Biz iPSC nesil uzmanlık ve protokol paylaşımı için, sırasıyla ChR2 ve Synapsin1-tdTomato lentiviral yapıları C. Chai K. Deisseroth ve S. Je teşekkür, WY Leong, teknik destek için, paylaşım reaktif ve uzmanlık için Goh laboratuar üyeleri. Bu çalışma ELG onun Rekabet Araştırmaları Programı (002-082 2008 NRF-CRP UÇK) altında Ulusal Araştırma Vakfı Singapur, Abbott Beslenme ve ELG için Mükemmeliyet Merkezi Akademik (ACE) GlaxoSmithKline (GSK) araştırma ödülü tarafından desteklenen ve GJA ve Eğitim, Bilim ve Kore Teknoloji (MEST) Bakanlığı tarafından finanse Kore Ulusal Araştırma Vakfı World Class Enstitüsü (WCI) Programı (UÇK) tarafından (UÇK Hibe Numarası: BÇYÖ 2009-003) GJA için

<ol>
	<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+mapping+of+synaptic+connectivity+using+photostimulation+in+Channelrhodopsin-2+transgenic+mice.">High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 8143-8148 (2007).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Stroh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+stem+cell+differentiation+in+the+setting+of+automated+optogenetic+stimulation.">Tracking stem cell differentiation in the setting of automated optogenetic stimulation.</a> Stem Cells. 29 (1), 78-88 (2011).</li><li>Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, S. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+neurons+adopt+and+regulate+the+activity+of+an+established+neural+network.">Human embryonic stem cell-derived neurons adopt and regulate the activity of an established neural network.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (50), 20189-20194 (2011).</li><li>Viviani, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+coculture+of+neurons+and+glial+cells.">Preparation and coculture of neurons and glial cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. 32, 2.7.1-2.7.2.1 (2006).</li><li>Braun, H., G&#252;nther-Kern, A., Reymann, K., Onteniente, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+of+human+iPS-cells+in+a+rat+cortical+primary+culture.">Neuronal differentiation of human iPS-cells in a rat cortical primary culture.</a> Acta Neurobiologiae Experimentalis. 72 (30), 219-229 (2012).</li><li>Shivaraj, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taurine+induces+proliferation+of+neural+stem+cells+and+synapse+development+in+the+developing+mouse+brain.">Taurine induces proliferation of neural stem cells and synapse development in the developing mouse brain.</a> PLoS ONE. 7, e42935 (2012).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+induction+and+long-term+self-renewal+of+primitive+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells+by+small+molecule+inhibitors.">Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (20), 8299-8304 (2011).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (50), 424-429 (2011).</li><li>Packer, A. M., Roska, B., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neurons+and+photons+for+optogenetics.">Targeting neurons and photons for optogenetics.</a> Nature Neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).</li><li>Marchetto, M. C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+Syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A Model for neural development and treatment of Rett Syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li><li>Asrican, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transgenic+mice+for+optogenetic+analysis+of+neural+circuits.">Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 160 (2013).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Optogenetik nöronların 13 belirlenen popülasyonlarının aktivasyonu için zamansal ve uzamsal kesinlik sağlar. Deneylerde, mikroskop objektif tüm alanı ChR2 ifade fotoğraf uyarmak sadece kortikal nöronların 30 saniye aydınlattı. Bu sinaptik bağlantıları ko-kültür içindeki nöronların farklı popülasyonlar arasındaki oluşmuş olup olmadığını belirlemek bize izin verdi. Bizim sonuçlar photostimulation bu nöronlar ChR2 ifade presinaptik kortikal nöronların sinaptik girdi almak olduğunu göstermektedir ki, iPSC türetilmiş nöronlarda PSC sıklığını artırmaktadır ortaya koydu. Bu da, iPSC türetilen nöron başarılı bir şekilde kortikal nöronlar devrelerin içine dahil olduğu saptanmıştır. Bu ko-kültür sisteminin oluşturulması için pek çok kritik adım vardır. Bu kaplama ile devam etmeden önce fare NPC türetilmiş astrosit kültürleri, minimal hücre ölümü ile, sağlıklı olmasını sağlamak için önemlidirdiğer hücre türleri. Kortikal nöronlar ve insan NPC sağlıklı astrositlerde