The authors thank the DFG (Hu 997/2-2) for financial support. FS acknowledges the Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr was supported by the Elitenetzwerk Bayern in the framework of the doctorate program Material Science of Complex Interfaces. SKi thanks the SFB 863 for financial support.

NOT: hazırlık, veri toplama ve veri analizi adımları içeren proses akışının genel bir bakış için Şekil 2&#39;ye bakınız. 1. Reaktif Kurulumu NOT: Tüm kimyasallar dikkatle ele alınması gerekir ve böylece laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması kullanılmalıdır. Tüm işlemler, bir laboratuar ocak içinde gerçekleştirilmelidir. Özellikle, özel eldivenler kloroform kullanılması durumunda kullanılmalıdır. <ol><li> Kuru hızla kloroform ve mağaza kuru ama bir haftadan daha uzun olmayan düşük su içeriği ile kimyasalları kullanın. APTES ((3-aminopropil) triethoxysilan) ve PEG (polietilenglikol) (Tablo 1 e bakınız) için -20 ° C sıcaklıkta ve nitrojen veya argon gazı altında, her iki kimyasal saklayın higroskopiktir ve PEG havada oksidasyon tabidir. </li><li> Ideal olarak, bir nitrojen atmosferde ile bir Torpido gözü sistemi içinde, daha küçük hacimde hazırlanması, atmosferik oksijen ve neme stokunun sık maruz kalmasını önlemek için,yeniden. </li></ol> 2. Ekipman Kurulumu NOT: olası çapraz bulaşmayı önlemek için, her adım için taze ve temiz kapları kullanın. <ol><li> Temiz cam ve 60 ° C&#39;de bir ultrasonik banyoda 30 dakika, deterjan çözeltisi içinde cımbız. </li><li> Durulayın ve ultra saf su ile iki kez iyice aşama 2.1 sonikat ekipman. </li><li> RCA çözelti içinde aşama 2.1 Isı donatımı (ultra-saf su, hidrojen peroksit ve amonyak (5: 1: 1)) 75 °, 45 dakika için bir fırın içinde Cı ve daha sonra ultra-saf su ile durulanır. </li><li> Son olarak, bir kuru nitrojen akımı altında ya da bir fırında (100 ° C, 3 saat) olarak cam ve cımbız kurutun. </li></ol> 3. İpucu İşlevselleştirilmesi NOT: cımbız, kaplar, paslanmaz çelik, PTFE, cam ya da uygunsa organik çözeltiler, kimyasal olarak stabil olan herhangi bir başka malzemeden yapılmış. Aksi belirtilmediği sürece, R tüm adımları gerçekleştirmekİnkübasyon çözeltisi miktarı gerekli T. konsol fiş sayısına bağlıdır. Çıkma tüm zamanların ilgili çözümleri dalmış emin olun. NOT: Organik buharların solunması bir başlık kullanın. <ol><li> Konsol yüzeyi (&#39;aktivasyon&#39;) (yaklaşık 0.5 saat) üzerinde, OH-gruplarının oluşumu: <ol><li> Temiz bir cam slayt ve bir plazma odasına (100 W) koyun (10-100 pN / nm: SİN, yay sabiti malzeme) taze konsol yongaları yerleştirmek için cımbız kullanın. </li><li> Odasını (~ 0.1 mbar) boşaltın. </li><li> Oksijen gazı ile Taşkın odası ve yine tahliye. </li><li> (:% 20, süre: 15 dk, süreç basıncı: 0.25 mbar gücü) plazma işlemi etkinleştirin. </li></ol></li><li> Dirseklerin amino-silanizasyon (yaklaşık 1 saat): <ol><li> Plazma işlemi sırasında ideal bunu - APTES çözeltisi 2,5 ml hazırlayın cam Petri kabındaki (Tablo 1). </li><li> ImmediatelPlazma işleminden sonra y aseton 1 saniye, her konsol daldırma ve APTES çözeltide hemen sonra koyun. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Dikkatlice 10 ml aseton ve bir kez de 10 ml kloroform içinde iki kez konsol fiş yıkayın. </li><li> İsteğe bağlı son adım: temiz bir cam slayt üzerinde bir önceki aşamada elde edilen Talep konsol yongaları ve 70 ° C&#39;de 30 dakika boyunca pişirin. Yüzey aktivasyonu, örneğin, UV tedavisi 12 için alternatif stratejiler de vardır unutmayın. </li></ol></li><li> PEGylation (yaklaşık 2 saat): NOT: Amino-silanizasyonla sırasında adımlar 3.3.1-3.3.4 yapınız. NHS ve maleimid grupları, sulu ortamlarda hidrolize tabi PEG kendisi havada oksidasyon tabidir. Bu nedenle, (özellikle adımlar arasında) zamanlama kritik