amino acid stabilization for cell-free protein synthesis by modification of the Escherichia coli genome.</a> Metabolic engineering. 6, 197-203 (2004).</li><li>Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+Escherichia+coli+S30+extract+preparation+for+economical+cell-free+protein+synthesis.">Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology progress. 21, 460-465 (2005).</li><li>Andrianantoandro, E., Basu, S., Karig, D. K., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology:+new+engineering+rules+for+an+emerging+discipline.">Synthetic biology: new engineering rules for an emerging discipline.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0028 (2006).</li><li>Kwok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+hard+truths+for+synthetic+biology.">Five hard truths for synthetic biology.</a> Nature. 463, 288-290 (2010).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacteriophage+T7+RNA+polymerase/promoter+system+for+controlled+exclusive+expression+of+specific+genes.">A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 1074-1078 (1985).</li><li>Lewicki, B. T., Margus, T., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+rRNA+transcription+and+ribosomal+assembly+in+vivo.+Formation+of+active+ribosomal+subunits+in+Escherichia+coli+requires+transcription+of+rRNA+genes+by+host+RNA+polymerase+which+cannot+be+replaced+by+bacteriophage+T7+RNA+polymerase.">Coupling of rRNA transcription and ribosomal assembly in vivo. Formation of active ribosomal subunits in Escherichia coli requires transcription of rRNA genes by host RNA polymerase which cannot be replaced by bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Journal of molecular biology. 231, 581-593 (1993).</li><li>Iskakova, M. B., Szaflarski, W., Dreyfus, M., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+coupled+in+vitro+transcription-translation+system+derived+from+Escherichia+coli+cells:+synthesis+of+high-yield+fully+active+proteins.">Troubleshooting coupled in vitro transcription-translation system derived from Escherichia coli cells: synthesis of high-yield fully active proteins.</a> Nucleic acids research. 34, e135 (2006).</li><li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression.">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of structural and. 5, 63-68 (2004).</li><li>Matsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell-free+protein+synthesis+for+stable-isotope+labeling.">Improving cell-free protein synthesis for stable-isotope labeling.</a> Journal of biomolecular. NMR. 37, 225-229 (2007).</li><li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cell-free+protein+synthesis+system.">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of biotechnology. 110, 257-263 (2004).</li><li>Becskei, A., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stability+in+gene+networks+by+autoregulation.">Engineering stability in gene networks by autoregulation.</a> Nature. 405, 590-593 (2000).</li><li>Maeda, H., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+among+seven+Escherichia+coli+sigma+subunits:+relative+binding+affinities+to+the+core+RNA+polymerase.">Competition among seven Escherichia coli sigma subunits: relative binding affinities to the core RNA polymerase.</a> Nucleic acids research. 28, 3497-3503 (2000).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coping+with+complexity:+machine+learning+optimization+of+cell-free+protein+synthesis.">Coping with complexity: machine learning optimization of cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and bioengineering. 108, 2218-2228 (2011).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic engineering. 14, 261-269 (2012).</li><li>Elowitz, M. B., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+oscillatory+network+of+transcriptional+regulators.">A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators.</a> Nature. 403, 335-338 (2000).</li><li>Tsuruta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+amorpha-4,11-diene,+a+precursor+of+the+antimalarial+agent+artemisinin,+in+Escherichia+coli.">High-level production of amorpha-4,11-diene, a precursor of the antimalarial agent artemisinin, in Escherichia coli.</a> Plos One. 4, e4489 (2009).</li><li>Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+genetic+toggle+switch+in+Escherichia+coli.">Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli.</a> Nature. 403, 339-342 (2000).</li><li>Jewett, M. C., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+designing+and+building+minimal+cells.">Update on designing and building minimal cells.</a> Current opinion in biotechnology. 21, 697-703 (2010).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Burada anlatılan endojen Escherichia coli tabanlı TX-TL hücre-özgür ifade sistem veri toplama kurmak daha az sekiz saat sürebilir kolay bir vadede üç tüp tepkidir. Tüm reaktifler oluşturma işlemi beş günlük süre toplam (sadece bir günde önemli emek şartlarına) gerektirir, ancak 3000 reaksiyonlar için ham özü üreten ve tampon verme 10000 reaksiyonları için reaktif (Şekil 1). Ayrıca, ham öz ve tampon verme reaktif bir hazırlama birden fazla kullanım için izin veren, -80 ° C de en az 1 yıl boyunca stabildir. 4, 10 ul reaksiyon başına 0,11 $ (işçilik dahil 0,26 $) olarak, maliyeti karşılaştırılabilir% 98&#39;den daha düşüktür ticari sistemler (Şekil 2). Bazı çözülmemiş sınırlamalar sisteme Bununla birlikte, var. Her bir ham hücre özütü hazırlama nihai verim, kullanıcı, yeterlilik ve çevre koşullarına göre değişebilir, ancak typical verim varyasyon% 5-10 (Şekil 4b) arasındadır. Bunun bir sonucu olarak, her iki uç noktası ifade ve ifade dinamikleri partiden partiye değişkenlik beklenemez. Özü oluşturma tam otomatik kadar özü tam olarak karakterize kadar veya bu varyasyonlar büyük olasılıkla kalacaktır. Hücre içermeyen sentezleme sistemi hassas bir kantitatif deneyler için kullanılan, bu ham hücre ekstresinin aynı toplu tüm deneyler çalıştırmak için tavsiye edilir. Tek bir ham hücre ekstraktı toplu, yaklaşık 3000 reaksiyonlar verimi tipik bir deney sahaları için yeterli olmalıdır. Biz varyasyon ölçeklendirme ve prosedürü otomatik silinebilir şüphelenmesine rağmen, bu tür girişimler önemli bir kaynak yatırımı içerecektir. Uç-nokta temsil seviyelerini belirlemek üzere oldukça kolay olmasına rağmen, ayrıca, daha fazla iş hücre içermeyen bir sistem için esas anlayış dinamikleri yapılması gerekmektedir. Bilindiği gibi iki kaynak competition ve kaynak sınırlaması ifade dinamiklerini etkileyebilir. Örneğin, belirli endojen sigma 70. 9,27 Bununla birlikte, tam dinamik sistem kullanmak için anlaşılması gerekmez artan DNA şablonu nükleotid ya da amino asit tükenmesi edilene benzer bir ekspresyon profili üreten bir doyurulması rejimi neden olabilir. Verim saf artar, optimizasyon makine-öğrenme yaklaşımları ile yapılabilir. Kaynak rekabeti sınırlama ve 28 Sorular deneysel veriler kullanılarak doğrulandı matematiksel modellerle ele alınabilir. Burada sunulan protokolü BL21-Rosetta2 suşu için optimize edilmiş, ancak diğer E. genellenebilir olduğunu coli suşları. Bu tür gen kodlayan boylam proteaz ve nadir tRNAs kodlayan genlerin ilavesinin giderilmesi gibi BL21-Rosetta2 modifikasyonlar, maksimum protein üretimi için izin verir. Biz diğer iki ekstresi suşları ile protokol çalıştılar - sadece BL21 ve BL21 trxA nakavt-and% 50 daha az protein verimi bulundu. Biz diğer suşları kullanırken verimleri benzer azalttığını varsayımında. Örneğin LB ve diğer zengin bakteri kültürü için 2xYT büyüme ortamını değiştirme gibi parametreler, diğer değişiklikler, azalmış protein verimle sonuçlandı. Endojen ve eksojen transkripsiyon-çeviri makine ve regülasyon mekanizmalarını hem kullanan hücre-özgür ifade sistemleri protein ve metaboliti ifade hem de ve sentetik biyoloji geniş uygulamalar var. Yerine T7-regüle devreleri sınırlı olmak, bir karmaşık biyomoleküllerin üretiminde tasavvur edebilir 3,29 yerli E. bir karışımını kullanarak bir kullanıcı tarafından kontrol ortamda coli hızlandırıcılar ve dışsal olarak verilen transkripsiyon ve regülasyon mekanizmaları. Hücre bölünmesi ve metabolizma sınırlama olmaksızın, bu tür repressilator ya da bu üretim artemisinin gibi metabolik mühendislik yollarındaki gibi sentetik devrelerinde değişkenlik azalır ya da daha iyi anlaşılabilir. 30,31 Biz havE genetik anahtarları uygulamak için, yanı sıra sigma faktörü haciz anlamak için bu avantajları kullanılır 9,32 Bu teknoloji aynı zamanda &quot;minimal&quot; veya &quot;yapay&quot; hücrelerin omurgasını oluşturabilir -. küçük, iyi karakterize ve kendine yeterli somutlaşan birimleri özü. 33,34 Sonuçta, biz sentetik biyoloji için bir prototip ortamı olarak bu endojen hücre içermeyen ifade sisteminin derhal kullanımlar tahmin. Temel plazmiti, doğrusal ya da kimyasal olarak sentezlenmiş DNA üzerinde test döngüleri, bunu takiben-- takma &quot;TX-TL biyomoleküler deneyleri,&quot; hücre sentezleme sistemi içermeyen prototipleme mermi geçirebilmektedir sentetik devre sonunda in vivo ifadesi için tahsis edilmiş bir kontrol ortamı sağlar analizi ve hızlı bir modifikasyonu ile. Prototip mermi şu anda geliştirilmekte olan akıllı matematiksel modellerle destekli olabilir. Klonlama ve non-son devreler için vivo manipülasyon kaldırarak, biz engi tahmindisliği döngü süreleri yerine geçerli haftalık standart 1-3 gün azaltılmalıdır.