üzerine de eklemek ve elektrofizyolojik kayıtlar kültür koşulları ağır bağlıdır. Bu protokolde diğer önemli adımlar astrosit kültürleri üzerine elektroporasyon ve kortikal nöronların kaplama vardır. Hücrelerin geniş bir sayısı elektroporasyon sonra kalıp gibi, en az 6.000.000 kortikal nöronlar, 24 oyuklu plakalar içinde astrosit kültürleri üzerine kaplama için elektroporasyona sağlamak için önemlidir. Biz az 6 milyon hücre elektroporate zaman, hayatta nöronların sayısı elektrofizyolojik kayıtları etkilenen yoğun nöronal ağ oluşturmak olmadığını gözlemledik. Her ko-kültür deney farklı çalışmalar arasında karşılaştırma izin için electroporated kortikal nöronların sayısı da tutarlı olmalıdır. Enzimatik sindirim ile ilgili tüm adımlar için, çok uzun hücre ölümüne neden olabilir sindirim çözelti hücreleri bırakmamaya esastır. Buyaklaşım, diğer nöronlarla sinaptik temas oluşturmak üzere, hastaya özgü fibroblastlar türetilen nöron yeteneği taranması için kullanılabilir. Nöro bozukluğu Rett sendromu (RTT) mustarip hastaların fibroblastlardan elde edilen nöronlar sinaptik transmisyon kusurlar sergilerler: RTT nöronlar ki tahminen bu, daha az sinaptik bağlantı 14 sağlıklı nöronlara göre PSK frekans ve genlik belirgin bir azalma sergiler. Bizim co-kültür sistemi gelişim kusurları görüntüleyen nöronlar üzerinde uyuşturucu etkileri muayene izin verir. Bu hastalıklı insan NPC ekim sırasında ve aynı zamanda nöronal farklılaşma süresi boyunca bileşiklere sürekli maruz kalma sırasında söz konusu bileşikler, ilave edilerek gerçekleştirilebilir. Bu ko-kültür sistemi de uyuşturucu testi için bir model olarak kullanılabilir iken, bu yaklaşım ile bir sınırlama her aday bileşiğin etkilerini araştıran süreci uzun ve gibi sıkıcı olabilir kiBu, yüksek veri akışı tarama yöntemi değildir. Aday bileşikler ile işlemden geçirildikten sonra, iPSC türetilen nöron ayrı PSC&#39;lerin her bileşiğin etkisini belirlemek için yama gerekir. Ayrıca, şu anda hastaların pek mevcut fibroblastlar ve iPSCs vardır. Bu nedenle, daha sabırlı hücrelere sahip ve aynı zamanda yüksek verimli tarama için bu protokolü adapte yakın gelecekte ilgi olacaktır. Örneğin, bu gibi iyonları ya da zar potansiyeli genetik olarak kodlanmış sensör olarak bir etkinlik göstergesi iPSC türetilmiş nöronlar, etiketleyerek yan adım zaman alıcı elektrofizyolojik prosedür ile esas olarak akış oranını artırmak için mümkün olacaktır. Elektrofizyolojik kayıtları gerçekleştirmeden fibroblastları yeniden programlanması gelen, bu ko-kültür sistemi üreten tüm süreç olarak, en fazla 90 gün, sırasıyla yeniden programlama ve nöral indüksiyon adımlarından sonra, insan iPSCs veya NPC ya genişletilmiş olması tavsiye edilir gerektirir,ve kriyoprezerve gelecek deneyler için gerekli zamanı azaltmak için. Deneylerde, biz synapsin1 promotörün kontrolü altında kortikal nöronlarda ChR2 ifade edilmiştir. Bu promotör Pan-nöronal olduğundan, biz muhtemelen hem inhibitör ve eksitatör kortikal nöronlar photostimulating edildi. Gelecek deneylerin amacı, özellikle engelleyici veya uyarıcı ya da devre sorgulamak için ise, daha özel promoterler kullanılabilir. Alternatif olarak, kortikal nöronlar transjenik (ya da virüs enjekte edilen fareler) ChR2 sentezleme, özellikle nöron genetik tanımlanmış alt popülasyonlar hedeflenen elde edilebilir. Örneğin, Cre recombinase sahip bir fare hasat kortikal dokular ChR2 ifade sadece kortikal nöronlar PV internöron 15 olacak bir durum verecektir floxed ChR2 ile bir fare ile geçilen parvalbumin içeren internöronlar (PV internöron) olarak ifade edilmiştir. Böyle ChR2 ifade eden de internöronlardan ko-cu kullanımılture sistemi yamalı iPSC türetilmiş nöron PV internöronlar bir devrenin içine dahil etmek mümkün olup olmadığı tespitine imkan olacaktır. Bir önceki çalışmada 9 dayanarak, kortikal nöronlar in vitro 14 gün sonra dendrit örtüşen olgun. Photostimulation bir yamalı iPSC türetilmiş nöron bir tepkisi yoksa Böylece, bu nöron kortikal nöronlar ile sinaptik bağlantıları yapmak için yeteneğine sahip olmadığını belirtmelidir. Bir iPSC türetilmiş nöron diğer iPSC türetilmiş nöronlar veya kortikal nöronlar ya sinaptik girdi alabilir. Geleneksel yama kelepçe kayıtları kullanılmış olsaydı, bu sinaptik girdi nereden geldiğini ayırt etmek mümkün olmazdı. Bizim sistemin avantajı kortikal presinaptik girişten postsinaptik cevaplar seçici uyarılmış ve tespit edilebilir olmasıdır. Burada özetlenen prosedürler entegre iPSC türetilmiş nöronların yeteneğini değerlendirmek için basit bir yaklaşım sağlamaktanımlanmış bir nöronal ağa.