bir parametredir. Daha fazla bilgi için 13 bakın. <ol><li> Kloroform çözeltisi (Tablo 1) hazırlayın. </li><li> Yoğunlaşmayı önlemek içinSıcak PEG bölüntüsünün açılması ve uygun miktarda tartım önce oda sıcaklığına kadar tozlar. </li><li> Polimerler ya da amino grupları ile lipidlerin bağlanması için, ayrıca tamamen çözününceye kadar bunları döndürme, kloroform solüsyonu NHS-PEG-NHS (6 kDa) ve metil-PEG-NHS (5 kDa) çözme. Konsantrasyonları için Tablo 1&#39;e bakınız. <ol><li> Alternatif. tiyol grupları ile polimerlerin bağlanması için ayrı ayrı kloroform çözeltisi içinde Mal-NHS- PEG ve metil-PEG-NHS çözer. </li></ol></li><li> NHS- veya maleimide- ve metil-ile-sonlanan PEG molekülleri (500, tipik olarak 1) arasında belirli sayıda oranını ayarlamak için gereken çözüm karıştırın. Ideal oranı hazırlık-deney döngüsü bir seri tekrarlı belirlenmelidir unutmayın. </li><li> Kloroform buharlaşmasını önlemek üzere bir kloroform, doymuş bir atmosfer içinde 1 saat süre ile, PEG çözeltisi içinde konsol fiş inkübe edin. </li></ol></li><li> Molekül konjugasyon Probe(&gt; 1 saat): Not: Aşağıdaki 3.4.1-3.4.3 AFM ucuna farklı bir prob molekülleri kovalan bağlanması için üç örnek tarif edilmiştir. Her bir molekül için protokol ayarlanmalıdır. Örnek 1 ve 3, NHS-kimya örnek 2&#39;de tiol işlevselleştirilmiş polimer PI g-PS maleimid-kimya ile PEG&#39;e bağlanmış ise kullanılması daha fazla not. Detaylar 14 için bkz. <ol><li> Poli (amino asit), poli-D-tirosin (40-100 kDa) için <ol><li> 1 M NaOH içinde polytyrosine konjüge prob molekülü içinde çözülür. 1 mg / ml konsantrasyon ayarlayın. </li><li> Fonksiyonlaştırma hemen önce sıkma tuzdan arındırma sütunları (7 kDa MWCO) kullanılarak sodyum borat tamponu (pH 8.1) için NaOH Değişimi </li><li> Daha sonra, 5 ml etanol ve son olarak borat tamponu, 5 ml kloroform içinde, 5 ml, ilk konsol durulayın. </li><li> Polytyrosine borat tampon çözeltisi içinde 1 saat süre ile konsol fiş inkübe ve borat tampon maddesi ile durulanırve ultra saf su. Ölçüme kadar ultra saf su içinde saklayın. </li></ol></li><li> Doğrusal bir omurgasından (poliizopren, 119 kDa) sahip olan aşılanmış yan zincirler (polistiren, 88 kDa) 14 polimerler için <ol><li> Kuru kloroform içinde PI g-PS çözündürülür. 4 mg / ml konjugasyon çözeltisinin konsantrasyonu ayarlayın. </li><li> Kloroform, 5 ml ile konsol durulayın ve konjügasyon çözelti içinde en az 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> Kloroform, 5 ml içinde tekrar durulanır ve kloroform ile doymuş bir ortamda kloroform içinde depolamak ölçüm kadar (kloroform buharlaşmasını önlemek için). </li></ol></li><li> Lipid PAPA için <ol><li> Kuru kloroform içinde PAPA&#39;YI eritin. 20 mM konsantrasyonu ayarlayın. </li><li> 5 ml etanol ve lipid çözeltisi içinde 1 saat süre ile konsolun inkübasyondan önce, aşırı saf su, 5 ml konsol durulayın. </li><li> İnkübasyondan sonra, kloroform 5 ml etano 5 ml konsol durulamal ve (bu sırayla) ılık, ultra saf su 5 ml bağlanmamış prob molekülleri kaldırmak ve kloroform kalıntılarının kurtulmak için. Hemen fonksiyonelleştirilmiş ipuçlarını kullanın. Kadar gerekli Alternatif, kloroform saklayabilirsiniz. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52456/52456fig1.jpg" /> Şekil 1. (A) şematik NHS kimya örneği kullanarak ucu fonksiyonelleştirme sürecini gösteren. Bir amino grubu aracılığıyla ucu bir prob molekülünü bağlamak için kullanılan (B) Kimyasal bağlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 4. Yüzey Hazırlama <ol><li> Kendinden monte tek tabaka (SAM) Not: ilk olarak, örneğin bir yüzey olarak, kendi kendine bir araya tek tabaka seçildi. Literatürde 15 Bakınız </sAyrıntılar için&gt; kadar. <ol><li> Her biri 30 dakika için ultrasonik banyo içinde, aşırı saf su içinde