A correction to Figure 5's legend has been made for the article <a href="http://www.jove.com/video/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology</a>. Method 1 and method 2 have been switched.Z
The figure legend was update from:
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Hücre içermeyen ifade teknolojisi T7 bakteriyofaj DNA kullanılarak bağlanmış transkripsiyon-çeviri mekanizmaları kapsayacak şekilde yıl sonra ilerleyen, tamamen öteleme gibi 1950&#39;li yıllarda başladı. 11,12 O zamandan bu yana, sayısız çalışmalar ham hücre ekstresinin oluşturma (veya E optimize etmek için yapılmıştır . coli S30 ekstresi). 13,14 Bu optimizasyonlar ATP yenilenmesi veya zorlanma modifikasyonlar sayesinde hücre serbest protein sentezini uzatan, ve protokol süresini ve maliyetini azaltmak sayılabilir. 15-17 Alternatif hücre-özgür ifade sistemlerin var olduğunu ham petrol yerine kullanılması yeniden bileşenler ifadesi için hücre ekstresi. 5&#39;te ham hücre ekstraktı ve yeniden oluşturma yöntemleri, her ikisi de ticari kullanım için geliştirilmiştir. Sentetik biyoloji ile birlikte, mühendislik biyolojik modülleri ve devreleri test ve ifade etmek, iyi karakterize platformu için artan bir ihtiyaç vardır. 18,19 Bu platform olmalıçok yönlü, iyi karakterize, işlemek için basit ve kullanıcı tarafından sağlanan bileşenleri üzerinde duruldu. Yarım yüzyıl önce geliştirilmiş olmasına rağmen, hücre içermeyen sistemler E. dayalı Bu büyüme ve metabolizmasını karmaşıklığı olmadan hücresel süreçlerin vitro temsil basitleştirilmiş olarak coli özünde, bu gereksinimleri paylaşmaktadır. Ayrıca, E. in vivo çalışmalarında gelen temel bilginin tüm E. coli kolayca uygulanır coli hücre içermeyen sistemler. Hücresiz ekspresyon sistemleri en hücresiz ifade sistemleri hedef bugüne kadar, sentetik biyoloji uygulamaları olabilir, ancak protein ve metabolit verim en üst düzeye çıkartılması olmuştur. Bu T7 promotörler ile tahrik dizilerinin T7 bakteriyofaj transkripsiyonunu kullanılarak gerçekleştirilir. 20 sentezleme etkili ve sağlam olmakla birlikte, bu sistemler bir çok özel bir amaca hizmet eder. Hücre düzenleme yöntemleri sınırlı, hedef DNA şablonları olmalıT7 promotörleri dahil yeniden yapılandırılmış ve bu ribozomal kompleksleri gibi bazı dizileri transkripsiyonu ve monte edilemez. 21,22 Mevcut hücre içermeyen ifade sistemleri endojen düzenleyici mekanizmalar, sentetik biyoloji için gerekli bir çok yönlülük koruyarak yüksek verim koruyamazlar. Bu endojen bir E. geliştirdik Önceki sistemler tarafından gösterilen protein ifade etkinliğini korur, fakat sağlayarak ek yönlülük ekler coli hücre içermeyen ifade sistemi ifade ve (T7 ya da diğer) mekanizmalar iç ve dış iki göre düzenleme. Burada açıklanan protokol, ilk. Kigawa et al göre (2004) Liu et al. (2005), fakat önemli değişiklikler vardır. Bu, verimlilik artışı için Mg ve K-asetat üzerinde Mg-ve K-glutamat kullanır 2-merkaptoetanol kaldırır ve bir boncuk-çırpıcı kullanarak hücreleri lyses. 17,23,24 Boncuk-dayak homojenizasyon üzerinde seçilir,nedeniyle rekabet sistemlerine daha düşük maliyet ve benzer verimler basınç dayalı yöntemler, ya da sonikasyon. 23 3-fosfogliserik asit (3-PGA) bu kreatin fosfat ile karşılaştırıldığında daha üstün protein verimleri verdiği bulunmuştur olarak enerji kaynağı olarak kullanılır ve fosfoenolpiruvat. 4,25 Bizim sistemi ya da lamda-faj operatörleri ile bir sigma70 tabanlı bir promoter ya da başka ticari sistemlerinden verim benzer bir T7 promotörü tahrikli kullanılarak raportör protein 0.75 mg / ml &#39;ye kadar üretebilir. 4,6 beş gün gerekli tüm reaktifleri (Şekil 1) üretimi için gerekmektedir. Ayrıca, benzer ticari, hücre içermeyen sistemlere göre% 98 maliyet tasarrufu sağlar - malzeme maliyetleri işçilik (Şekil 2) dahil $ ile 0.26 arasında yükselir 10 ul reaksiyon başına 0,11 $ vardır.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2xYT</td>
 <td>MP biomedicals</td>
 <td>3012-032</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3-PGA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8877</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A8937</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bacto-agar</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>214010</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead-beating tubes (polypropylene microvials)</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>522S</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Beads, 0.1mm dia.</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>11079101</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>71402</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
 <td>Bio-rad</td>
 <td>500-0201</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cAMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9501</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloramphenicol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C1919</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C4282</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>14121</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cuvettes, 1.5ml</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>14-955-127</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D0632</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Folinic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F7878</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>16800</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H6147</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>K-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G1149</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mg-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>49605</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>732-6204</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NAD</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N6522</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc 384-well optical bottom plates</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>142761</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc sealing tape</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>232701</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG-8000</td>