Son yıllarda, nöron ve nöronal devre fonksiyonu anlayışımız nöronal uyarılabilirliği denetleyen çeşitli Optogenetic araçlar tarafından devrim edilmiştir. Böyle bir alet ışık aktive katyon kanalı, channelrhodopsin-2 (ChR2): ışık uyarımı 1-3 cevaben ChR2 yangın aksiyon potansiyelleri ifade nöronlar. Nöronlar ışığa duyarlı normalde olmadığından, bu olağanüstü yetenek nöronların 4 genetik tanımlanmış nüfusun faaliyet kesin zamansal ve mekansal kontrolü için yeni yollar açılır ve büyük ölçüde beyin fonksiyonlarının çalışmaları hızlandırdı. ChR2 sinir ağları 6 faaliyetlerini düzenleyen nöronal gelişme 5 izlenmesi, farklı amaçlar için kök hücre araştırmaları için uygulanmıştır. Burada nöronal bir eş-kültür sistemine yararını artırmak ChR2 kullanılır. Ko-kültür sistemleri farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimlerin değerlendirmesini sağlar.Nöron ve glial ko-kültür, sinir sisteminin ana hücre tipi, genel olarak, bu farklı hücre tipleri arasında sinyal araştırmak ve aynı zamanda fizyolojik yanıtlar, bu sinyal önemini değerlendirmek için, hasar yayılması ve incelemek için kullanılan Potansiyel olarak, bu 7 sinyal yer alan moleküler mekanizmalar. Bir önceki çalışmada, insan iPSCs sıçan kortikal birincil kültür içeren nöronlar, astrositler, oligodendrositler ve mikroglia 8 varlığında nöronların içine çok hızlı bir şekilde ayırt ortaya koymuştur. Bu protokol, insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) elde edilen fare kortikal nöronlar ve nöronlar arasındaki sinaptik bağlantıları sorgulamak için bir ko-kültür sisteminde ChR2 kullanan bir yöntemi göstermektedir. Biz astrositlere içine incelemek için adımlar ve hasat beyin dokuları 9 yanı sıra fare nöral progenitör hücreleri korumak ve ayırt etmek için (NPC) açıklamak ve insan NPC&#39;ler into nöronlar ko-kültür sistemi oluşturmak için. Bu ko-kültür sistemi kurmak için, biz Okita ve arkadaşları tarafından tarif entegrasyon-ücretsiz yeniden programlama yöntemi kullanıldı. 10 insan iPSCs oluşturmak için. Li ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi bu iPSCs sonra verimli bir şekilde küçük moleküllü inhibitörleri kullanılarak kimyasal olarak tanımlanmış ortamlarda NPC ayrışmıştır edildi. 11 Ko-kültürlerinde nöronların farklı popülasyonlar Domates (tdTomato) dimer floresan protein, tandem ile iPSC türetilen nöron kortikal nöronlarda ChR2 ekspresyonunun saptanması ve etiketleme yoluyla tespit edilebilir. Kortikal Nöronların Optogenetic photostimulation ile iPSC türetilmiş nöronlardan elektrofizyolojik kayıtları birleştirme birbirleriyle devreleri oluşturmak üzere nöronların bu iki tip yeteneğinin değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır. Spesifik olarak, kortikal nöronlar ChR2 ifade photostimulation sinaptik devreleri oluşmuş iPSC türetilen nöron sinaptik tepkiler uyandırmakphotostimulated kortikal nöron ağı ile. Bu artış postsinaptik akımlar gerçekten bu koşullar altında iPSC türetilen nöron tespit edilir olduğunu göstermektedir. Bu protokol, hastalarından fibroblastlardan elde edilen iPSCs kullanarak farklı nörolojik hastalık modelleri içinde tekrarlama da dahil olmak üzere deneysel koşullar, çeşitli altında sinaptik devre değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır.

