Name: application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria
Uploaded: 2015-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria at JoVE.com

This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 &#8216;Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments&#8217; and HE1964/18 within priority program 1580.

10 nm Altın nanopartiküller (Altın NPS) 15 1. sentezi <ol><li> Çözelti A hazırlayın: 160 mi Milli-Q, ya da iki kez damıtılmış su içine 2 ml% 1 sulu bir altın klorür ekleyin. </li><li> Çözelti B hazırlanması: 32 mL Milli-Q, ya da iki kez damıtılmış su içine 8 ml% 1 tri-sodyum sitrat x 2 H2O ve 160 ul% 1 tannik asit ekleyin. </li><li> 60 ° C&#39;ye kadar çözelti A ve B Isınma ve karıştırılırken karıştırın. Hemen bir koyu mavi renk gözlemleyin. 15 dakika sonra kırmızı bir renk dikkate alınmalıdır. Daha sonra, 95 ° C&#39;ye kadar ısınması 5 dakika tutmak ve oda sıcaklığına kadar çözelti soğutulur. </li><li> Bir karbon kaplı ızgara üzerine NP süspansiyon bir damla ekleyin ve havada kurumaya bırakın. Transmisyon elektron mikroskobu ile NP boyutunu ve morfolojisi kontrol edin. </li></ol> Rodamin N-hidroksisüksinimidil Ester (NHS) ile BSA ve Etiketleme Altın NPlerin 2. Kaplama 16 <ol><li> 30 dakika için 15,000 x g&#39;de, 1.5 ml&#39;lik Eppendorf tüpü içine 900 ul santrifüj altın NP ekleyin. Opduğunda, olabilir bir kerede birden fazla tüpler hazırlamak. </li><li> 900 ul pelet steril Milli-Q su içinde yeniden askıya ve 100 ul, 2 mg / ml BSA / PBS ilave supernatant 30 dakika boyunca 800 rpm&#39;de bir Vortex karıştırın. </li><li> Aşırı BSA kaldırmak için, 60 dakika boyunca 15,000 x g&#39;de santrifüj hazırlanması. </li><li> Süpernatantı atın ve 125 ul PBS altın-BSA NPs yeniden askıya, 1 M bikarbonat 12.5 ul ekleyin. </li><li> Kullanımdan hemen önce, rodamin NHS / DMSO içinde bir 10 mg / ml çözelti hazırlamak altın BSA NPler süspansiyon 1 ml&#39;ye kadar rodamin NHS / DMSO çözeltisi ve 30 ul ekle. Işığa maruz kaçınarak, 800 rpm karıştırma sırasında, oda sıcaklığında 2 saat (ya da O / N) için reaksiyon inkübe edin. </li><li> 48 saat - 36 dönemi boyunca 5 tampon değişiklikleri ile 4 ° C&#39;de PBS karşı diyaliz yoluyla altın BSA-rodamin NPs arındırın. </li><li> , NP stabilize her biri 1 mi altın-BSA-NP rodamin, 200 mg / ml BSA / PBS içinde 10 ul ekleyin. 15 yaşında, ücretsiz veya BSA-rodamin yayımlanan santrifüj kaldırmak için,60 dakika boyunca 000 x g. Işığa maruz kaçınarak, 4 ° C &#39;de OD 520 ve ölçüm haznesine, 2 mg / ml BSA / PBS içinde pelletini. </li><li> Milli-Q veya iki kez damıtılmış su ile NP 10 kez seyreltilir, bir karbon ile kaplanmış ızgara üzerine bir damla ekleyin ve hava içinde kurumaya bırakın. Transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) ile NP büyüklüğü ve morfoloji edin. Not: NP hazırlanması için kullanılan bütün malzemeler sterilize edildi ve işlem, bir hücre kültürü kaputu veya alev yanında tezgah üzerinde gerçekleştirilmiştir. </li></ol> HeLa Hücreleri 3. Kültür <ol><li> Sürekli LAMP1-GFP ifade eden HeLa hücreleri% 10 fetal dana serumu (FCS) ile, DMEM ve% 5 CO2 içeren bir atmosferde 37 ° C&#39;de büyütülür. </li><li> 8 oyuklu slaytı (Ibidi) içinde göz başına 50,000 yoğunlukta hücreler Tohum ve / N O inkübe edilir. </li></ol> Bakterilerin 