Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü İntramural Araştırma Programı tarafından kısmen desteklenen ve NCI tarafından UA5CA152907 hibe edildi.

Koúullanmıú Medya 1. Toplama Anjiyogenik Potansiyel için Test <ol><li> Doğal ya da düşük serum ortamında anjiyojenik veya anti-anjiyojenik potansiyeli için test edilecek olan primer ya da ölümsüzleştirilmiş hücrelerin büyümesine ve koşullu ortam toplanır. <ol><li> Seçenek olarak ise, kullanım anında ortamla veya numune alınır ve birkaç ay boyunca -80 ° C&#39;de saklanır. Bir negatif kontrol olarak, doğal ya da nonconditioned düşük serum ortamı kullanın ve bir pozitif kontrol olarak sigara durumunu tam büyüme ortamı (% 10 FBS, ya da uygun bir konsantrasyonunu) kullanır. Seçenek olarak ise, angiogenesisin potansiyel uyarıcıları test etmek için ve söz konusu spesifik proteinlerin bilinen konsantrasyonları ile ek büyüme faktörlerini de eksik karakalem sıyrılmış ortam, tek başına büyüme faktörü içermeyen ortam ile karşılaştırın. </li></ol></li></ol> Testi öncesinde Endotel Hücreleri 2. Hazırlık <ol><li> Tahlil etmek için iki gün önce, yeni bir T-75 balon içine pasaj 3B-11 hücreleri. Geçiş hücre sayısı önemlidir. Hücreler, ikinci ve altıncı geçiş arasında olduğunda bu deney, en iyi şekilde çalışır. Tahlil endotel hücreleri, ikinci önce veya onuncu geçişinden sonra kullanıldığında eğer iyi çalışmaz. </li><li> DMEM içinde 24 saat boyunca büyütün hücreleri,% 10 FBS, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiştir. </li><li> Aşağıdaki gibi bir gün deneyden önce serum 3B-11 hücreleri açlıktan öldürmek: <ol><li> 3B-11 hücrelerinden medya aspire. </li><li> DMEM ekleme olmaksızın düşük serum ortamında% 0.2 FBS, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiştir. </li><li> Ek bir 24 saat daha hücrelerin büyümesine. </li></ol></li></ol> Assay önce Ayıraçların 3. hazırlanması NOT: BME konsantrasyonları çok bağlıdır oldukça değişkendir. Konsantrasyon ml / nedenle BME üretici sağlamak için satın alınmasından önce içindeki sokulması gerekir 10 mg&#39;dan az ise, BME iyi çalışmazBir yeterince konsantre sürü edinimi. <ol><li> Defrost buzdolabında büyüme faktörü BME azalır. Ilık BME katılaşır, bu yüzden kullanımdan önce, soğuk tutulmalıdır. BME, birkaç hafta içinde, soğutma altında depolanabilir ya da parçalara ayrılmış ve -80 ° C de dondurulabilir. </li><li> Bir azaltılmış büyüme faktörü BME geleneksel BME&#39;de tercih edilir. BME&#39;de anjiyojenik faktörlerin eksikliği daha kolay klimalı ortam tüp oluşumu üzerindeki gelen faktörler etkisini gözlemlemek için yapacaktır. </li><li> Çözülme medya test edilecek. </li></ol> Assay hemen önce Endotel Hücreleri 4. hazırlanması <ol><li> Yıkama 3B-11, DPBS hücreler. <ol><li> Flüoresan veya konfokal mikroskobu ile görselleştirme isteniyorsa, 3B-11 hücreleri yıkanmasından önce, 2 ug / ml &#39;lik bir son konsantrasyonda medya endotel hücrelerine kalsein AM ekleyin. Deneyin başlamasından önce, 37 ° C ve% 5 CO2 de karanlıkta kalsein ile etiketlenmiş hücreler yerleştirin. Stok kalsein çözülürKalsein DMSO içinde ve bir kez% 0.1 PM geçmemelidir DMSO ortam nihai konsantrasyona seyreltilir. Hücrelerden 30-45 dk yıkama Calcein AM sonra (yukarıda 4.1 adım) ve deney takip ile devam edin. </li></ol></li><li> T-75 balonuna 1 ml tripsin-EDTA ekleyerek Hücreleri tripsinize edin. </li><li> Tripsinizasyon tamamlandıktan sonra, 100 ug / ml streptomisin, bir son 10 ml DMEM hacmi,% 10 FBS, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 100 E / ml penisilin yeniden süspansiyona alınmasıyla tripsin nötralize ve. </li><li> 100 mikron hücre süzgecinden Filtre hücreleri kümeleri kaldırmak için. </li><li> 7.5 x 10 6 DMEM hücre / ml,% 10 FBS, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 100 U / ml penisilin nihai bir konsantrasyona kadar hücreleri ve süspansiyon hücreleri sayın ve 100 ug / ml streptomisin. </li></ol> 5. Tüp Oluşumu Testi <ol><li> Önce BME Prem etmez, böylece plaka yükleme 20-30 dakika boyunca buzdolabında ya da buz üzerinde 24 oyuklu bir plaka ve 1 mi uçlarınıaturely katılaşır. </li><li> Pipet, 24 oyuklu plakanın her oyuğuna indirgenmiş gelişme faktörü BME 250 ul. Dağıtım sırasında nihai durağı pipet karartıcı değil kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Yeterli BME kuyunun merkezine menisküs formları kalır özen; matrisin çok ince olması durumunda, hücreler, sadece bir tek tabaka oluşturacaktır. </li><li> CO BME katılaşmaya 2 30 dk için 37 ° C &#39;de 24-yuvalı plaka inkübe ve% 5. </li><li> BME kurduğunda, yeniden süspanse 3B-11 hücreleri (yaklaşık 75.000 hücreleri) 10 ul ile klimalı ortamın yaklaşık 300 ul karıştırın. <ol><li> Klimalı ortam ve kullanılan endotel hücre tipine bağlı olarak kaplama hücrelerinin sayısının sesini ayarlayın ve aktivite göstermek için klimalı ortamın seri dilüsyonlarını test edin. Karşılaştırırken hücreler farklı şartlarda yetiştirilmiş, ortamı koşullandırılması için kullanılan hücre sayısına koşullu ortam hacmi normale. </li></ol></li><li> Tüpler will 2-4 saat içinde oluşmaya başlar. Şartlanmış ortam anjiyojenik faktör konsantrasyonuna bağlı olarak, tepe tüp oluşumu saat ve tahlilin zamanlama 3 ile 12 arasında optimize edilmesi gerekir