an optogenetic approach for assessing formation of neuronal connections in a co-culture system

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

Burada, astrositler içeren bir ko-kültür üreten alan çoklu aşamalarını tarif protokol kortikal nöronlar ve insan nöron görüntülenmiştir. İnsan iPSCs yüksek yoğunluklu (Şekil 1A) muhafaza edilmiş NPC 11 yaparak, küçük molekül inhibitörlerinin bir kokteyl ile bir sinir soy içine epizomal kullanarak fibroblastlar yeniden programlama ile elde edilen 10 vektörleri ve belirlenmiştir. TdTomato (Şekil 1B) ile etiketlenmiş insan NPClerden astrositlerde içine fare NPC farklılaşmasını, ChR2 ifade sıçan kortikal nöronların kaplama ve ekim: Çeşitli adımlar ko-kültür oluşturmak için gereklidir. Farklılaşma 2 gün içinde Glial fibrilar asidik protein (GFAP) + astrositler kolaylıkla eden kültürler (Şekil 1C) &#39;de görülmektedir. Fare NPC astrosit tek katmanlı (Şekil 1D) üzerine ChR2 ifade kortikal nöronlar kaplama önce en az bir hafta için ayırt etmek için izin verilmiştir. 3 sonraİnsan NPC farklılaşma 4 hafta, tdTomato + nöronlar kültürleri (Şekil 1E) tespit edilmiştir. Bu ko-kültür sistemi ışık uyarımı (Şekil 2A) yanıt olarak tek tek iPSC türetilmiş nöronlardan postsinaptik akımlar sürekli tespit edilmesine olanak sağlar. Işık ile uyarıldığında, aksiyon potansiyeli ChR2 (Şekil 2B) ifade kortikal nöronlarda üretilmiştir. Mevcut edilen kutuplaşma giderici darbelerin genliği artmış aksiyon potansiyeli ateşlemesini gösteren nöronları da (Şekil 2C) uyarılabilir olan iPSC türetilen (Şekil 2D) yükseltilmiştir. Bu nedenle, bu hücreler olgun nöronal özellikler sergiler. Işık yokluğunda, iPSC türetilen nöron spontan sinaptik giriş (Şekil 2E) verildi. GABA reseptörleri aracılığıyla akımlar dışa olurdu çünkü bu içe postsinaptik akımlar ağırlıklı, AMPA alıcıları tarafından aracılık ve NMDA reseptörleri mevcut a taşımak yok-70 mV tutma potansiyeline t. Hafif stimülasyon ölçüde postsinaptik akımlar (Şekil 2E) sıklığını artması nedeniyle en azından bazı girdilerin, CHR2 ifade presinaptik kortikal nöronlar arası idi. sinaptik girdi bu artışın zaman ders Şekil 2F gösterilmiştir: kortikal nöronların photostimulation 30 sn uzun ışık flaş boyunca devam edildi. ChR2 ifade kortikal nöronların (Şekil 2G) photostimulated zaman PSC&#39;ler sıklığı yüksek iken, onların genlik (Şekil 2H) etkilenmemiş oldu. Özetle, bu sonuçlar iPSC türetilen nöron olgun nöronal özellikler sergiledi ve presinaptik kortikal nöronlar ile sinaptik bağlantılar oluşturabilir göstermektedir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52408/52408fig1highres.jpg" /> Şekil 1: ortak-kültürünün oluşturulması için şematik diyagramıiPSCs ve