4. Kültür <ol><li> Kullanım Salmonella enterica serovar Typhimurium NCTC 12.023 wilD-tipi (WT) ve soyu. Karşılaştırma için, SIF için anahtar etkeni şifa eksik spi2-T3SS ve Δ şifa içinde Δ ssaV kusurlu mutant soylarda kullanır. Geliştirilmiş GFP yapısal ekspresyon için plazmid pFPV25.1 barındıran suşları kullanın. Not: Bakteriyel suşlar 50 ug / ml karbenisilin ve / veya 50 ug / ml kanamisin (Δ ssaV, Δ şifa ilavesi ile 50 ug / ml karbenisilin (WT) ve LB ilavesi ile (LB) Luria-Bertani suyu rutin olarak kültürlenir ) plazmidleri muhafaza edilmesi için gerekli. </li><li> Sonra taze LB 01:31 sulandırmak ve 3.5 saat büyümesini devam uygun antibiyotiklerle 3 ml LB bakteri tek bir koloni aşılamak ve havalandırma için sallayarak koşullar altında 37 ºC / N O büyür. Bu zaman noktasında, kültürler geç log fazına ulaştıktan ve bakteri, yüksek oranda istilacı bulunmaktadır. Bir &#39;silindir davul&#39; havalandırma test tüpü kültürleri inkübe uygundur. </li></ol> HeLa hücrelerinin 5. enfeksiyon ileSalmonella ve Altın-BSA-Rodamin NPS Chase-etiketleme (şema için Şekil 1&#39;e bakınız) Darbe <ol><li> Alt-kültürlenmiş bakteri OD 600 ölçün ve 1 ml PBS (~ 3 x 10 8 hücre / ml) içinde 600 = 0.2 OD, seyreltik bir çok sayıda elde etmek için 8-çukurlu oda slaytlar HeLa hücrelerinde bakterilerin uygun miktarlarda eklemek enfeksiyon 100 (İB). </li><li> Olmayan içsel bakterileri çıkartmak için 3 kez PBS ile hücre kuluçka makinesi içinde, 30 dakika boyunca inkübe yıkama (bu zaman noktası, 0 saat sonra enfeksiyon ya da 0 saat pi olarak tespit edilmiştir). 100 ug / ml gentamisin içeren, taze kültür ortamının 300 ul ilave edin ve 1 saat boyunca muhafaza edilir. Daha sonra inkübasyon süresi sonuna kadar 10 ug / ml gentamisin ihtiva eden taze ortam ile orta yerine. </li><li> 1 saat süre ile, 100 ug / ml gentamisin ihtiva eden kültür ortamı ile inkübe edildikten sonra, ortam ko (30 mM HEPES, pH 7.4 ile, FCS, L-glutamin, fenol kırmızı ve sodyum bikarbonat olmadan Eagles MEM) orta görüntüleme değiştirilir10 ug / ml gentamisin ntaining. Altın, BSA-rodamin NPler OD 520 = 0.1 nihai bir konsantrasyon elde etmek için, HeLa hücrelerine ilave edilir. Not: Altın-BSA-rodamin NPler da enfeksiyondan önce veya farklı zaman noktaları pi hücrelere ilave edilebilir </li><li> 1 saat inkübe edildikten sonra, ortam maddesinin ayrılması 3 defa PBS ile yıkayın ve inkübasyon süresi içinde geri kalan% 10 FCS ve 10 | ig / ml gentamisin ihtiva eden taze bir görüntüleme ortamında 300 ul ilave edin. Not: kuluçka süresi kullanılan NP ve hücre çizgileri konsantrasyonuna bağlı olarak değişebilir. RAW264.7 makrofaj için, yeterli içselleştirme izin OD 520 = 0.05 bir konsantrasyonda NP o 30 dakika inkübasyon görülmektedir. </li></ol> 6. Görüntüleme <ol><li> Gibi farklı zaman noktalarında yüksek çözünürlüklü görüntüleme için nemlendirilmiş bir ortam odası ile konfokal lazer tarama (CLSM) veya döner diskli (SD) mikroskop gibi bir konfokal görüntüleme sistemi kullanın. </li><li> Sıcaklık c Anahtarıistikrarlı kadar ve sistem ontrol bekleyin. Böyle büyütme, tarama hızı, çözünürlük, Z-yığını vb GFP için uygun uyarma / emisyon ayarlarını kullanın ve altın-BSA-rodamin NP gibi görüntüleme ayarlarını optimize eder. Bu protokol için, 512 x 512 