 <td>Promega</td>
 <td>V3011</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8584</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8709</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RTS Amino Acid Sampler</td>
 <td>5 Prime</td>
 <td>2401530</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>66382</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spermidine</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>85558</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris base</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>BP1521</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA (from E. coli)</td>
 <td>Roche Applied Science</td>
 <td>MRE600</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>23160</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1L Centrifuge Bottle</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>A98813</td>
 <td>This is specific for Avanti J-series; obtain equivalent size for centrifuge in use.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4L Erlenmeyer Flask</td>
 <td>Kimble Chase</td>
 <td>26500-4000</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Avanti J-26XP Centrifuge</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>393127</td>
 <td>Or 1L-capable centrifuge equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forma 480 Orbital Shaker</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>480</td>
 <td>Or chest-size 6x4L shaker equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>JLA-8.1000 Rotor</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>363688</td>
 <td>Or 1L-capable, 5000 x g rotor equivalent for centrifuge.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mini-Beadbeater-1</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>3110BX</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
Supplemental Material 1. Recipes for Items. 
Chloramphenicol, 34 mg/ml: Prepare 0.51 g chloramphenicol and add ethanol to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
2xYT+P+Cm agar plate: Prepare 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potassium phosphate dibasic solution @ 1 M, 0.88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, 0.6 g agar, and water to 40 ml. Autoclave. Let cool to 50 &deg;C and add 40 &mu;l Cm. Aliquot 25 ml into a 100x15 mm petri dish, and let cool for an hour. 
2xYT+P media: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml potassium phosphate dibasic solution @1 M, 88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, and water to 4 L. Aliquot out into 2x1.88 L and 0.24 L. Autoclave. 
Tris base, 2 M: Prepare 60.57 g Tris base and water to 250 ml. Sterilize, store at RT for later use. 
DTT, 1 M: Prepare 2.31 g DTT and water to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
S30A buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, 50 ml Tris at 2M, acetic acid (to pH 7.7), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 4 ml 1 M DTT before use. 
S30B buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, Tris at 2 M (to pH 8.2), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 2 ml 1 M DTT before use. 
HEPES: Prepare 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (to pH 8), and water to 4 ml. 
tRNA: Prepare 30 mg of tRNA and water to 600 &mu;l. 
CoA: Prepare 30 mg of CoA (MW 767.53) and water to 600 &mu;l. 
NAD: Add 34.83 mg of NAD (MW 663.43), Tris at 2 M (to pH 7.5-8), and water to 300 &mu;l. (Add 27 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5-8). 
cAMP: Add 42.80 mg of cAMP (MW 329.22), Tris at 2 M (to pH 8), and water to 200 &mu;l. (Add 73 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 8). 
Folinic Acid (33.9 mM): To 20 mg of solid folinic acid calcium salt (MW 511.5), add 1.15 ml water. 
Spermidine: Prepare 23.55 &mu;l of spermidine (MW 145.25) and water to 150 &mu;l. Prepare at room temperature after melting briefly at 37 &deg;C. 
3-PGA: Add 1.03 g of 3-PGA (MW 230.02), Tris at 2 M (to pH 7.5), and water to 3.2 ml. (Add 1.73 ml of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5). 
Nucleotide Mix: Add 145 mg of ATP dipotassium salt dihydrate (MW 619.4), 133 mg of GTP disodium salt (MW 567.14), 79.4 mg of CTP disodium salt dihydrate (MW 563.16), 82.6 mg of UTP trisodium salt dihydrate (MW 586.12), KOH at 15% dilution (to pH 7.5), and water to 1.5 ml. (Add 353 &mu;l of KOH at 15% dilution to bring the solution to pH 7.5). 
Supplemental Material 2. Bradford Assay.
<ol>
<li>Remove Bradford agent from 4 &deg;C and set at room temperature.</li>
<li>Prepare 50 &mu;l BSA Standard at 1 mg/ml and at 0.1 mg/ml.</li>
<li>Prepare 40 &mu;l 20x dilution of extract from step 1.47.</li>
<li>Add 800 &mu;l water to 7 cuvettes. </li>
<li>Prepare standard cuvettes for 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 &mu;l 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 &mu;l 1 mg/ml BSA).</li>
<li>Prepare experimental cuvettes for 2 &mu;l of sample and 4 &mu;l of sample.</li>
<li>Add 200 &mu;l of Bradford agent to each cuvette and mix well by pipetting. Incubate at room temperature for at least 10 min.</li>
<li>Produce standard curve at OD 595nm using cuvettes from step 6.5. Reject standard curve if r2 &lt; 0.95.</li>
<li> Determine extract concentration at OD 595nm using cuvettes froms tep 6.6.</li>
</ol>
Supplemental Material 3. Buffer calibration spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx</a>.
 