oluşabilir. Bunun yerine, ölümsüzleştirilmiş hücre primer endotel hücreleri ile çalışan, ilk tüp oluşumu birkaç saat geciktirilebilir. <ol><li> Borular, genellikle apoptoza uğrayacak 18 saat karıştırıldı ve endotelial hücreler içinde bozulmaya başlar. </li></ol></li><li> Tepe tüp oluşumu sırasında, dikkatli bir şekilde kuyudan aspire ortam BME üzerinde boru ağı bozmamak için. <ol><li> 1 mi DPBS, daha sonra her bir kuyucuğa aspiratı ile yıkayın. <ol><li> Anında görüntüleme için, hücreler 4.1.1 gibi kalsein AM ile boyanmıştır Bir dijital kamera veya flüoresans / konfokal mikroskop bağlı içbükey bir mikroskop kullanarak her bir göze ve görüntü boru ağına 1 ml taze DPBS ekleyin. </li><li> Daha sonra görselleştirme için tüp ağı düzeltmek ve her 4% paraformaldehid eklemek içiniyi aspire edilir ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. <ol><li> , Paraformaldehid kaldır DPBS ile iki kere yıkayın, sonra her bir oyuğa 1 ml taze DPBS ekleyin. </li><li> Birkaç tüpleri Bu işlem sırasında kırılabilir olarak önceden tespit için mikroskobik görüntü. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> Tüp Ağı 6. Kantitasyonu <ol><li> Araştırmacının tercihe bağlı olarak çeşitli şekillerde boru ağı sayısal olarak ve çeşitli bilgisayar programları, aşağıdaki parametrelerin ölçülmesi için yeteneğine sahip: Boru sayısı; döngüler / kafes sayısı; şubelerdeki / düğüm sayısı; boruların uzunluğu. </li><li> Bu tür tüp ağların ölçümü için Anjiyogenezis Analyzer eklentisi 16 Image J gibi temsil eden bilgisayar programı kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438, 932-936 (1038).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473, 298-307 (2011).</li><li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis.">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146, 873-887 (2011).</li><li>Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+and+VEGF+in+vascular+development.">Endothelial cells and VEGF in vascular development.</a> Nature. 438, 937-945 (2005).</li><li>Bouis, D., Kusumanto, Y., Meijer, C., Mulder, N. H., Hospers, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+pro-+and+anti-angiogenic+factors+as+targets+of+clinical+intervention.">A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention.</a> Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. 53, 89-103 (2006).</li><li>Ausprunk, D. H., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+and+proliferation+of+endothelial+cells+in+preformed+and+newly+formed+blood+vessels+during+tumor+angiogenesis.">Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis.</a> Microvascular research. 14, 53-65 (1977).</li><li>Chung, A. S., Lee, J., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+tumour+vasculature:+insights+from+physiological+angiogenesis.">Targeting the tumour vasculature: insights from physiological angiogenesis.</a> Nature reviews. Cancer. 10, 505-514 (2010).</li><li>Chung, A. S., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+pathological+angiogenesis.">Developmental and pathological angiogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 563-584 (2011).</li><li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis.">Tumor angiogenesis.</a> The New England journal of medicine. 358, 2039-2049 (2008).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+therapeutic+implications.">Tumor angiogenesis: therapeutic implications.</a> The New England journal of medicine. 285, 1182-1186 (1056).</li><li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laminin+and+basement+membrane+in+the+morphological+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures.">Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.</a> The Journal of cell biology. 107, 1589-1598 (1988).</li><li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+cell+tube+formation+assay+on+basement+membrane+turns+20:+state+of+the+science+and+the+art.">The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art.</a> Angiogenesis. 12, 267-274 (2009).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nature protocols. 5, 628-635 (2010).</li><li>Walter-Yohrling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+endothelial+cell+lines+as+models+of+tumor+endothelial+cells.">Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 10, 2179-2189 (2004).</li><li>Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells.">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> Journal of immunology. , 144-521 (1950).</li><li>Carpentier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+contribution:+Angiogenesis+Analyzer.">ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer.</a> ImageJ News. , (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Anjiyogenesis fizyolojik ve patolojik süreçlerde hem de yer almaktadır. Angiogenesis ile ilişkili mekanizmaların incelenmesi anjiyojenezde büyük adımlar özetlemek tahlillerin kullanımını gerektirir. Endotel hücre tüp oluşumu tahlil diğer deneylerde fazla birkaç avantaj sunar. Bu, ayarlama kolaydır nispeten pahalı olmayan, birkaç saat içinde tübülleri üretir ve nicelleştirilebilmektedir. Bundan başka, 24 ya da 96 oyuklu plakalar içinde tamamlanabilir ve bu şekilde teşvik faktörleri tanımlam...