iki kez daha sonra, deterjan çözeltisi ve temiz bir cam kayar. Daha sonra, ilave bir temizleme adımı olarak, 15 dakika boyunca 75 ° C&#39;de RCA çözeltisi (adım 2.3) yerleştirin. </li><li> Ceket 10 mil krom, nikel ve vakumlu bir kaplayıcı 100 nm altın ile kayar. Sonra önce doğrudan bir sonraki adıma RCA çözeltisi içinde tekrar buzdolabı ve temiz saklamak. </li><li> 12 saat boyunca 2 mM 1-dodecanthiol / etanol çözeltisi içinde, önceki aşamada elde edilen slaytlar inkübe edin. tiyol grupları, altın yüzeyine bağlanan ve bir hidrofobik tek tabakalı kendine bir araya getirmektedir. Bir azot gazı akımı ile etanol ve ultra saf su ve sonra kuru ile slaytlar durulayın. CCD kamera 10 ile bir gonyometre statik temas açısı ölçümleri ile hazırlanan yüzeye hidrofobikliğini onaylayın. </li></ol></li><li> Hidrojen sona elmas Not: ikinci, örneğin bir yüzey olarak, bir hidrojen sona elmas seçildi. Daha önce tarif edildiği gibi 16 yüzey hazırlığı gerçekleştirilmiştir. </li><li> Desteklenen çift katlı lipid NOT: Son örnekte, bir yüzey, destekli lipit iki tabakalı (SLB) bir yüzey olarak kullanılmıştır. Bu tür bir yüzey elde etmek için, fosfolipit POPC oluşan büyük tek lamelli vesiküller (LUVler) içindeki bir çözeltisi (0.1 mg / ml) çekme yöntemi ile oluşturulmuştur. Daha sonra LUV çözeltisi 50 ul Taze kırılmış mika tabaka (A = 1 cm²) üzerine konuldu ve 30 dakika süreyle inkübe edildi. Son olarak çözelti, ultra saf su 20 ml ile yıkandı. SLBS hazırlanmasına ilişkin ayrıntılı bilgi için 17,18 bakınız. </li></ol> 5. Veri Toplama NOT: deneyler için, sıvı ölçmek için yeteneği sağlayan bir AFM, kullanın. veri toplama ve veri analizi işlemleri ne olursa olsun kullanılan AFM modeli uygulanabilir. Ayrıca, bazı deneylerde bu sıcaklık kontrolü imkanı bulunması avantajlıdırSıvı hücre içinde e. Konsol saptırma lazer ışını saptırma yöntemiyle 19 ile tespit edilmiştir. Yay sabitleri ısıl gürültü yöntemi 20 ile belirlenmiştir. <ol><li> Sıvılarında ölçmek için uygun bir AFM konsol tutucu içine fonksiyonlandırılmış konsol yerleştirin. </li><li> (Hazırlık yukarıya bakınız) yüzey koyun AFM içine numune alınacak ve sıvı ile örtün. Hem konsol ve yüzey artık konsol ucu yüzeyine doğru bakacak şekilde sıvıya batırılmış olmalıdır. Birçok durumda bir sıvı damla yeterli olduğuna dikkat edin. Sıvının her durumda buharlaştırılarak bir kapalı akışkan hücre kullanılarak, örneğin, kaçınılmalıdır. </li><li> Varsa, kontrolör üzerinde istenen sıcaklığını ayarlamak. </li><li> Sistem, en azından yarım saat boyunca dengelenmeye bırakın. </li><li> Etkileri sönümleme herhangi bir yüzeye çıkarmak için uzak yüzeyden konsol ile konsolun bir termal gürültü spektrumu kaydedin. Not genellikle 1 olduğu0 ya da daha fazla spektrumu yeterli bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için kartı olması gerekir. </li><li> Yüzeyi yaklaşın. Ucu geometrisi ve uç işlevselleştirilmesini korumak amacıyla yaklaşım süreci dikkatle yürütülen gerektiğini unutmayın. Bu aralıklı, kontak modunda, yaklaşan, örneğin, gerçekleştirilebilir. </li><li> Nm / volt olarak ölçülen ters optik kolu hassasiyeti (InvOLS) belirleyin. Sert bir yüzeye karşı konsol ucu iterek bunu yapın. <ol><li> Fotodiyot gerilimi değişim vs piezo seyahat mesafesi eğimini ölçerek InvOLS belirleyin. Konsol uç yüzeyi ile temas halinde olan kuvvet-mesafe eğrisi parçası için bir çizgi monte edin. Lipit bilayers gibi yumuşak bir yüzey içeren deneylerde, bir çift katlı lipid (&#39;kusur noktalar&#39;) ile kaplı olmayan alanlarda bu adımı yürütmek. </li></ol></li><li> Isıl gürültü spektrumu bir harmonik osilatör takarak yay sabiti (pN / nm) belirleyin. Kullanımyay sabiti belirlenmesi için otomatik yazılım fonksiyonu; aksi takdirde edebiyat 20 danışın. </li><li> Denemeyi başlatın. <ol><li> Her deneysel koşul Tutanak sayıda kuvvet-mesafe eğrileri. 