piksel 400 Hz tarama hızı, çözünürlük ve 0.25 mikron Z-adım boyutunu kullanın. GFP ve sırasıyla Ar, lazer (488 nm) ve HeNe lazer (543 nm) kullanılarak altın BSA rodamin harekete geçirir. Hücrelerin şeklini gözlemlemek için parlak alan (BF) kanalı ekleyin. Mikroskopi sistemleri ve enfeksiyon koşulları diğer için, ayar buna göre ayarlanması gerekir. NOT: Bir fotoğraf çarpanı (PMT) detektörü ile tespit edildi BF kanalı ve sinyal ışık kaynağı aynı Ar lazer kullanın. </li><li> Belirtilen zaman noktaları pi anda, mikroskop sahne ve kayıt görüntülerinde enfekte hücreleri içeren 8-iyi odasının slaytlar monte edin. </li></ol> Görüntüler 7. Analizi <ol><li> Mikroskopi görüntü analizi yazılımı kullanın (bkz <strong&gt; Malzeme ve Ekipman Masa) hücre içi Salmonella tarafından Endo-lizozomal sistemin biçimlenme analiz etmek. &#39;Aç&#39; tıklayarak ve dosyayı seçerek verileri açın. NOT: Alternatif olarak, ImageJ veya FIJI gibi açık kaynak yazılım paketleri kantitatif görüntü kullanılabilir analizleri. </li><li> Simgesine görünümü Aşan tıklama nesneleri araç çubuğunda <img alt="Ikon" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon1.jpg" /> Yeni bir yüzey öğesi eklemek. Tıklayın <img alt="Ikon" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" /> (Sonraki). </li><li> İlgi (ROI) bir bölge seçin segmenti bir ROI analiz etmek. Bir görüntüleme alanında, resmi üzerine bindirilmiş bir dikdörtgen çerçeveli bölüm yatırım getirisi temsil ediyor. Y, ilgili x- değerleri girin, ve z alanlar, ya da doğrudan boyutu ve ROI konumunu değiştirmek için önizleme dikdörtgenin içinde okları tıklatın. Ardından tıklayın <img alt="Ikon" fo:content-width=".1in" src<html> = &quot;/ Files / ftp_upload / 52.058 / 52058icon2.jpg&quot; /&gt; (Sonraki). </li><li> Bir kaynak kanalı olarak seçin Kanal 3 (Altın-BSA-Rodamin NPlerin için sinyali). Elde edilen alanın düzgünlüğü kurmak için yumuşak seçeneği işaretleyin. Elle bir değer tanımlayın veya otomatik olarak oluşturulan değeri kabul. Eşiği için, Mutlak Yoğunluk seçeneğini seçin. </li><li> Eşik ayarı için, manuel seçeneği seçin ve bir değer ayarlayın. Görüntüleme alanında, bir yüzey eşik önizleme gri görüntülenir. </li><li> Sekmesinde sınıflandırır Yüzeyler üzerinde ortaya çıkan yüzeyi çeşitli kriterlere göre filtre edilebilir. Bir varsayılan filtre ve diğer filtreler &#39;voksellerin&gt; 10 sayısı&#39; da &#39;eklemek&#39; tıklayarak dahil edilebilir. Bir filtreleme gerekli değilse, o zaman silme butonuna tıklayarak tüm filtreleri silin. Tıklayın <img alt="Ikon" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" /> (Sonraki). </li><li> Yüzey oluşturma işlemini tamamlamak için, tıklayın/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg &quot;/&gt; (Finish). Nesne listesinde, şimdi kontrol un öğe Hacmi ve yeni oluşturulan yüzeyin için kutuyu görüş alanı görüntülenir. </li><li> Istatistik verin. Şimdi, Aşan görünümünde konuların renk alanlarına göre mor kırmızıya değişir. Ve &#39;Plot Numaraları Alan&#39; tablo istatistik bilgilerini (örneğin, kimlik numarası ve nesnelerin alan) gösterir. Tıklama ile bir Excel dosyasına yüzeyin 1 tüm istatistikleri İhracat <img alt="Ikon" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon4.jpg" /> (Kaydet). </li></ol>

