Biz Pr teşekkür ederim. Yardımcı teknik tavsiye ve amoebal kokültürü ve amoebal zenginleştirme üzerine ilginç bir tartışma için Bernard La Scola. Biz de bizim laboratuvarda tekniği uygulayarak yaptığı yardım için Dr Vincent Thomas teşekkür ederim.

1.. Amoebal Coculture 1.1 Numune hazırlama <ol><li> Çevre örnek <ol><li> Su örnekleri 0.22 mikron gözenek boyutlu zar boyunca su örnek (1 L için 500 mi) filtre. Sonra, (Page&#39;in amip tuzlu orta PAS zarı sallamak NaCl 120 mg, MgSO 4 4 mg • 7H 2 O, CaCl 2 4 mg • 2H 2 O, Na 2 HPO 4 142 mg, ve KH 136 mg damıtılmış su, 1 L 2 PO 4). </li><li> Katı örnekler Damıtılmış su veya PBS içinde aktif çamur gibi kir veya kum örnekleri ve yarı-katı numuneler gibi katı örneklerin yeniden süspanse edin ve 0.22 um gözenek boyutlu zar aracılığıyla filtre. Daha sonra, PAS olarak membran sallayın. </li><li> Yüksek endojen amip ve protozoa kontamine numuneler İlk düşük hızda santrifüj (180 xg) fo tarafından örnekleri sedimentr 10 dakika ya da bir 5 um gözenek boyutu membrandan filtre. Bundan başka 1.1.1 olarak, süpernatan (sırasıyla Süzüntü) işlem. Not: 30 dakika boyunca 50 ° C&#39;de ısıtın örnek veya asidik ya da bazik çözeltiler 14 ile tedavi: diğer arındırma teknikleri daha çevre örnekleri temizlemek için kullanılabilir. </li></ol></li><li> Klinik örnek Kendi fiziko-kimyasal özelliklerine bağlı olarak, klinik örnekleri işleyin. Büyük kirleri çıkarmak için filtre veya santrifüj sıvılar. Katı örnekleri süspanse edin. , Doku kullanımı bir Dounce homogeneiser veya cam boncuklar kullanılarak, örneğin, onlara eziyet, hücre içi bakteri ve boşaltmak için, hücreleri parçalamak için. </li></ol> 1.2 Amip hazırlık <ol><li> Et suyu hazırlama ; Proteoz pepton, 100 g maya ekstresi, 10 g, MgSO 4 • 7H 2&#39;nin 4.9 g pepton, maya özütü ve glikoz (PYG ihtiva eden bir zengin ortam: Aşağıdaki ortamını hazırlayınO, sodyum sitrat 5 g • 2H 2 O, Fe (NH4) 0.1 g 2 (SO4) 2 • 6H 2 O, KH 2 PO 4, Na 2 HPO 4, 1.97 g, 1.7 g • 7H 2 O , glukoz 45 g, ve distile su 5 L CaCI2 0.295 g) ve bu Acanthamoeba türler için PAS gibi besleyici olmayan ortamı. </li><li> Amoebal kültür <ol><li> PYG ortamı 30 ml ihtiva eden hücre kültürü şişelerinde 25 ° C&#39;de amipler (tercihen Acanthamoeba castellanii ATCC 30010 veya A. polyphaga Linc-Ek 1) geliştirin. </li><li> Şişenin sert bir şekilde sallama ile amipler hasat ve 1500 x g 10 dakika boyunca hücre süspansiyonu santrifüj. PAS ortamı ile iki kez pelet yıkayın. Bir Kova slayt hücreleri saymak ve ml başına 5 x 10 5 hücre süspansiyonu elde etmek için ses seviyesini ayarlayın. </li><li> Mikroplakalar içine amoebal süspansiyonu aktarın. Ve 24 w 1 - 12 için kuyu başına ml kullanınell plakalar, 48-yuvalı plakalar ve 96-yuvalı plakalar 300 ul için 500 ul. 25 ° C&#39;de en az 2 saat boyunca inkübe mikroplak Bu iyi sedimantasyon ve amip bağlanma her alt sağlar. </li></ol></li></ol> 1.3 Coculture <ol><li> Örnek aşılama <ol><li> Seyreltilmemiş numune 100 ul ile başlanarak, genellikle 10-kat seyreltme serisi ile, 1.1 veya 1.2 &#39;den örnek seri seyreltileri ile 2.3.3 gelen plaka inoküle. </li><li> Numune içindeki mikroorganizmaların potansiyel olarak amoebal çim tortu, 10 dakika boyunca 1800 x g&#39;de santrifüje mikroplak. Bu amip tarafından temas ve mikroorganizmaların fagositozu artırır. </li><li> 25 ° C &#39;de 45 dakika boyunca inkübe edilir ve taze PAS ile ortam değiştirerek PAS ile üç kez yıkayın. Bakteri oluşumuna bağlı olarak (streptomisin, penisilin, gentamisin ve / veya vankomisin) veya antibiyotik ilave edilmeden PAS oyuk başına 1 ml, eklemearanır al türler. </li><li> Amip bir kese içine alma önlemek için nemli bir atmosferde 32 ° C&#39;de inkübe mikroplak. Amipler istila ve lize bakteri varlığını tespit etmek için bir 20x objektif ile günlük olarak her biri de dikkate alınmalıdır. </li><li> Lizis durumunda, yaklaşık 10 5 amipler / cm 2 arasında bir tek tabaka ile alt kültürleri olarak 100 ul inokülasyon taze amip bir alt kültür gerçekleştirin. Özellikle verilen bir bakteri türünü izole etmek, bu bakterilerin (Legionella spp yani BCYE agar.) Için tasarlanmış özel ağar medya da aşılamak. </li><li> Liziz yokluğunda, 4-7 gün, ilk aşılamadan sonra alt kültürleri olarak, 100 ul almak ve bir 24 oyuklu bir plaka içerisinde 900 ul taze bir amoebal kültürü inoküle. Amip hızlı liziz bakterilerin çoğalması olmadan gözlenirse, bir virüs mevcut olabilir. Bu durumda, 0.22 um&#39;lik filtre ile süpernatan ve taze amipler bulaştırmak için süzüldü süspansiyon kullanmak. </li></ol&gt; </li></ol> 1.4 Bakteriyel izolasyon ve karakterizasyonu <ol><li> Bakteriyel boyama Mikroplakalar 24 kuyuda cam lamelleri doğrudan cocultures gerçekleştirin. Ortamı çıkarın ve boyama veya immünofloresan gerçekleştirin. <ol><li> Modifiye Romanowsky boyama <ol><li> Lamel kurumasını bekleyin. Lamel fiksatif solüsyonu (2 mg / L Hızlı Yeşil metanol) beş kez daldırın. </li><li> Boyama çözeltisi içinde beş kez lamel daldırın I (1.22 g / L Eosine G fosfat tamponu pH 6.6) </li><li> Son olarak, boyama çözeltisi II (fosfat tamponu pH 6.6 içinde 1.1 g / L tiazin) &#39;de lamel 5 kez bırakın. </li><li> Damıtılmış su ile örnek durulayın. Kuruması ve mikroskobu ile gözlemlemek. </li></ol></li><li> Ziehl-Neelsen boyama <ol><li> Lamel kurumasını bekleyin. Ziehl fuksin ile örnek örtün. Buharlar ortaya çıkıncaya kadar bir alev ile boya ısıtın. </li><li> En az 5 dakika boyunca oda sıcaklığında soğumayave distile su ile durulayın. 2 dakika süreyle izopropanol içinde% 3 hidroklorik asit çözeltisi ile örnek örtün ve damıtılmış su ile yıkayın. </li><li> Metilen mavisi ile 30 saniye için Kapak ve distile su ile durulayın. Kuruması ve mikroskopi 22 ile gözlemlemek. </li></ol></li><li> Gimenez boyama <ol><li> 100% 10 bazik fuksin ml (100 ml,% 95 etanol içinde bazik fuksin 10 g), 250 ml% 4 sulu fenol ve damıtılmış su, 650 ml karıştırılarak bir bazik fuksin stok çözelti hazırlayın. Kullanımdan önce 48 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Lamel alev geçirilerek kuru ve düzelteyim. 2 dakika boyunca (10 ml 0.1 M sodyum fosfat tampon maddesi, pH 7.45 olarak bazik fuksin stok çözeltisi 4 mi), henüz süzüldü bazik fuksin ile örnek örtün. </li><li> Su ile durulayın ve örnek 10 saniye boyunca malakit yeşil (distile su içinde% 0.8) inkübe edilir. Tekrar su ile durulayın ve malakit yeşil lekelenme tekrarlayın. Tekrar su ile yıkayın. Lamel kurumaya bırakın, mBunu ount ve mikroskopi 23 ile gözlemlemek. </li></ol></li><li> İmmünofloresan <ol><li> 10 dakika boyunca% 4, 5 dakika için ya da paraformaldehid ile metanol içinde inkübe edilerek lamel sabitleyin. </li><li> PBS ile üç kez yıkanır ve oda sıcaklığında (PBS içinde% 0.1 saponin,% 5 BSA) bloke etme çözeltisi 2 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> Ilgi konusu mikroorganizmanın karşı oluşturulan antikorlar ihtiva eden bloke etme çözeltisi içinde 1 saat boyunca inkübe lamel. </li><li> PBS içinde tekrar üç kez yıkayın ve birincil antikor karşı ve bir florofor ile bağlantılı ikinci bir antikor ile 1 saat boyunca inkübe edilir. PBS ile üç kez yıkayın, lamel montaj ve floresan mikroskobu ile gözlemlemek. </li></ol></li></ol></li><li> PCR ile DNA tespiti Amoebal birlikte-kültür, 100 ila 200 ul DNA ekstrakte edin. Bu tür mikobakteri 24 gibi ilgi türler için 16S rRNA geni ya da spesifik primerlerin hedef evrensel primerler ile mikroorganizmaların Algılama, Legionella 25 ya da 26 Chlamydiales üyeleri. </li></ol> 2. Amoebal Zenginleştirme 2.1. Örnek hazırlanması Vorteks tarafından PAS katı ve yarı-katı örneklerin tekrar. 10 dakika için düşük hızda (180 xg) de süspansiyonu santrifüj. Bu pelet serbest-yaşayan amip zenginleştirme sağlar. Süpernatan amoebal ortak kültürü ve amoebal zenginleştirme 21 için pelet için kullanılabilir. 2.2. Orta hazırlık <ol><li> PAS, 100 ml agar 1.5 g eklenir ve 121 ° C&#39;de 15 dakika ortam otoklav Petri tabaklarında sıcak orta dökün ve oda sıcaklığında katılaşan sağlar. </li><li> 37 ° C de bir gece boyunca LB suyu ya da tioglikolat in Escherichia coli (ATCC 25922) büyümek PBS ile iki kez yıkanır ve bakteri PAS ortamı içine tekrar süspansiyon. PAS 10x sulandırmak ve PAS agar plaka üzerinde bu seyreltme 2-3 ml yayılır ve kurumaya bırakın. </li></ol> Plaka bir tarafında örneğin bir damla (veya filtre bir parça) ilave edilir ve bu çanak merkezinde bir çizgi oluşturacak şekilde Petri çanağı üzerinde akış sağlar. 