1 mikron mesafe geri, 5 kHz, 1 mikron / sn ucu hızı Örnekleme oranı: Genellikle, deneysel parametreler için aşağıdaki değerleri kullanın. Not: Bazı durumlarda, incelenen deney dinamiklerine bağlı olarak, (&#39;bekleme süresi&#39;) yüzeyi ile temas halinde ucu ile belli bir süre beklemek gerekli olabilir. Not: Deney özel parametreler, yukarıda verilen değerlerden büyük ölçüde sapma gösterebilir. </li><li> Uzun süreli ölçümler sırasında, fotodiyot yeniden konumlandırarak zaman zaman fotodiyot üzerine lazer konumunu sıfır. </li><li> İsteğe bağlı: Her kuvvet eğrisi sonra, başka bir xy konumuna AFM-ucu değiştirin. </li><li> Deneyin sonunda, duyarlılık ve bahar belirlemek ConstaSistemin tutarlılık ve istikrar kontrol etmek için tekrar nt. NOT: öncesi ve deney sonrası yay sabiti ve duyarlılık karşılaştırılması da sistemin özellikleri ve bahşiş özellikleri deney boyunca değişmeden kaldığını sağlamak için bir araçtır. Yay sabitleri farkı (&lt;=% 15) çok büyük değilse yay sabiti tayin içsel belirsizlik de% 15 civarında olduğu, onlar, ortalama olabilir. Daha büyük farklar için, ilk bulmak ve daha fazla deneyler ile devam etmeden önce değişen belirgin yay sabiti nedenini ortadan kaldırmak için tavsiye edilir. </li></ol></li></ol> 6. Veri Hazırlama NOT: genellikle newton ve nanometre yanı sıra veri açıklanmıştır düzeltmek için birimleri dönüştürmek için deney belirli tip bağımsız yürütülen bu bölümde genel veri hazırlama adımlarında. Deney belirli veri analizleri br olaniefly ilgili temsili bir örneği bölümünde aşağıda daha ayrıntılı olarak tarif edildiği. <ol><li> Tipik olarak, tüm veri hazırlama yürütmek ve analiz yazılımı IGOR 6 Pro dayalı, örneğin ev-yazılı algoritması tarafından otomatik adımları. </li><li> InvOLS [nm / V] ve bahar sabit [NN / nm] ile çarpılarak yürürlüğe ham sapma sinyali (Defl) [V] dönüştürün. </li><li> Yüzey (boş kanat) yeterli mesafede dirsekteki kuvvet 0 nN olur şekilde kuvvet Ofset. </li><li> Gerçek ucu konumunu dikkate konsol bükülmesini alır z *, (yüzey göre ölçülen da denir ayrılması) hesaplayın: <img alt="Denklem 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52456/52456eq1.jpg" /></li><li> Z * = 0 yüzeyinin z pozisyonuna karşılık gelecek şekilde Z * Ofset. NOT: Burada, F ucu ve dolayısıyla viraj hareket kuvvetKonsol (adım 6.2 olarak tespit edilmiştir.) z, (doğrudan alet ile gösterilir) ve k, yay sabitesine (adım 5.8 belirlenen) temsil ölçülen z sensör konumu s. </li></ol><img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52456/52456fig2.jpg" /> Numune hazırlama, veri toplama ve veri analizi gösteren Şekil 2. Süreç akış diyagramı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<ol>
	<li>Scheuring, S., Sapra, K., M&#252;ller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Single+Membrane+Proteins+by+Atomic+Force+Microscopy.">Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy.</a> Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).</li><li>Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+imaging+of+walking+myosin+V+by+high-speed+atomic+force+microscopy.">Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy.</a> Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).</li><li>Magonov, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+in+Analysis+of+Polymers.">Atomic Force Microscopy in Analysis of Polymers.</a> Encyclopedia of Analytical Chemistry. , (2006).</li><li>Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-dependent+mechanics+of+single+DNA+molecules.">Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules.</a> Nature Structural Biology. 6 (4), 346-349 (1999).