Supplemental Material 4. Cell-free expression run spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL _JoVE.xlsx</a>.
 </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology

Ideal hücresiz ifade sistemleri, teorik olarak, bir in vitro platform kontrol edilir. 1 Bu, kontrollü bir şekilde proteinler ve genetik devreleri ifade hem de sentetik biyoloji için bir prototip bir ortam temin etmek için kullanışlıdır. 2,3 bir in vivo hücre ortamı taklit İkinci amaca ulaşmak için, korumak hücresiz ifade sistemleri, endojen Escherichia coli transkripsiyon için mekanizmalar daha doğru bir T7 RNA polimeraz transkripsiyonuna dayanan daha in vivo hücre dinamiklerini yansıtmak mümkün bulunmaktadır. Biz verimli bir endojen E. hazırlanmasını ve yürütülmesini tarif Benzer ticari sistemler için% 98 maliyet azaltma T7 bazlı sistemleri gibi protein eşdeğer miktarlarda üretmek coli göre transkripsiyon için (TX-TL) hücre içermeyen sentezleme sistemi. 4,5 tampon ve ham hücre ekstresinin hazırlanması vardır Bir yürütülmesi, hem de tarifÜç tüp TX-TL reaksiyonu. Tüm protokol hazırlamak için beş gün sürer ve bir hazırlık 3000&#39;e kadar tek reaksiyonlar için yeterli malzeme verir. Hazırlandıktan sonra, her reaksiyon veri toplama ve analiz için kurulum 8 saat altında sürer. E. düzenleme ve transkripsiyon dışsal Mekanizmaları E. coli, örneğin, lak / tet baskılayıcılar ve T7 RNA polimeraz gibi, takviye edilebilir. mRNA ve DNA yıkımı oranları gibi 6 endojen özellikleri de ayarlanabilir. 7 TX-TL hücresiz sentezleme sistemi için gösterilmiştir geniş ölçek devre montaj, biyolojik olguları keşfetmek, hem T7-ve endojen yararlanıcı altında proteinlerin ifadesi. 6,8 Refakatçi matematiksel modelleri mevcuttur. 9,10 çıkan sistem bir prototip ortamı olarak sentetik biyoloji benzersiz uygulamaları vardır, ya da &quot;TX- TL Biyomoleküler breadboard. &quot;