Anjiyojenez, önceden mevcut damarlardan yeni kan damarlarının gelişimi, 1-3 iyileşmesi, organ büyüme, embriyonik gelişme ve yara da dahil olmak üzere çeşitli işlemler için hayati önem taşımaktadır. Yeni dokulara endotel hücreleri, tedarik oksijen ve besin sıralandığı kan damarları, geliştirilen, hematopoetik hücreler tarafından immün gözetim teşvik ve atık ürünleri 2,4 çıkarın. Anjiyogenesis embriyonik ve fetal gelişim sırasında kilit öneme sahiptir. Bununla birlikte, bu işlem, yara iyileşmesi, iskelet gelişimi, gebelik zamanlarında dışında veya 1-3 adet döngüsü sırasında yetişkinde çıkamamaktadır. Son iki yılda, anjiogenezisi düzenleyen önemli moleküler mekanizmalar ortaya çıkmaya başladı. Anjiyogenezis integrinler, kemokin, anjiyopoietinlerin, oksijen algılama ajanlar, kavşak moleküller ve endojen inhibitörleri 5 içeren pro ve antianjiogenik sinyalleri ile dengeli bir sıkı düzenlenmiş olaydır. Proang kezBu tür bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), platelet türevli büyüme faktörü (PDGF), epidermal büyüme faktörü (EGF) gibi sinyalleri IOGENIC endotelyal hücre endotel hücreleri, temel zara inerek proteazlar serbest reseptörleri aktive eder. Daha sonra endotel hücreleri günde 6,7 ila birkaç milimetre arasında bir oranda lahanası oluşturan çoğalır ve göç eder. Anjiyogenez, kanser, sedef hastalığı, diyabetik retinopati, artrit, astım, otoimmün hastalıklar, enfeksiyöz hastalıklar ve ateroskleroz da dahil olmak üzere, 8-10, çeşitli patolojik durum ile bağlantılıdır. Nın çeşitli hastalıklarda anjiyojenez önemi, bu işlem daha iyi tedavi edici ilaçların tasarımları için kritiktir düzenleyen genler ve anlamak için yollar. Tüp tahlili, angiogenesisin oluşumu için gerekli olan genleri veya açık alanlarının belirlenmesi için hızlı ve nicel bir yöntemdir. Üretim 1988 de tarifBu testte oluşturan prensipler endotel hücreleri bölünür ve anjiyojenik sinyal 11-13 yanıt olarak hızlı bir şekilde geçirmek için koruyabilenlerdir bulunmaktadır. Bundan başka, endotel hücrelerinin farklılaşmasına ve bazal zar özü (BME) ihtiva eden bir matris üzerinde kültürlenmiş boru benzeri yapılar oluşturmak için indüklenir. Bu borular bağlantı komplekslerinde yoluyla birbirine bağlanmaktadır ve endotel hücreleri tarafından çevrelenmiş bir lümen içerir. Tüp formasyonu en çok boru miktar ve angiogenik stimuli tipine bağlı olarak 2-6 saat içinde, bu deneyde oluşturan hızlı bir şekilde gerçekleşir. Endotelyal hücrelerin çeşitli tipleri pil ve ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri 14,15 her iki dahil olmak üzere bu deney için kullanılabilir. Bu makale için kullanılan hücre çizgisi, fare 3B-11, ama aynı yöntemi kullanılarak, HUVEC (insan) hücreleri gibi SVEC4-10 (fare) gibi endotelyal hücre hatları veya primer endotel hücreleri ile uygulanabilir. Hangi bağlı hücre çizgisi kullanılır ve endotel ce oluprf dönüştürülmüş veya non-transforme edilir, optimizasyon uygun tüp oluşumu için gerekli ideal bir zaman belirlemek için yapılan gerekecektir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="651">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:339px;">Item</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Manufacturer</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">Catalog #</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="93">
			<td height="114" rowspan="2" style="height:114px;width:339px;">Costar 24-Well Tissue Culture-Treated Plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Corning</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">3524</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="190" rowspan="2" style="height:190px;width:339px;">BD Matrigel Basement membrane matrix, Growth factor reduced</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">BD Biosciences</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">354230</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="76" rowspan="2" style="height:76px;width:339px;">Gibco 0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">25300-054</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="74">
			<td height="95" rowspan="2" style="height:95px;width:339px;">Gibco L-Glutamine 200mM (100X)</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">25030-081</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Gibco Pen Strep</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Gibco DMEM (1X)</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">11965-092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Gibco DPBS (1X)</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">14190-144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Atlas Biologicals</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">F-0500-A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Calcein AM</td>
			<td style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:124px;">C3100MP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMSO</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">4-X</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis

Anjiyogenez normal doku gelişimi ve yara iyileşmesi için önemli bir işlem, aynı zamanda bir çok patolojik durum ile ilişkili bulunmuştur. Bu protokol kullanılarak, anjiyogenez hızlı, ölçülebilir bir şekilde in vitro ölçülebilir. Birincil veya Ölümsüzleştirilmiş endotel hücre koşullu ortam ile karıştırılır ve taban membran matrisi üzerinde plakalanır. Endotel hücreler, koşullu ortam bulunan anjiyojenik sinyallerine yanıt olarak benzeri yapılar kılcal oluştururlar. Tüp oluşumu endotel hücreleri 1 saat ve lümen içeren tübüller 2 saat içinde görünmeye başlıyor içinde kendilerini hizaya başlayan hızlı bir şekilde gerçekleşir. Tüpler, zıt fazlı bir ters mikroskop kullanılarak görüntülenebilir, veya hücreler floresan veya konfokal mikroskobu ile görüntülenir ve borular deneyi öncesinde kalsein AM ile tedavi edilebilir. Şubeleşmiş / düğümleri, sayısı döngüler / kafes ya da numara veya tüplerin oluşan uzunluğunu kolayca vitr içinde bir ölçü olarak tayin edilebilirO anjiyojenez. Özet olarak, bu deney, genler ve hızlı, tekrarlanabilir ve nicel olarak promosyon veya anjiyojenezin inhibisyonuna dahil yolların belirlenmesi için kullanılabilir.