NCPlerle nöral indüksiyon, insan fibroblastlar yeniden programlanması için sistem. (A) Timeline. kortikal nöron ve astrosit kültürleri üzerinde olgun nöronların içine insan NPC terminal farklılaşması için (B) Timeline. (C) Fare NPC hızla GFAP içine ayırt + astrositler 2 sonra in vitro gün. (D) Bir hafta sonra, ChR2 ifade kortikal nöronlar GFAP + astrositler üzerine ekildi. (E) 4-5 hafta sonra, insan NPC ayrılmasından sonraki elektrofizyolojik tdTomato + nöronlar üzerinde gerçekleştirilmiştir. Ölçek çubukları 100 um temsil eder. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52408/52408fig2highres.jpg" /> Şekil 2: Fonksiyonel sinaptik bağlantı optogenetic analizi. TdTomato (kırmızı) ile etiketlenmiş, (A) iPSC türetilmiş hücreler kortikal nöronlar ifade ile birlikte kültürlenmiştir ışıkla aktiveKanal, ChR2 (yeşil). IPSC türetilmiş nöronların Kayıtlar kortikal nöronların veya diğer iPSC-türetilmiş nöronların birinden gelebilir postsinaptik akım (PSC) yanıtları, ortaya. (B) Aydınlatma (mavi çubuk) ChR2 ifade kortikal nöronlarda aksiyon potansiyelleri bir dizi uyarılmış. ( C) iPSC türetilmiş hücreler ChR2 ifade kortikal nöronlar (E) photostimulation (mavi bar) korur. iPSC türetilmiş hücre akım eğrisi vs D) Pişirim (. Mevcut enjeksiyon ile uyarılmış iPSC türetilen nöron PSC&#39;lerin sıklığı arttırılır . photostimulation tarafından üretilen PSC sıklığında bir artış (F) zaman akışı. Mavi çubuk photostimulation zaman gösterir. PSC frekans photostimulation (G) bir artış iken (G, H), PSC genlik etkilenmemiş (lH) idi. * P &lt;0.05, öğrencinin t-testi ile kontrol grubuna göre gösterir.

Watch this Scientific Journal Video about An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System at JoVE.com

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

an-optogenetic-approach-for-assessing-formation-neuronal-connections

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.3K Görüntüleme.  Duke-NUS Graduate Medical School. A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2. 

Video: An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

Kültür ve Co-Kültür Mouse Yumurtalıklar ve Yumurtalık Foliküller

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Gelişim Biyolojisi

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Bir Koaksiyel Memesini kullanma Pluripotent Kök Hücre Aljinat Encapsulation

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Zebra balığı Gelişen Akut Böbrek Hasarının Modellenmesi İçin Hassas Hücresel Ablasyon Yaklaşımı

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

Memeli Erkek Germ Hücrelerinin Çok Denekli Saflaştırılmasında Standart Bir Yaklaşım, Mekanik Doku Ayrılma ve Akış Sitometrisi ile