2.4. Amoebal büyüme ve amoebal altkültür <ol><li> Günlük Petri gözlemleyin. Bir amoebal göç ön tespit edilirse, göç ön agar küçük bir parça kesip ve E. bir çim ile kaplı taze NNA Petri aşılamak coli. </li><li> Verilen amoebal soyunun saf kültür elde etmek için, numunenin saflığı bağlı olarak reinoculation birkaç kez tekrarlayın. </li></ol> 2.5. Amip ve bakteri karakterizasyonu <ol><li> Hücreleri kazıyın ve PAS bunları tekrar süspansiyon. </li><li> Özü DNA ve PCR ve dizileme (bakteriler için 16S rRNA amplifikasyon, resp. 18S rRNA amip ve dizileme için, örneğin) ile amip ve / veya bakteriyel endosimbiyont kimliğini belirler. </li> &lt;li&gt; taze amipler aşılamak ve numunede muhtemelen mevcut bakteri tespit etmek için, bir birlikte-kültür amoebal gerçekleştirmek için PAS bu hücreler kazınmış kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Fraser, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionnaires'+disease:+description+of+an+epidemic+of+pneumonia.">Legionnaires' disease: description of an epidemic of pneumonia.</a> New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).</li><li>McDade, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionnaires'+disease:+isolation+of+a+bacterium+and+demonstration+of+its+role+in+other+respiratory+disease.">Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease.</a> New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).</li><li>Rowbotham, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+report+on+the+pathogenicity+of+Legionella+pneumophila+for+freshwater+and+soil+amoebae.">Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae.</a> J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).</li><li>Rodriguez-Zaragoza, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecology+of+free-living+amoebae.">Ecology of free-living amoebae.</a> Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).</li><li>Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+distribution+of+Acanthamoeba+species+genotypes+associated+with+nonkeratitis+infections.">Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections.</a> J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).</li><li>Brussow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+between+protists+and+phages:+from+antipredation+strategies+to+the+evolution+of+pathogenicity.">Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity.</a> Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).</li><li>Greub, G., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microorganisms+resistant+to+free-living+amoebae.">Microorganisms resistant to free-living amoebae.</a> Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).</li><li>Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-living+amoebae+and+their+intracellular+pathogenic+microorganisms:+risks+for+water+quality.">Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality.</a> FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).</li><li>Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia-like+obligate+parasite+of+free-living+amoebae.">Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae.</a> Lancet. 349, 925-926 (1997).</li><li>Amann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obligate+intracellular+bacterial+parasites+of+acanthamoebae+related+to+Chlamydia+spp.">Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).</li><li>Birtles, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidatus+Odyssella+thessalonicensis'+gen.+nov.,+sp.+nov.,+an+obligate+intracellular+parasite+of+Acanthamoeba+species.">Candidatus Odyssella thessalonicensis' gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species.</a> Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).