Fare 3B-11, endotel hücreleri, büyüme faktörü, katılaşmış düşük BME üzerine serpildi - Bu deneyde, ürünün Matrigel kullanıldı - ve zaman içinde takip etti. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, her iki fare veya keratinositler, fibroblastlar tarafından salgılanan anjiyojenik faktörler, zaman içinde tüp oluşumunu sağlama yeteneğine sahiptirler. Endotel hücreleri göç ve kaplama 1-2 saat içinde küçük dalları oluşmaya başlar. Maksimum tüp oluşumu önceden keratinositle...

Watch this Scientific Journal Video about Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis at JoVE.com

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Tüp formasyonu deneyi in vitro olarak anjiyojenezi ölçmek için bir hızlı, ölçülebilir bir yöntemdir. Endotel hücreler, koşullu ortam ile bir araya yerleşen ve bazal zar özü ekilir. Tüp oluşumu saat içinde meydana gelir ve yeni oluşan tübülleri kolayca ölçülebilir.

Endotel Hücre için Tüp Deneyi birleşimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Anjiyogenezin Çalışması

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

endothelial-cell-tube-formation-assay-for-vitro-study

Research

JoVE Journal

Biology

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

59.0K Görüntüleme.  American University.  Tüp formasyonu deneyi in vitro olarak anjiyojenezi ölçmek için bir hızlı, ölçülebilir bir yöntemdir. Endotel hücreler, koşullu ortam ile bir araya yerleşen ve bazal zar özü ekilir. Tüp oluşumu saat içinde meydana gelir ve yeni oluşan tübülleri kolayca ölçülebilir. 

Video: Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biyoloji

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes: Bir Anjiyogenez Çalışma in vitro model (Röportaj)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

Anjiyogenez Çalışmaları için optimize edilmiş Fibrin Jel Boncuk Testi

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic activity of vascular endothelial cells in vitro1-5. However, recently growing evidence has shown that this assay is not limited to test vascular behavior for endothelial cells. Instead, it also has been used to test the ability of a number of tumor cells to develop a vascular phenotype6-8. This capability was consistent with their vasculogenic behavior identified in xenotransplanted animals, a process known as vasculogenic mimicry (VM)9. There is a multitude of evidence demonstrating that tumor cell-mediated VM plays a vital role in the tumor development, independent of endothelial cell angiogenesis6, 10-13. For example, tumor cells were found to participate in the blood perfused, vascular channel formation in tissue samples from melanoma and glioblastoma patients8, 10, 11. Here, we described this tubular network assay as a useful tool in evaluation of vasculogenic activity of tumor cells. We found that some tumor cell lines such as melanoma B16F1 cells, glioblastoma U87 cells, and breast cancer MDA-MB-435 cells are able to form vascular tubules; but some do not such as colon cancer HCT116 cells. Furthermore, this vascular phenotype is dependent on cell numbers plated on the Matrigel. Therefore, this assay may serve as powerful utility to screen the vascular potential of a variety of cell types including vascular cells, tumor cells as well as other cells.

A tube formation assay is used to evaluate vascular activity of tumor cells.

Tümör Hücrelerinin vaskülojenik Faaliyet değerlendirin bir Matrigel Tabanlı Tüp Oluşumu Testi

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

KRİYOPREZERVE Numune Kurtarma için Do-It-Yourself Aygıt yanlışlıkla Kriyojenik Depolama Tankları içine Dropped

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Sıçan mezenter eksteriorizasyon: Anjiogenez ilgilendim Hücresel Dinamikler araştırılması için Bir Model

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörlerinin Değerlendirilmesi için Basit Biyoassay

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.