Biz, TX-TL hücresiz sentezleme sistemi tabanlı bir endojen Escherichia coli hazırlanması için, beş gün protokol sundu. Ham hücre özütü ve tampon - - reaktiflerin yaratmak için örnek bir zaman çizelgesi, Şekil 1 de bulunabilir. Oluşturulduktan sonra, bu bir yıla kadar -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. Reaktif oluşturulduktan sonra, deney setup ve yürütme az 8 saat içerisinde yapılabilir. Buna ek olarak, TX-TL hücresiz ekspresyon sisteminde ekspresyonu koşulları optimize edilmiştir. Bu tür tampon çözeltiler ya da DNA gibi diğer kullanıcı tarafından sağlanan ilave, daha önce toksisite için kalibre edilmelidir. Örneğin, işleme plazmidlerin değişik yöntemleri nedeniyle tuz içeriği için farklı tanımına neden olur. Ayrıca, reaksiyon verimliliği üzerinde Tris-Cl elüsyon tamponu etkisini (Şekil 5) test edilmiştir. 4.9 adım 4.1 atıfta ham hücre ekstraktı kalibrasyon, bir örnek gösterilmektedirŞekil 4a. Genelde, deneyler ham hücre ekstraktı K-glutamat seviyeleri, ardından Mg-glutamat seviyeleri, en hassas olduğunu göstermektedir. Hücre içermeyen ifade sistemini göstermek için, biz tet tahakküme dayalı bir negatif geri besleme döngüsü. 26. (Şekil 6) inşa ve test edilmiş. Hücre içermeyen sentezleme sisteminde, ve ATC olmadan aynı devre çalıştırma ifade sekiz saat sonra deGFP raportör bir 7-kat uç-nokta ifade değişimi göstermektedir. Bu &quot;Master Mix Terkip.&quot; Altında ilave edilebilir gerekirse, bu deney, genel uyarıcıları veya baskılayıcılar gerektirmez, ancak <img alt="Şekil 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1.jpg" /> Şekil 1. Ham hücre özü, amino asit çözeltisi, ve enerji çözelti hazırlanması için zaman çizelgesi. Beş günlük bir timelin<html> Protokolün tipik yürütülmesi için e gece boyunca ve gündüz inkubasyon çalışma adımları için optimize edilmiş, yukarıda verilmiştir. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2.jpg" /> Şekil 2. Maliyet ve ham hücre ekstreleri rekabet ekspresyon analizi. a) TX-TL hücresiz sentezleme sistemi emek ve malzeme maliyetlerini Dağılımı. Aralık 2012 gibi reaktiflerin maliyetleri, ve saat başına 14 $ işçilik maliyetleri dayalı. B) diğer ticari sistemleri vs TX-TL hücre serbest ifade sistemi maliyetlerinin karşılaştırması. Reaksiyon hacimleri kit başına. C diğer ticari sistemleri vs TX-TL hücre serbest ifade sistemi verim) Karşılaştırma değişebilir ancak maliyetleri, ul başına aşağı kırılmış. Protein ifadesi verim üretici standartlar tarafından belirlenir./ 50762fig2large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük rakam görmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3.jpg" /> Şekil 3,. Bir boncuk-dayak tüp yükleme ve işleme. a) Hücre-boncuk çözeltisi doğru viskozite gösterilmesi. Hücre-boncuk çözüm buz üzerinde harcanan eklendi S30A tampon miktarı, katma boncuk miktarı ve süresi dahil birçok faktöre bağlı bir viskoziteye sahip olacaktır. B) boncuk-yenerek tüp yükleniyor hızlı masaüstü santrifüj önce. Santrifüj yükleme sırasında biriken kabarcıklar kaldırır. C) masaüstü santrifüj sonra yüzey Bubbles. Kabarcıkların boyutu değişir,. Onlar bir pipet d kullanarak attı veya kaldırılabilir) Tamamen dolu boncuk-yenerek tüp kapatma önce. Bir menisküs boncuk yenerek t oluşturulurube ve kapak). e doldurlama Doğru yüklü filtre cihazı, az miktarda kapak ve neden yeterli bulunmuyor. Bu doğru vs yanlış işlenmiş boncuk-yenerek tüp. F) Karşılaştırma tekrar edilebilir. Soldaki tüpü iyi dövmek tüp - bu küçük ve iyi belirlenmiş üst tabaka, ve çok net süpernatant sahiptir. Sağdaki tüp daha büyük, puslu ikinci tabaka ve puslu yüzer göre suboptimaldir. Suboptimaldi Tüpler ek işleme tabi olmamalıdır. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4.jpg" /> Şekil 4. Ham ekstrakt preparatların özellikleri. a) ham hücre ekstresi için tipik kalibrasyon araziler. Ham ekstrakt, bu sırayla ilave Mg-glutamat, K-glutamat ve DTT seviyeleri için kalibre edilir. Son nokta fluorescenc gösterilmektedire 8 saat, hem de 12 dakikalık bir hareketli ortalama göre protein üretiminin maksimum hızı sonra. Bu araziler göre, ek Mg-glutamat, kabul edilebilir bir aralığı K-glutamat 60-80 mM, 4 mM ve DTT, 0-3 mM&#39;dir. Her ham özü bu üç değişkenler için bağımsız kalibre edilmesi gerektiğini unutmayın. B) özü hazırlıkları sapmalar. Farklı tarihlerde hazırlanan iki ham ekstrelerinin Endpoint floresan gösterilir; hata çubukları farklı günde, üç bağımsız çalışan 1 standart sapma vardır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig4large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 5," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5.jpg" /> Şekil 5,. Ifade verimliliği DNA çözeltisi etkisi. iki farklı saflaştırma a) Karşılaştırmaplazmidleri işleme yöntemleri. PBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 1 nM sadece bir QIAprep Spin Miniprep Kiti (saflaştırma, yöntem 1) ya da bir QIAquick PCR saflaştırma kiti ile post-işlem kullanılarak hazırlanır (saflaştırma, yöntem 2). 