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature maintenance and pathological malformations can result in severe ischemic diseases, while overly abundant vascular development is associated with cancer and inflammatory disorders. A promising form of pro-angiogenic therapy is the use of angiogenic cell sources, which can provide regulatory factors as well as physical support for newly developing vasculature.
Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are extensively investigated candidates for vascular regeneration due to their paracrine effects and their ability to detect and home to ischemic or inflamed tissues. In particular, first trimester human umbilical cord perivascular cells (FTM HUCPVCs) are a highly promising candidate due to their pericyte-like properties, high proliferative and multilineage potential, immune-privileged properties, and robust paracrine profile. To effectively evaluate potentially angiogenic regenerative cells, it is a requisite to test them in reliable and &#34;translatable&#34; pre-clinical assays. The aortic ring assay is an ex vivo angiogenesis model that allows for easy quantification of tubular endothelial structures, provides accessory supportive cells and extracellular matrix (ECM) from the host, excludes inflammatory components, and is fast and inexpensive to set up. This is advantageous when compared to in vivo models (e.g., corneal assay, Matrigel plug assay); the aortic ring assay can track the administered cells and observe intercellular interactions while avoiding xeno-immune rejection.
We present a protocol for a novel application of the aortic ring assay, which includes human MSCs in co-cultures with developing rat aortic endothelial networks. This assay allows for the analysis of the MSC contribution to tube formation and development through physical pericyte-like interactions and of their potency for actively migrating to sites of angiogenesis, and for evaluating their ability to perform and mediate ECM processing. This protocol provides further information on changes in MSC phenotype and gene expression following co-culture.

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Here, we present a novel application of the aortic ring assay where prelabelled mesenchymal cells are co-cultured with rat aorta-derived endothelial networks. This novel method allows visualization of Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) homing and integration with endothelial networks, quantification of network properties, and evaluation of MSC immunophenotypes and gene expression.

Aort yüzük ortak kültür tahlil: Mezenkimal Stromal hücre Vitro anjiogenik potansiyelini değerlendirmek için uygun bir araç

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart disease. When using prosthetic materials however, these grafts are susceptible to bacterial infections and various host responses.
Identification of bacterial and host factors that play a vital role in endovascular adherence of microorganisms is of importance to better understand the pathophysiology of the onset of infections such as infective endocarditis (IE) and to develop preventive strategies. Therefore, the development of competent models to investigate bacterial adhesion under physiological shear conditions is necessary. Here, we describe the use of a newly designed in vitro perfusion chamber based on parallel plates that allows the study of bacterial adherence to different components of graft tissues such as exposed extracellular matrix, endothelial cells and inert areas. This method combined with colony-forming unit (CFU) counting is adequate to evaluate the propensity of graft materials towards bacterial adhesion under flow. Further on, the flow chamber system might be used to investigate the role of blood components in bacterial adhesion under shear conditions. We demonstrated that the source of tissue, their surface morphology and bacterial species specificity are not the major determining factors in bacterial adherence to graft tissues by using our in-house designed in vitro perfusion model.

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

We describe an in-house designed in vitro flow chamber model, which allows the investigation of bacterial adherence to graft tissues.

Vitro modeli doku grefti bakteriyel bağlılık çalışmaya paralel-plaka perfüzyon sistemi

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

Endotel Kolonisi Oluşturan Hücreler ve Mezenkimal Kök Hücreler tarafından Oluşturulan Eş Kültür Sfaoidler Kullanılarak Üç Boyutlu Anjiyogenez Tsay Sistemi