</li><li>Thomas, V., Casson, N., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Criblamydia+sequanensis,+a+new+intracellular+Chlamydiales+isolated+from+Seine+river+water+using+amoebal+co-culture.">Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture.</a> Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).</li><li>Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+amoeba-resisting+bacteria+from+water+in+human+environment+by+using+an+Acanthamoeba+polyphaga+co-culture+procedure.">Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure.</a> Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).</li><li>Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodiversity+of+amoebae+and+amoebae-resisting+bacteria+in+a+drinking+water+treatment+plant.">Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant.</a> Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).</li><li>Corsaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Chlamydiales+strains+isolated+from+a+water+treatment+plant.">Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant.</a> Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).</li><li>Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waddlia+chondrophila+enters+and+multiplies+within+human+macrophages.">Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages.</a> Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).</li><li>Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permissivity+of+Vero+cells,+human+pneumocytes+and+human+endometrial+cells+to+Waddlia+chondrophila.">Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila.</a> Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).</li><li>Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permissivity+of+fish+cell+lines+to+three+Chlamydia-related+bacteria:+Waddlia+chondrophila,+Estrella+lausannensis+and+Parachlamydia+acanthamoebae.">Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).</li><li>Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+amplification+and+sequencing+of+the+16S+ribosomal+DNA+of+an+intracellular+Legionella+species+recovered+by+amoebal+enrichment+from+the+sputum+of+a+patient+with+pneumonia.">Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia.</a> FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).</li><li>Rowbotham, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Legionella+pneumophila+serogroup+1+from+human+feces+with+use+of+amebic+cocultures.">Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures.</a> Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).</li><li>Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoebae-resisting+bacteria+isolated+from+human+nasal+swabs+by+amoebal+coculture.">Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture.</a> Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).</li><li>Isenberg, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Clinical microbiology procedures handbook. , (1992).</li><li>Gimenez, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+Rickettsiae+in+Yolk-Sac+Cultures.">Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures.</a> Stain Technol. 39, 135-140 (1964).</li><li>Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodiversity+of+amoebae+and+amoeba-resisting+bacteria+in+a+hospital+water+network.">Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).</li><li>Miyamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+seminested+PCR+method+for+detection+of+Legionella+species+and+its+application+to+surveillance+of+legionellae+in+hospital+cooling+tower+water.">Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).</li><li>Lienard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+chlamydiales-specific+real-time+PCR+and+its+application+to+respiratory+clinical+samples.">Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).</li><li>Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+mycobacteria+from+soils+at+an+illegal+dumping+site+and+landfills+in+Japan.">Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan.</a> Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).</li><li>Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodiversity+of+amoebae+and+amoeba-associated+bacteria+in+water+treatment+plants.">Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants.</a> Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).</li><li>La Scola, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+drancourtii+sp.+nov.,+a+strictly+intracellular+amoebal+pathogen.">Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen.</a> Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).</li><li>Thomas, V., Casson, N., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Afipia+and+Bosea+strains+isolated+from+various+water+sources+by+amoebal+co-culture.">New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture.</a> Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).</li><li>La Scola, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoeba-resisting+bacteria+and+ventilator-associated+pneumonia.">Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia.</a> Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).</li><li>Collingro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+an+environmental+Chlamydia+strain+from+activated+sludge+by+co-cultivation+with+Acanthamoeba+sp.">Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp.</a> Microbiology. 151, 301-309 (2005).</li><li>Lienard, J., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrella+lausannensis,+a+new+star+in+the+Chlamydiales+order.">Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order.</a> Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).</li><li>La Scola, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+virus+in+amoebae.">A giant virus in amoebae.</a> Science. 299, 2033 (2003).</li><li>Boyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+Marseillevirus+highlights+the+role+of+amoebae+as+a+melting+pot+in+emergence+of+chimeric+microorganisms.">Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).</li><li>Thomas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lausannevirus,+a+giant+amoebal+virus+encoding+histone+doublets.">Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets.</a> Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).</li><li>Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+infection+of+a+technician+by+mimivirus.">Laboratory infection of a technician by mimivirus.</a> Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).</li><li>Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parachlamydia+acanthamoebae,+an+emerging+agent+of+pneumonia.">Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia.</a> Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).</li><li>Lamoth, F., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoebal+pathogens+as+emerging+causal+agents+of+pneumonia.">Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).</li><li>Lienard, J. G., Ashbolt, K., Sen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+6.">Ch. 6.</a> Environmental microbiology, current technology and water applications. , 143-162 (2011).</li><li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment.">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environ. Microbiol. , (2012).</li><li>Ovrutsky, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooccurrence+of+Free-Living+Amoebae+and+Nontuberculous+Mycobacteria+in+Hospital+Water+Networks,+and+Preferential+Growth+of+Mycobacterium+avium+in+Acanthamoeba+lenticulata.">Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Amoebal kokültürü ve amoebal zenginleştirme birçok yeni bakteriyel ve amoebal türlerin izole izin etkili yöntemlerdir. Bu yöntemler ile elde edilen sonuçlar amip ve ortamda amip dirençli bakterilerin hem her yerde varlığını doğrulamak, ve en ilginci böyle klorlama ve ozonlama gibi kimyasal tedaviler ile kontrol olarak kabul edilir sentetik su şebekelerinde. Amoebal kokültürü ve amoebal zenginleştirme yalıtmak ve yetiştirmek bu potansiyel patojen mikroorganizmalar ve daha sonra da biyoloji ve patog...