8 saat, hem de 12 dakikalık bir hareketli ortalama göre protein üretiminin maksimum hızı sonra uç floresan gösterilmiştir. Hata çubukları, farklı günlerde dört bağımsız çalışan 1 standart sapma değerleridir. Elüsyon tamponu b) etkisi (Tris-Cl). Tris-Cl farklı konsantrasyonları pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 1 nM ekspresyonuna göre hücresiz bir sentezleme reaksiyonu karşılaştırılmaktadır. Verilen konsantrasyonlar reaksiyonunda Tris-CI içinde nihai konsantrasyonlar olarak, kullanılan yıkama tamponu 10 mM Tris-Cl. Hata çubukları farklı günlerde üç bağımsız çalışan 1 standart sapma vardır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig5large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Şekil 5," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6.jpg" /> Şekil 6,. Negatif geri besleme döngüsü örnek TX-TL çalıştırın. a) Örnek hücresiz yürütme reaksiyonu kurulumu. Vs negatif geri besleme döngüsü &quot;off&quot; devlet, pozitif ve negatif kontroller ile. B) negatif geri besleme döngüsü plazmid haritası. C) Temsilcisi sonuçları &quot;konulu&quot; Testleri. Veriler deney in yansıtan) ve b), negatif kontrol ile sinyalinden çıkartılmaktadır. Genetik devre insert gösterilmiştir. Hata çubukları farklı günlerde üç bağımsız çalışan 1 standart sapma vardır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig6large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Konsantrasyon </td><td> Miktar </td><td> Sterilizasyon </td><td> Notlar </td></tr><tr><td> Kloramfenikol (Cm) </td><td> Etanol içinde 34 mg / ml </td><td> 1 mi </td><td> Filtre sterilize (0.22 uM) </td><td> Daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de saklanır büyük hacimlerde yapılabilir. </td></tr><tr><td> 2xYT + P + Cm agar </td><td> 31 g / L 2xYT, 40 mM potasyum fosfat dibazik, 22 mM potasyum fosfat monobazik, 34 ug / ml kloramfenikol </td><td> 1 tabak </td><td> Otoklav </td><td></td></tr><tr><td> 2xYT + P medya </td><td> 31 g / L 2xYT, 40 mM potasyum fosfat dibazik, 22 mM potasyum fosfat monobazik </td><td> 4 L </td><td> Otoklav </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Ham hücre ekstresi protokol 1 gün için ayıraçlar. <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Konsantrasyon </strong&gt; </td><td> Miktar </td><td> Sterilizasyon </td><td> Notlar </td></tr><tr><td> Tris baz </td><td> 2 M </td><td> 250 ml </td><td> Filtre sterilize (0.22 uM) ya da otoklav </td><td> Oda sıcaklığında saklanabilir. </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 1 M </td><td> 6 mi </td><td> Filtre sterilize (0.22 uM) </td><td> Büyük hacimli olarak yapılmış ve daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </td></tr><tr><td> S30A tampon </td><td> 14 mM Mg-glutamat, 60 mM K-glutamat, 50 mM Tris, pH 7.7 </td><td> 2 L </td><td> Otoklav </td><td> PH 7.7 ulaşmak için, asetik asit ile titre edilir. Kullanımdan hemen önce 2 mM nihai konsantrasyon için DTT ekleyin. 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> S30B tampon </td><td> 14 mM Mg-glutamat, 60 mM K-glutamat, ~ 5 mM Tris, pH 8.2 </td><td> 2 L </td><td> Otoklav </td><td> PH 8.2 ulaşmak için 2M ile titreTris. Kullanımdan hemen önce, 1 mM DTT nihai konsantrasyon için ekleyin. 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Ham hücre ekstresi protokol 2 gün için ayıraçlar. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Şahin </td></tr><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Boş 50 ml Falcon (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pelet 50 ml Falcon (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pellet kütlesi (50 mi pelet Falcon - boş 50 ml Falcon) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Eklemek için S30A tampon hacmi (pelet kütle * 0.9) (ml) </td><td></td&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Eklemek için boncuk toplam kütlesi (topak kütle * 5.0) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 3. Ham Hücre Özü protokolü 3 gün boyunca S30A tampon ve boncuk kitle hesap makinesi,. <table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Konsantrasyon </td><td> Miktar </td><td> Sterilizasyon </td><td> Notlar </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 2 M, pH 8 </td><td> 4 mi </td><td> Hiçbiri </td><td> PH 8 ulaşmak için, KOH ile titre. </td></tr><tr><td> Nükleotid Mix </td><td> 156 mM ATP ve GTP, 94 mM CTP ve UTP, pH 7.5 </td><td> 1.5 mi </td><td> Hiçbiri </td><td> PH 7.5 ulaşmak için, KOH ile titre. </td></tr><tr><td> tRNA </td><td> 50 mg / ml </td><td> 