<ol>
	<li>Coto-Garcia, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+fluorescent+labels+for+optical+imaging+and+sensing+in+genomics+and+proteomics.">Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics.</a> Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).</li><li>Xie, J., Lee, S., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+theranostic+agents.">Nanoparticle-based theranostic agents.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1064-1079 (2010).</li><li>Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nanoparticles+for+intracellular+sensing:+a+review.">Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review.</a> Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).</li><li>Wu, C., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+fluorescent+semiconducting+polymer+dots+for+biology+and+medicine.">Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).</li><li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots.">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).</li><li>Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles:+an+era+in+bionanotechnology.">Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).</li><li>Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+of+engineered+gold+nanoparticles+into+mammalian+cells.">Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells.</a> Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).</li><li>Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+size+and+shape+dependence+of+gold+nanoparticle+uptake+into+mammalian+cells.">Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells.</a> Nano Lett. 6, 662-668 (2006).</li><li>Finlay, B. B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+mammalian+host+cell+functions+by+bacterial+pathogens.">Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens.</a> Science. 276, 718-725 (1997).</li><li>Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+host-cell+pathways+by+bacterial+pathogens.">Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens.</a> Nature. 449, 827-834 (2007).</li><li>Malik-Kale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+-+at+home+in+the+host+cell.">Salmonella - at home in the host cell.</a> Front. Microbiol. 2, 125 (2011).</li><li>Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+remodeling+of+the+endosomal+system+during+formation+of+Salmonella-induced+filaments+by+intracellular+Salmonella+enterica.">Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica.</a> Traffic. 9, 2100-2116 (2008).</li><li>Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella-induced+tubular+networks.">Salmonella-induced tubular networks.</a> Trends Microbiol. 19, 268-277 (2011).</li><li>Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+trafficking+is+defined+by+continuous+dynamic+interactions+with+the+endolysosomal+system.">Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system.</a> Traffic. 8, 212-225 (2007).</li><li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+of+preparing+gold+probes+for+multiple-labeling+cytochemistry.">A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry.</a> Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).</li><li>Zhang, Y., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanoparticles+as+endocytic+tracers+in+cellular+microbiology.">Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology.</a> Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).</li><li>Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+22.">Chapter 22.</a> Cell Biology. , (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> LysoTracker and LysoSensor Probes. , (2013).</li><li>Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+biocompatible+and+long-life+marker+for+lysosome+labeling+and+tracking.">Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking.</a> Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).</li><li>Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+putative+effector+proteins+of+the+type+III+secretion+system+of+Salmonella+pathogenicity+island+2+are+required+for+bacterial+virulence+and+proliferation+in+macrophages.">Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages.</a> Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).</li><li>Beuzon, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+maintains+the+integrity+of+its+intracellular+vacuole+through+the+action+of+SifA.">Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA.</a> EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