Moleküler tanı gelişiyle önce, çevre nişler ya da klinik örneklerde mevcut mikroorganizmalar genellikle ağırlıklı Petri yemekleri ağar üzerinde, farklı seçici medya yetiştirilmesi tarafından tespit edildi. Bakteri kolonileri ve bunların metabolik aktivite fenotip daha sonra türler düzeyinde bakteri sınıflandırma izin verdi. Et suyu, aynı zamanda algılama hassasiyeti arttırmak için kullanılabilmektedir. Ancak, her iki teknik de bu ortama yavaş ya da büyür bakterilerin kurtarma izin yoktur. Bu moleküler yaklaşımlar çok yaygın günümüzde kullanılan nedeni budur. Bununla birlikte, DNA tespiti bakterilerin canlılığı üzerindeki herhangi bir ipucu sağlar. Ayrıca, aksine kültüre, moleküler yaklaşımlar daha fazla karakterize edilebilir bir suş içerisinde sonuçlanmaz. Büyümeye katı ortam ya da ihtiyaç hücreleri üzerinde zayıf büyüyecek patojenlerin incelenmesi karmaşıktır. Bunların çoğu bakteriler titiz intr olan &quot;zor büyümek&quot;aselüler bakteriler, genellikle keşfedilen ve Legionella pneumophila için olduğu gibi büyük salgınlar sonrasında karakterizedir. Bu bakteri bir Amerikan Lejyonu kongre sırasında meydana gelen bir salgın aşağıdaki karakterize edildi. Birçok 182 olarak kişi enfekte ve 29 nedeniyle ağır pnömoni 1,2 ölmüştür. Daha sonra amip doğal bu bakterinin ana ve otel klima sistemi ve su şebekelerinde onların varlığı sözde Lejyoner hastalığının 3 salgının kökeni olduğunu olduğu gösterilmiştir. Amipler dünya çapında bulunur ve toprak, hava, su ve (4 gözden), insan gönüllülerin burun mukozasından izole edilmiştir. Bu &quot;serbest yaşayan&quot; Amiblerden genellikle ortamında özerk bölünmesi ama bazen müsamahakar ana 5. istila edebilir. Hy tarafından fagositoz ve sonraki lizozomal sindirim yoluyla çeşitli mikroorganizmalar üzerinde Amip beslemedrolases 6. Birçok fakültatif veya zorunlu hücre içi bakteri sindirim direnmek ve böylece bulaştırmak ve örnek Legionella, Chlamydia ilişkili bakteriler veya mikobakteriler gibi amip bölmek (7 gözden ve 8) edebiliyoruz. Serbest yaşayan amipler olasılıkla henüz keşfedilmiş değil hücre içi bakteriler için önemli bir potansiyel rezervuar temsil eder. Bu Lozan&#39;da farklı gruplar çeşitli çevresel örneklerde 9-15 birkaç yeni zorunlu hücre içi mikroorganizmaları izole etmek için izin amoebal kokültürü ve amoebal zenginleştirme denilen iki ana tekniklerini uygulamak, bizim grup yol açtı. Amip bakteriler üzerinde otlatma profesyonel fagositlerdir yana, fagositoz direnmek ve bu protistler içinde büyümek mümkün bir bakteri aynı zamanda insan fagositler kolonize ve insanlara karşı patojenik olabilir. Bu, kısmen, Waddlia CHO gibi bir Chlamydia ile ilgili bakteriler için gösterilmiştirndrophila. W. chondrophila amip değil, aynı zamanda örneğin memeli epitel hücreleri, makrofajlar ve balık hücre hatları 16-18 gibi çeşitli hücre tiplerinde, sadece büyüyebilir. Amoebal kokültürü da ağır farklı bakteri türlerinin 21 ile kontamine dışkı gibi klinik örneklerde 19,20, hücre içi bakterilerin saptanması için ilgili görünür. Aksenik ortam üzerinde amip (b) büyüme ve Escherichia coli bakteriyel çim ve (c) seçimi ve karakterizasyonu; Burada çevresel veya klinik örneklerin (a) tedavisi dahil olmak üzere, ortak kültürü amoebal ve amoebal zenginleştirme en önemli adımları açıklar hücre içi bakteri.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose monohydrate</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>108342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m pore size membrane</td>
			<td>Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td>SCVPU11RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteose peptone</td>
			<td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>211693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>353135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kova slide</td>
			<td>Hycor, Indianapolis, IN</td>
			<td>87144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture microplates</td>
			<td>Corning Inc, Corning, NY</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diff-Quik staining kit</td>
			<td>Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany</td>
			<td>130832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ziehl fuchsin</td>
			<td>Fluka, St-Louis, MI</td>
			<td>21820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic fuchsin</td>
			<td>Sigma, St-Louis, MI</td>
			<td>857843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma, St-Louis, MI</td>
			<td>P1037</td>
			<td>Corrosive and mutagenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>malachite green oxalate</td>
			<td>Fluka, St-Louis, MI</td>
			<td>63160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma, St-Louis, MI</td>
			<td>84510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches

Bu tür Legionella, mikobakteriler ve Chlamydia benzeri organizmalar olarak hücre içi patojenler genellikle tüm genellikle bakteri yetiştirmek için kullanılan seçici ortam üzerinde zayıf ya da büyür, çünkü izole etmek zordur. Bu nedenle, bu patojenlerin çoğu sadece son zamanlarda keşfedilen veya önemli salgınlar takip edildi. Bu patojenler genellikle konakçı hücre olarak görev yapar ve bakterilerin hayatta kalması ve büyümesi sağlayan amip ile ilişkilidir. Amoebal kokültürü ve amoebal zenginleştirme: Biz klinik veya çevre örneklerinde hücre içi patojenlerin izolasyonu ve karakterizasyonu mevcut izin iki teknik bir gösteri sunmak için buradayız niyetinde. Amoebal kokültürü numunede mevcut olan hücre içi bakteri tarafından enfekte edilmiş ve lize edilebilir bir amoebal çim üzerine aşılanması ile incelenen örnek, hücre içi bakterilerin iyileşme sağlar. Amoebal zenginleştirme klinik ya da çevresel örneklemde amip kurtarma mevcut sağlar. Thama aynı zamanda bu amip özellikle büyüyen yeni hücre içi bakteri yeni amoebal türlerin keşfine yol açabilir edilir. Birlikte, bu iki teknik amip büyümek mümkün yeni hücre içi bakteri keşfetmek için yardımcı olur. Çünkü amipler enfekte ve fagositoz karşı yetenekleri nedeniyle, bu hücre içi bakteri da makrofajlar tarafından fagositoz kaçış olabilir ve bu nedenle, daha yüksek ökaryotlar için patojenik.