</li><li>Li, H., Linke, W. a., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+engineering+of+the+giant+muscle+protein+titin.">Reverse engineering of the giant muscle protein titin.</a> Nature. 418 (6901), 998-1002 (2002).</li><li>Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+of+DNA+mechanics.">Single-molecule studies of DNA mechanics.</a> Current opinion in structural biology. 10 (3), 279-285 (2000).</li><li>Zhang, W., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+mechanochemistry+of+macromolecules.">Single molecule mechanochemistry of macromolecules.</a> Progress in Polymer Science. 28 (8), 1271-1295 (2003).</li><li>Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Stretched+Single+Polymers:+Atomic-Force-Microscope+Experiments+Versus+Ab-Initio+Theory.">Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory.</a> Physical Review Letters. 94 (4), 048301 (2005).</li><li>Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lipid+Extraction+-+The+Anchoring+Strength+of+Cholesterol+in+Liquid+Ordered+and+Liquid+Disordered+Phases.">Single Lipid Extraction - The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid Ordered and Liquid Disordered Phases.</a> Biophysical journal. 107 (5), (2014).</li><li>Pirzer, T., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+mechanism+of+polypeptides+and+their+location+at+hydrophobic+interfaces.">Adsorption mechanism of polypeptides and their location at hydrophobic interfaces.</a> Chemphyschem. 10 (16), 2795-2799 (2009).</li><li>Butt, H. -. J., Cappella, B., Kappl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+measurements+with+the+atomic+force+microscope:+Technique,+interpretation+and+applications.">Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications.</a> Surface Science Reports. 59 (1-6), 1-152 (2005).</li><li>Nash, M. A., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Adhesion+of+a+Copolymer+to+Gold.">Single-Molecule Adhesion of a Copolymer to Gold.</a> ACS NANO. 6 (12), 10735-10742 (2012).</li><li>Hermanson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. , (1996).</li><li>Kienle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+molecular+architecture+on+single+polymer+adhesion.">Effect of molecular architecture on single polymer adhesion.</a> Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (15), 4351-4357 (2014).</li><li>Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayers+of+alkanethiols+on+gold:+comparisons+of+monolayers+containing+mixtures+of+short-+and+long-chain+constituents+with+methyl+and+hydroxymethyl+terminal+groups.">Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups.</a> Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1995).</li><li>Dankerl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diamond+Transistor+Array+for+Extracellular+Recording+From+Electrogenic+Cells.">Diamond Transistor Array for Extracellular Recording From Electrogenic Cells.</a> Advanced Functional Materials. 19 (18), 2915-2923 (2009).</li><li>Leonenko, Z. V., Carnini, A., Cramb, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayer+formation+by+vesicle+fusion:+the+interaction+of+phospholipid+vesicles+with+surfaces+and+the+effect+of+gramicidin+on+bilayer+properties+using+atomic+force+microscopy.">Supported planar bilayer formation by vesicle fusion: the interaction of phospholipid vesicles with surfaces and the effect of gramicidin on bilayer properties using atomic force microscopy.</a> Biochimica et biophysica acta. 1509 (1-2), 131-147 (2000).</li><li>Stetter, F. W. S., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nanomechanical+Properties+of+Lipid+Membranes+are+Significantly+Influenced+by+the+Presence+of+Ethanol.">The Nanomechanical Properties of Lipid Membranes are Significantly Influenced by the Presence of Ethanol.