memeli hücrelerinin bir endo-lızozomal sistemi besin alımı, hormon-kaynaklı sinyal iletimi, immün gözetim ve antijen sunumu 17 de dahil olmak üzere önemli fizyolojik işlemleri kontrol eder. Şimdi, belirteçlerin çeşitli endositik yolu ve izleme çalışmaları etiketlenmesi için kullanılmıştır kadar. Örneğin, Lysotracker probları seçici düşük iç pH hücre bölmesi içinde birikir ve etkin bir şekilde, nanomolar konsantrasyonlarda 18 de canlı hücreleri etiketlemek olabil...

Vb metal NPlerin, kuantum noktalar, polimer NPlerin, silika NP, karbon noktalar da dahil olmak üzere Floresan nanopartiküller (NPS), geçmiş yıllarda 1,2 sırasında büyük ilgi çekmiştir. Geleneksel organik boyalara kıyasla, floresan NPler gibi güçlü sinyal gücü, direnç photobleaching ve yüksek biyouyumluluk 3,4 olarak arzu kimyasal, optik ve mekanik özellikleri göstermektedir. Bu avantajlar, onları hücre içi algılama ve canlı hücre görüntüleme için tercih edilen yöntem yapmak. Ayrıca, elektron-yoğun NP çeşitli EM 5 ile ultrastrüktürel düzeyde ışık mikroskobu (LM) ve daha yüksek çözünürlükte izleme canlı hücrenin kombinasyonu tanır ilişkili mikroskopik analiz, onların kullanımını kolaylaştıran, elektron mikroskobu (EM) ile görebilir. Örneğin, altın NPler verimli bir şekilde hassas teşhisi için canlı hücreler hem de bağışıklık etiketleme 6 alanında biyosensörler olarak kullanılan uzun zaman olmuştur. Son studies farklı boyut ve şekle sahip, altın NPler hücre kuşaklarının büyük bir çeşitliliği tarafından alımı ve rutin olarak endozomal yolu ile taşıma, dolayısıyla büyük bir potansiyele olmak hücre içi vezikül taşıma takip ve endo-lızozomal sistem etiketleme uygulanmış kolaylıkla olabilir göstermektedir 7,8 . Salmonella enterica, Shigella flexneri ve Listeria monocytogenes gibi Mikrobiyal patojenler, fagositik olmayan konak hücreleri 9 istila farklı mekanizmalar geliştirmişlerdir. Içselleştirilmiş sonra, patojenler, ya sitoplazmada lokalize veya zar-bağlı bölümlerinde tecrit, ev sahibi ortamları ile yoğun etkileşim ve kendi yaşam 10 lehine bu modüle. Örneğin, Salmonella enterica bulunduğu ve bir hücre içi phagosomal bölmesi enfeksiyonu 11 üzerine Salmonella ihtiva-eden çarpıtma (SCV) olarak adlandırılan içinde çoğaltır. olgunlaşan SCV, Golgi aygıtının doğru trafikleri endositik yolunun sürekli etkileşimleri geçiren ve Salmonella -kaynaklı filamentler olarak geniş tübüler yapılar, (SIF), neksin tübülleri sıralama, Salmonella indüklenen salgı taşıyıcı membran proteini 3 (SCAMP3) tübüller, vb oluşumunu uyarır . 12-14. Bu bakteriyel patojenler, konukçu hücre yolları değiştirme konusunda incelenmesi anlama bulaşıcı hastalık için gereklidir. Burada, altın BSA-rodamin NPler konak hücresel endo-lizozomal sistemi etiketlemek için sıvı izleyiciler olarak kullanıldı, ve insan gastrointestinal patojen Salmonella enterica serovar Typhimurium (Salmonella) ile patojen etkileşimlerini incelemek için bir model bakteri olarak kullanıldı endositik yolu ev sahipliği. WT Salmonella ya da mutant suşları ile enfekte enfekte olmayan hücreler ve hücre içi altın BSA rodamin NPler konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile görüntülendi.Daha sonra Imaris yazılım Salmonella enfeksiyonu endozomlar / lizozomların aşırı yeniden düzenlenmesine neden olduğunu gösteren, NP dağılımını ölçmek için kullanıldı. Bu yöntemin açıklaması ardından, benzer deneyler içselleştirilmiş NP uzun vadeli kaderini izlemek ve ökaryotik hücrelerin endositik yolu üzerinde çeşitli eksojen maddelerin veya endojen faktörlerin etkisini araştırmak için dizayn edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Gold chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Tannic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>403040</td><td></td></tr><tr><td>Tri-sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Rhodamine</td><td>Pierce</td><td>46406</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Applichem</td><td>A1492</td><td></td></tr><tr><td>Kanamcyin</td><td>Roth</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Roth</td><td>6344</td><td></td></tr><tr><td>8-well chamber slides</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>tissue culture treated, sterile</td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane</td><td>version 7.6</td><td>various configurations available</td></tr></tbody></table>

application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria

Arzu kimyasal, optik ve mekanik özelliklere sahip Floresan nanopartiküller (NPS) hücre içi organellere etiketlemek için umut verici araçlardır. Burada, biz ökaryotik hücrelerin Endo-lizozomal sistem etiket ve hücre içi patojen Salmonella enterica konak hücresel yolların manipülasyonları izlemek için altın BSA-rodamin NPs kullanarak bir yöntemi tanıtmak. NPS kolayca geç endozomlar / lizozomlarında HeLa hücreleri tarafından içselleştirilmiş ve lokalize edildi. Salmonella enfeksiyonu Salmonella kaynaklı zar yapılarında vezikül ve NP birikimi yeniden düzenlenmesini bağlı. Biz konfokal mikroskopi görüntüleri kantitatif analizleri için Imaris yazılım paketi dağıtmış. nesne sayısı ve enfekte olmayan hücreler içinde boyut dağılımı çok WT Salmonella endo-lızozomal sistemin yeniden modelleme gösteren Salmonella ile enfekte olan hücrelerde olanlardan çok farklıdırlar.