600 ul </td><td> Hiçbiri </td><td></td></tr><tr><td> CoA </td><td> 65 mM </td><td> 600 ul </td><td> Hiçbiri </td><td></td></tr><tr><td> NAD </td><td> 175 mM, pH 7.5-8 </td><td> 300 ul </td><td> Hiçbiri </td><td> PH 7.5-8 ulaşmak için, 2 M de Tris ile titre </td></tr><tr><td> cAMP </td><td> 650 mM, pH 8 </td><td> 200 ul </td><td> Hiçbiri </td><td> PH 8 ulaşmak için, 2 M de Tris ile titre </td></tr><tr><td> Folinik Asit </td><td> 33.9 mM </td><td> 300 ul </td><td> Hiçbiri </td><td> Sadece 300 ul gerekli olmasına rağmen, ilgili ilave bilgiler reçete 1.15 ml içindir. </td></tr><tr><td> Spermidin </td><td> 1 M </td><td> 150 ul </td><td> Hiçbiri </td><td> 4 ° C&#39;de saklayın, ısı 37 ° C erime. </td></tr><tr><td> 3-PGA </td><td> 1.4 M, pH 7.5 </td><td> 3.2 ml </td><td> Hiçbiri </td><td> PH 7.5 ulaşmak için, 2 M de Tris ile titre </td></tr></tbody></table> Tablo 4. Enerji Çözümü protokol hazırlamak için Reaktifler. Ek Malzeme 1. Öğeler için tarifler. Kloramfenikol, 34 mg / ml: 0.51 g kloramfenikol hazırlayın ve 15 ml etanol ekleyin. Filtre sterilize (0.22 uM), 1 ml tüpler, daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de saklamak için alikosu. 2xYT + P + Cm agar plakası: 1.24 g 2XYT, 1 M 1.6 mi, potasyum fosfat dibazik çözeltisi, 40 ml, 1 M 0,88 ml potasyum fosfat monobazik çözeltisi, 0.6 g agar ve su hazırlayın. Otoklav. 50 ° C&#39;ye soğuması ve 40 ul Cm ekleyin. Tümbölen 25 100 x 15 mm Petri kabı içine ml, ve bir saat boyunca soğumaya bırakın. 2xYT + P medya: 124 g 2xYT, 1 M 160 ml potasyum fosfat dibasic çözümü, 4 L. Aliqu 1 M, ve su @ 88 ml potasyum fosfat monobasik çözüm hazırlayın2 x 1.88 L ve 0.24 L. otoklav içine ot. Tris baz, 2 M: 250 ml olacak şekilde 60.57 g Tris baz ve su hazırlayın. Daha sonra kullanılmak üzere oda sıcaklığında, depolama sterilize edin. DTT, 1 M: 15 ml 2.31 ​​g DTT ve su hazırlayın. Filtre sterilize (0.22 uM), 1 ml tüpler, daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de saklamak için alikosu. S30A tamponu: 10.88 g Mg-glutamat ve 24,39 g K-glutamat, 2M, (pH 7.7), asetik asit, 50 ml Tris hazırlayın ve su 2 L. Otoklav için, 4 ° C de saklamak, 4 ml 1 M DTT eklemek Kullanmadan önce. S30B tamponu: 10.88 g Mg-glutamat ve 24.39 g K-glutamat, 2 M Tris (pH 8.2) hazırlayın ve su 2 L. Otoklav, 4 ° C&#39;de mağaza, kullanımdan önce 2 ml 1 M DTT ekleyin. HEPES: 1.91 g HEPES (MW 238,21), KOH (pH 8&#39;e) hazırlayın ve su için 4 ml. tRNA: 600 ul 30 tRNA mg ve su hazırlayın. CoA: 600 ul 30 CoA (MW 767,53) mg ve su hazırlayın. NAD: 300 ul (pH 7.5-8 kadar) NAD 34.83 mg (MW 663,43), 2 M Tris ekleyin ve su. (PH 7.5-8 için çözüm getirmek için 2 M de Tris 27 ul ekleyin). cAMP: 200 ul 42,80 cAMP mg (MW 329,22), 2 M (pH 8&#39;e) ile Tris, ve su eklenir. (PH 8 için çözüm getirmek için 2 M de Tris 73 ul ekleyin). Folinik asit (33.9 mM): katı folinik asit kalsiyum tuzunun (MW 511.5) 20 mg, 1.15 mi su eklenir. Spermidin: 150 ul 23.55 spermidin ul (MW 145.25) ve su hazırlayın. 37 ° C&#39;de kısa bir süre sonra, erime oda sıcaklığında hazırlanması 3-PGA: 3.2 ml 1.03 3-PGA (MW 230,02) g, (pH 7.5), 2 M Tris, ve su eklenir. (PH 7.5 çözüm getirmek için 2 M de Tris 1,73 ml ekleyin). Nükleotidlerinide Mix: ATP dipotasyum tuzu dihidrat, 145 mg (MW 619,4), GTP disodyum tuzu 133 mg (MW 567,14), CTP disodyum tuzu dihidrat, 79.4 mg (MW 563,16), UTP trisodyum tuzu dihidrat, 82.6 mg (MW 586,12) ilave , 1.5 ml% 15 seyreltme (pH 7.5), ve su da KOH. (PH 7.5 çözüm getirmek için% 15 seyreltmede KOH 353 ul). Ek Maddesi 2. Bradford Deneyi. <ol><li> 4 ° C ile Bradford maddesi çıkarın ve oda sıcaklığında ayarlayın. </li><li> 1 mg / ml ve 0.1 mg / ml &#39;de 50 ul BSA standardı hazırlayın. </li><li> Adım 1.47 ekstrenin 40 ul 20x seyreltme hazırlayın. </li><li> 7 küvetler 800 ul su ekleyin. </li><li> 0 mg / ml, 1 mg / ml (10 ul 0.1 mg / ml BSA), 2 mg / ml (20 ul 0.1 mg / ml BSA), 4 mg / ml (4 ul 1 mg / ml BSA) standart küvetler hazırlanması , 6 mg / ml (6 ul 1 mg / ml BSA). </li><li> Örnek 2 ul ve örnek 4 ul deney küvetler için hazırlayın. </li><li> Her küvete Bradford maddenin 200 ul ekleyin ve iyice karıştırın by pipetleme. En az 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Adım 6.5 küvetler kullanılarak OD 595 nm de standart eğri üretin. Standart eğri reddetmek ise r 2 &lt;0.95. </li><li> Adım 6.6 küvetler kullanılarak OD 595 nm de ekstrakt konsantrasyonu belirleyin. </li></ol> Ek Maddesi 3. Kalibrasyon tablonuzu Tampon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">TXTL_e (şablon) _calibration_JoVE.xlsx bakın</a> . Ek Malzeme 4. Hücre içermeyen ifade elektronik tablo çalıştırın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">TXTL _JoVE.xlsx Bkz</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology at JoVE.com