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. Without sensory innervation, daily oral activities would cause irreparable damage. Despite its importance, the roles of innervation in tooth development and maintenance have been largely overlooked. Several studies have demonstrated that DP cells secrete extracellular matrix proteins and paracrine signals to attract and guide TG axons into and throughout the tooth. However, few studies have provided detailed insight into the crosstalk between the DP mesenchyme and neuronal afferents. To address this gap in knowledge, researchers have begun to utilize co-cultures and a variety of techniques to investigate these interactions. Here, we demonstrate the multiple steps involved in co-culturing primary DP cells with TG neurons dispersed on an overlying transwell filter with large diameter pores to allow axonal growth through the pores. Primary DP cells with the gene of interest flanked by loxP sites were utilized to facilitate gene deletion using an Adenovirus-Cre-GFP recombinase system. Using TG neurons from the Thy1-YFP mouse allowed for precise afferent imaging, with expression well above background levels by confocal microscopy. The DP responses can be investigated via protein or RNA collection and analysis, or alternatively, through immunofluorescent staining of DP cells plated on removable glass coverslips. Media can be analyzed using techniques such as proteomic analyses, although this will require albumin depletion due to the presence of fetal bovine serum in the media. This protocol provides a simple method that can be manipulated to study the morphological, genetic, and cytoskeletal responses of TG neurons and DP cells in response to the controlled environment of a co-culture assay.

We describe the isolation, dispersion and plating of dental pulp (DP) primary cells with trigeminal (TG) neurons cultured atop overlying transwell filters. Cellular responses of DP cells can be analyzed with immunofluorescence or RNA/protein analysis. Immunofluorescence of neuronal markers with confocal microscopy permits the analysis of neurite outgrowth responses.

Diş Hamuru Parakrin Sinyalleri yanıt olarak Neurite Outgrowth Çalışma Co-Kültür Yöntemi

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to various organs and tissues. Tissue stiffness produces mechanical force, a physical cue that plays a critical role in NCC differentiation; however, the mechanism remains unclear. The method described here provides detailed information for the optimized generation of polyacrylamide hydrogels of varying stiffness, the accurate measurement of such stiffness, and the evaluation of the impact of mechanical signals in O9-1 cells, a NCC line that mimics in vivo NCCs.
Hydrogel stiffness was measured using atomic force microscopy (AFM) and indicated different stiffness levels accordingly. O9-1 NCCs cultured on hydrogels of varying stiffness showed different cell morphology and gene expression of stress fibers, which indicated varying biological effects caused by mechanical signal changes. Moreover, this established that varying the hydrogel stiffness resulted in an efficient in vitro system to manipulate mechanical signaling by altering gel stiffness and analyzing the molecular and genetic regulation in NCCs. O9-1 NCCs can differentiate into a wide range of cell types under the influence of the corresponding differentiation media, and it is convenient to manipulate chemical signals in vitro. Therefore, this in vitro system is a powerful tool to study the role of mechanical signaling in NCCs and its interaction with chemical signals, which will help researchers better understand the molecular and genetic mechanisms of neural crest development and diseases.

Detailed step-by-step protocols are described here for studying mechanical signals in vitro using multipotent O9-1 neural crest cells and polyacrylamide hydrogels of varying stiffness.

Nöral Kret Hücrelerindeki Mekanik Sinyalleri İncelemek İçin Optimize Edilmiş Bir O9-1/Hydrogel Sistemi

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control over gene expression timing, location, and amplitude using light as the inducing agent. In this protocol, an optogenetic expression system is used to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos. This system relies on an engineered transcription factor called TAEL based on a naturally occurring light-activated transcription factor from the bacterium E. litoralis. When illuminated with blue light, TAEL dimerizes, binds to its cognate regulatory element called C120, and activates transcription. This protocol uses transgenic zebrafish embryos that express the TAEL transcription factor under the control of the ubiquitous ubb promoter. At the same time, the C120 regulatory element drives the expression of a fluorescent reporter gene (GFP). Using a simple LED panel to deliver activating blue light, induction of GFP expression can first be detected after 30 min of illumination and reaches a peak of more than 130-fold induction after 3 h of light treatment. Expression induction can be assessed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and by fluorescence microscopy. This method is a versatile and easy-to-use approach for optogenetic gene expression.

Optogenetics is a powerful tool with wide-ranging applications. This protocol demonstrates how to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos using the blue light-responsive TAEL/C120 system.

Optogenetik TAEL/C120 Sistemini Kullanan Zebra Balığı Embriyolarında Işık Kaynaklı GFP İfadesi

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...