Altın NPler sitrat ve tanik asit chloroauric asidin indirgenmesi ile iyi bilinen bir yöntem ile üretilmiştir. Şekil 2A&#39;da gösterildiği gibi, sentezlenmiş altın NPler yaklaşık 10 nm arasında bir boyuta sahip şeklinde yarı-küresel edildi. BSA-kaplama ve rodamin-etiketleme kendi morfoloji veya boyutunu (Şekil 2B) etkilememiştir. Bu altın NPler hali hazırda çeşitli memeli hücreler tarafından alınır ve endositik sistemleri 7</sup...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria at JoVE.com

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Bu makalede, sentezi ve nanopartiküllerin floresan etiketleme (UP) için yöntemler tarif etmektedir. NPler ökaryotik hücrelerin endo-lızozomal sistemi etiket darbe kovalayıcı deneyler uygulanmıştır. Hücre içi patojen Salmonella enterica faaliyetleri ile Endo-lizozomal sistemin Manipülasyon canlı hücre görüntüleme ve sayısal izledi.

Floresan Nanopartiküller Uygulama Hücre içi Bakteri tarafından Endo-lizozomal Sistemi Modelleme Eğitim için

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

application-fluorescent-nanoparticles-to-study-remodeling-endo

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K Görüntüleme.  Universität Osnabrück.  Bu makalede, sentezi ve nanopartiküllerin floresan etiketleme (UP) için yöntemler tarif etmektedir. NPler ökaryotik hücrelerin endo-lızozomal sistemi etiket darbe kovalayıcı deneyler uygulanmıştır. Hücre içi patojen Salmonella enterica faaliyetleri ile Endo-lizozomal sistemin Manipülasyon canlı hücre görüntüleme ve sayısal izledi. 

Video: Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To study retrograde protein traffic, we have recently developed a versatile nanobody-based toolkit to analyze transport from the cell surface to the Golgi complex, either by fixed and live cell imaging, by electron microscopy, or biochemically. We engineered functionalized anti-green fluorescent protein (GFP) nanobodies &#8212; small, monomeric, high-affinity protein binders &#8212; that can be applied to cell lines expressing membrane proteins of interest with an extracellular GFP moiety. Derivatized nanobodies bound to the GFP reporters are specifically internalized and transported piggyback along the reporters&#39; sorting routes. Nanobodies were functionalized with fluorophores to follow retrograde transport by fluorescence microscopy and live imaging, with ascorbate peroxidase 2 (APEX2) to investigate the ultrastructural localization of reporter-nanobody complexes by electron microscopy, and with tyrosine sulfation (TS) motifs to assess kinetics of trans-Golgi network (TGN) arrival. In this methodological article, we outline the general procedure to bacterially express and purify functionalized nanobodies. We illustrate the powerful use of our tool using the mCherry- and TS-modified nanobodies to analyze endocytic uptake and TGN arrival of cargo proteins.

Retrograde transport of proteins from the cell surface to the Golgi is essential to maintain membrane homeostasis. Here, we describe a method to biochemically analyze cell surface-to-Golgi transport of recombinant proteins using functionalized nanobodies in HeLa cells.

Endositik alımını ve kültürlü hücrelerde Functionalized Nanobodies kullanarak Trans-Golgi ağına retrograd taşıma analizi

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Biyokimya

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Canlı Makrofagların içinde Phagolysosome Biogenesis&#39;den Çalışması

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Ana Hücreleri ile Anaerobik Bakteriler Etkileşim değerlendirilmesi için bir model organizma olarak Porphyromonas gingivalis

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Nörobilim

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence microscopy as observations made at a population level may not truly reflect what occurs at a single cell level. Live-cell timelapse microscopy allows investigators to monitor the changes in cell division or cell morphology which provide valuable insights regarding subcellular localization of proteins and timing of gene expression, as it happens, to potentially aid in answering important biological questions. Here, we describe our protocol to monitor phenotypic changes in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus using a high-resolution deconvolution microscope. The objective of this report is to provide a simple and clear protocol that can be adopted by other investigators interested in conducting fluorescence microscopy experiments to study different biological processes in bacteria as well as other organisms.