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Bu beş günlük protokolü bütün adımlar, ekipman, ve esaslı etkili endojen Escherichia coli sıfırdan TX-TL hücre serbest ifade sistemi oluşturmak ve çalıştırmak için gerekli ek yazılım özetliyor. Reaktif ile protokol 8 kurulumu için saat veya daha az bir tepki toplamak ve işlem verileri alır.

Bir uygulama için Protokoller<em&gt; Escherichia coli</emSentetik Biyoloji&gt; Tabanlı TX-TL Hücre-Özgür İfade Sistemi

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free

Research

JoVE Journal

Biology

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

62.7K Görüntüleme.  California Institute of Technology.  Bu beş günlük protokolü bütün adımlar, ekipman, ve esaslı etkili endojen Escherichia coli sıfırdan TX-TL hücre serbest ifade sistemi oluşturmak ve çalıştırmak için gerekli ek yazılım özetliyor. Reaktif ile protokol 8 kurulumu için saat veya daha az bir tepki toplamak ve işlem verileri alır. 

Video: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Etkinlik Ölçüm Bir Testi Escherichia coli Lizin Decarboxyase Đndüklenebilir

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Biyoloji

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Elektrokompetan Hazırlanması için hızlı Protokolü<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Ve<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Live Algılama<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: PMA-qPCR H7 Hücreler

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Protein birlikte-ifade edilme yönlü Faydalar<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is the challenge of identifying suitable vaccine candidates. Malarial proteins expressed using prokaryotic and eukaryotic cell based expression systems are poorly glycosylated, generally insoluble and undergo improper folding leading to reduced immunogenicity. The wheat germ, rabbit reticulocyte lysate and Escherichia coli lysate cell free expression systems are currently used for expression of malarial proteins. However, the length of expression time and improper glycosylation of proteins still remains a challenge. We demonstrate expression of Plasmodium proteins in vitro using HeLa based cell free expression systems, termed &#8220;in vitro human cell free expression systems&#8221;. The 2 HeLa based cell free expression systems transcribe mRNA in 75 min and 3 &#181;l of transcribed mRNA is sufficient to translate proteins in 90 min. The 1-step expression system is a transcription and translation coupled expression system; the transcription and co-translation occurs in 3 hr. The process can also be extended for 6 hr by providing additional energy. In the 2-step expression system, mRNA is first transcribed and then added to the translation mix for protein expression. We describe how to express malaria proteins; a hydrophobic PF3D7_0114100 Maurer&#8217;s Cleft &#8211; 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, a hydrophilic PF3D7_0925900 protein and an armadillo repeats containing protein PF3D7_1361800, using the HeLa based cell free expression system. The proteins are expressed in micro volumes employing 2-step and 1-step expression strategies. An affinity purification method to purify 25 &#181;l of proteins expressed using the in vitro human cell free expression system is also described. Protein yield is determined by Bradford&#8217;s assay and the expressed and purified proteins can be confirmed by western blotting analysis. Expressed recombinant proteins can be used for immunizations, immunoassays and protein sequencing.

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression of malarial proteins in cell based systems remains challenging. We demonstrate two step and one step IVT (in vitro translation) cell free expression systems for expressing malarial recombinant rhoptry proteins from HeLa cells. We use a Ni-resin affinity based purification system to purify the rhoptry proteins.

İfadesi için HeLa Tabanlı Hücre Özgür İfade Sistemleri<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteinler

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes limitations on potential protein applications. The incorporation of noncanonical amino acids can enlarge this scope. There are two complementary approaches for the incorporation of noncanonical amino acids. For site-specific incorporation, in addition to the endogenous canonical translational machineries, an orthogonal aminoacyl-tRNA-synthetase-tRNA pair must be provided that does not interact with the canonical ones. Consequently, a codon that is not assigned to a canonical amino acid, usually a stop codon, is also required. This genetic code expansion enables the incorporation of a noncanonical amino acid at a single, given site within the protein. The here presented work describes residue-specific incorporation where the genetic code is reassigned within the endogenous translational system. The translation machinery accepts the noncanonical amino acid as a surrogate to incorporate it at canonically prescribed locations, i.e., all occurrences of a canonical amino acid in the protein are replaced by the noncanonical one. The incorporation of noncanonical amino acids can change the protein structure, causing considerably modified physical and chemical properties. Noncanonical amino acid analogs often act as cell growth inhibitors for expression hosts since they modify endogenous proteins, limiting in vivo protein production. In vivo incorporation of toxic noncanonical amino acids into proteins remains particularly challenging. Here, a cell-free approach for a complete replacement of L-arginine by the noncanonical amino acid L-canavanine is presented. It circumvents the inherent difficulties of in vivo expression. Additionally, a protocol to prepare target proteins for mass spectral analysis is included. It is shown that L-lysine can be replaced by L-hydroxy-lysine, albeit with lower efficiency. In principle, any noncanonical amino acid analog can be incorporated using the presented method as long as the endogenous in vitro translation system recognizes it.

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

Bir Kullanarak Modeli Proteinler içine Kuralsız Amino Asit kalıntı özgü Ortaklığın<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hücre içermeyen Transkripsiyon-çeviri Sistemi