Amoebal kokültürü ve amoebal zenginleştirme kullanarak, çevresel ve / veya patojenik bakterilerin bir dizi (Tablo 1) keşfedildi. Amoebal kokültürü çevre örnekleri, su arıtma tesisleri ve su dağıtım sistemleri analiz etmek bizim grup ve başkaları tarafından kullanılmıştır. Mikroorganizmaların geniş bir yelpazede bu teknik ile izole edilebilir. Amoebal kokültür izole en yaygın bakteri su arıtma tesislerinden ve su şebekeleri 13,14,24,27,28</su...

Watch this Scientific Journal Video about Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches at JoVE.com

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Amoebal kokültürü seçici gibi amip ve makrofajlar gibi fagositik hücrelere karşı mümkün hücre içi patojenleri büyümesi yapışık amipler kullanarak bir hücre kültür sistemi. Bu yüzden, yeni enfeksiyöz ajanlar keşfetmek için önemli bir aracı temsil eder. Amoebal zenginleştirme amoebal yeni türlerin ve bunların özel hücre içi bakteri keşfini sağlar.

Amoebal kokültürü ve Amoebal Zenginleştirme Yaklaşımlar New hücre içi patojenlerin keşif

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

discovery-new-intracellular-pathogens-amoebal-coculture-amoebal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.4K Görüntüleme.  University Hospital Center and University of Lausanne.  Amoebal kokültürü seçici gibi amip ve makrofajlar gibi fagositik hücrelere karşı mümkün hücre içi patojenleri büyümesi yapışık amipler kullanarak bir hücre kültür sistemi. Bu yüzden, yeni enfeksiyöz ajanlar keşfetmek için önemli bir aracı temsil eder. Amoebal zenginleştirme amoebal yeni türlerin ve bunların özel hücre içi bakteri keşfini sağlar. 

Video: Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact cellular functions, including energetics and signal transductions. While both fluorescent and electrophysiological methods, including electrode usage and patch-clamping, have been well developed for measuring these events in eukaryotic cells, methodology for measuring similar events in microorganisms have proven more challenging to develop given their small size in combination with the more complex outer surface of bacteria shielding the membrane. During our studies of death-initiation in Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), we wanted to elucidate the role of membrane events, including changes in polarity, integrity, and intracellular ion concentrations. Searching the literature, we found that very few studies exist. Other investigators had monitored radioisotope uptake or equilibrium to measure ion fluxes and membrane potential and a limited number of studies, mostly in Gram-negative organisms, had seen some success using carbocyanine or oxonol fluorescent dyes to measure membrane potential, or loading bacteria with cell-permeant acetoxymethyl (AM) ester versions of ion-sensitive fluorescent indicator dyes. We therefore established and optimized protocols for measuring membrane potential, rupture, and ion-transport in the Gram-positive organism S. pneumoniae. We developed protocols using the bis-oxonol dye DiBAC4(3) and the cell-impermeant dye propidium iodide to measure membrane depolarization and rupture, respectively, as well as methods to optimally load the pneumococci with the AM esters of the ratiometric dyes Fura-2, PBFI, and BCECF to detect changes in intracellular concentrations of Ca2+, K+, and H+, respectively, using a fluorescence-detection plate reader. These protocols are the first of their kind for the pneumococcus and the majority of these dyes have not been used in any other bacterial species. Though our protocols have been optimized for S. pneumoniae, we believe these approaches should form an excellent starting-point for similar studies in other bacterial species.

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Unlike that seen for eukaryotes, there is a paucity of studies that detail membrane depolarization and ion concentration changes in bacteria, primarily as their small size makes conventional methods of measurement difficult. Here, we detail protocols for monitoring such events in the significant Gram-positive pathogen Streptococcus pneumoniae utilizing fluorescence techniques.

Membran Kutup, Membran Dürüstlük ve Hücre içi İyon Konsantrasyonlarında İzleme değişiklikler<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Floresan boyalar kullanarak

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

Floresan Nanopartiküller Uygulama Hücre içi Bakteri tarafından Endo-lizozomal Sistemi Modelleme Eğitim için

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

Fırsatçı mantar patojenlere bir Floresan etiketli geninin biyolistik transformasyonu<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

16S rRNA gen Sıralama ve MALDI-TOF MS tarafından Nadir Bakteriyel patojenlerin tanımlanması

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

Nano PCR ile Hayvan Örnekler Solunum Patojenler yüksek verimlilik Algılama

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

Zika virüs belirli tanılama Epitope bulma

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Patojenler, Commensals ve ana bilgisayar bağırsak epitel arasındaki etkileşimler çalışmaya insan Colonoid Monolayers

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...