This article provides a step-by-step guide to investigate protein subcellular localization dynamics and to monitor morphological changes using high-resolution fluorescence microscopy in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

Bakterilerde Hücre Altı Protein Lokalizasyonu ve Hücre Morfolojisi Değişikliklerini Araştırmak Için Canlı Hücre Floresan Mikroskobu

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Biyoloji

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase nutrients and other material in cells. The dramatic extension of cell surface ruffles, their closure to form macropinosomes, and the maturation of internalized macropinosomes are key events in this pathway that can be difficult to capture using conventional confocal imaging based on tracking a bolus of fluorescent cargo. Fluorescent dextrans are commonly used experimentally as fluid phase markers for macropinosomes and for other endocytic pathways. A method the lab has adopted to optimize the imaging of dextran uptake involves using live imaging of cells bathed in high concentrations of fluorescent dextran in the medium, with the unlabeled cells appearing in relief (as black). The cell ruffles are highlighted to visualize ruffle closure, and internalized macropinosomes appear as fluorescent vacuoles in the cell interior. This method is optimal for visualizing macropinosome features and allows for easy segmentation and quantification. This paper describes dual-labeling of pathways with different sized dextrans and the co-expression of lipid probes and fluorescent membrane proteins to demark macropinosomes and other endosomes. The detection of internalized dextran at an ultrastructural level using correlative light and electron microscopy (CLEM) is also demonstrated. These cell processes can be imaged using multiple live imaging modalities, including in 3D. Taken together, these approaches optimize macropinosome imaging for many different settings and experimental systems.

This protocol demonstrates dextran imaging in live cells using continuous uptake and inverse images to optimize visualization of ruffling, macropinosome maturation, and analysis of dextran and other cell labelings.

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase ...

The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in the biogenesis of melanosomes, a lysosome-related organelle produced by melanocytes. REs deliver the melanocyte-specific cargo to premature melanosomes during their formation. Blockage in the generation of REs, observed in several mutants of Hermansky-Pudlak syndrome, results in hypopigmentation of skin, hair, and eye. Therefore, studying the dynamics (refer to number and length) of REs is useful to understand the function of these organelles in normal and disease conditions. In this study, we aim to measure the RE dynamics using a resident SNARE STX13.

Recycling endosomes are part of the endosomal tubular network. Here we present a method to quantify the dynamics of recycling endosomes using GFP-STX13 as an organelle marker.

SNARE Kaçakçılığı kullanarak Geri Dönüşüm Endozomlarını İncelemek ve Analiz Etmek için Mikroskopi Tabanlı Tahlil

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...

An Introduction to Endocytosis and Exocytosis

Cells can take in substances from the extracellular environment by endocytosis and actively release molecules into it by exocytosis. Such processes involve lipid membrane-bound sacs called vesicles. Knowledge of the molecular architecture and mechanisms of both is key to understanding normal cell physiology, as well as the disease states that arise when they become defective. This video will first briefly review a few pivotal discoveries in the history of endo- and exocytosis research. Next, some key questions will be examined, followed by a discussion of the prominent methods used to investigate these problems, including cell labeling, fusion assays, and fluorescence imaging. Finally, it will explore current research being conducted by scientists in the field today.

Endocytosis and Exocytosis; Clathrin Coated Pits and SNAREs

Cells can take in substances from the extracellular environment by endocytosis and actively release molecules into it by exocytosis. Such processes ...

Education

JoVE Science Education

İleri Biyoloji

Hücre Biyolojisi

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging

Source: Tsuruta, F., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55488">Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates how neuronal vesicles are labeled with specific fluorescent proteins to visualize their movement. First, a plasmid coding for a fluorescent protein is incubated with a transfection agent and then introduced into a culture of neurons. Subsequently, images of the neurons are acquired and analyzed to track the vesicles&#39; movement.

Floresan Görüntüleme Kullanılarak Nöronlardaki Vezikül Motilitelerinin Görselleştirilmesi

1. Imaging Vesicle Motility

	Prepare the plasmids that will label each type of vesicle. For instance, use EGFP-Rab5 for early endosomes, EGFP-Rab7 for ...

Floresan Nanopartiküller Uygulama Hücre içi Bakteri tarafından Endo-lizozomal Sistemi Modelleme Eğitim için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

PLAYLIST