</a> Biophysical Journal. 104 (5), 1049-1055 (2013).</li><li>Putman, C. A. J., De Grooth, B. G., Hulst, N. F., Greve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detailed+analysis+of+the+optical+beam+deflection+technique+for+use+in+atomic+force+microscopy.">A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy.</a> Journal of Applied Physics. 72 (1), 6-12 (1992).</li><li>Hutter, J. L., Bechhoefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+atomic-force+microscope+tips.">Calibration of atomic-force microscope tips.</a> Review of Scientific Instruments. 64 (7), 1868 (1993).</li><li>Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+desorption+kinetics+from+single+molecule+force+spectroscopy+studies.">Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).</li><li>Li, I. T. S., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacial+free+energy+governs+single+polystyrene+chain+collapse+in+water+and+aqueous+solutions.">Interfacial free energy governs single polystyrene chain collapse in water and aqueous solutions.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6530-6540 (2010).</li><li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory,+analysis,+and+interpretation+of+single-molecule+force+spectroscopy+experiments.">Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).</li><li>Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lipid+Extraction:+The+Anchoring+Strength+of+Cholesterol+in+Liquid-Ordered+and+Liquid-Disordered+Phases.">Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases.</a> Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).</li><li>Horinek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+adsorption+on+a+hydrophobic+surface+results+from+an+interplay+of+solvation,+surface,+and+intrapeptide+forces.">Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).</li><li>Ebner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalization+of+probe+tips+and+supports+for+single-molecule+recognition+force+microscopy.">Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy.</a> Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).</li><li>Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Adhesion+at+the+Solid-Liquid+Interface+Probed+by+a+Single-Molecule+Force+Sensor.">Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor.</a> Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).</li><li>Morfill, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-matured+recombinant+antibody+fragments+analyzed+by+single-molecule+force+spectroscopy.">Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy.</a> Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Son on yılda, tek bir molekül deneyler moleküler mekanizmaları görülmemiş anlayışlar sağladı ve yaşam bilimleri ve ötesinde paha biçilmez bir yaklaşım olduğu ortaya çıktı oylandı. SMFs deneyler, ideal olarak, tek ve aynı molekül deney bütün boyunca kullanıldığı iyi ve anlamlı istatistikleri elde etmek için. Moleküllerin toplulukları ile deneylerde aksine, SMFs deneyleri nadir olaylar ve gizli moleküler devletleri tespit edebiliyoruz. Tek bir molekül deneylerin başka bir avantajı, mol...

Son 30 yılda, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) her üç boyutta molekül uzaysal çözünürlüğü sağlar ve çeşitli çözücü çalıştırılabilir beri biyolojik 1,2 ve sentetik 3 malzeme ve yüzeyleri incelemek için değerli bir görüntüleme tekniği olduğu ortaya çıktı etti ortamları. Buna ek olarak, AFM-tek molekül kuvvet spektroskopisi (SMFs) rejimi μN için pN arasında değişen kuvvetleri ölçmek için sağlar ve 4,5 katlama protein içine örneğin görülmemiş içgörü, polimer fiziği 6 vermiş - 8, ve tek bir molekül yüzey etkileşimi 9 - Tek molekülleri yerine moleküllerin bir topluluk okuyan arkasında 12 .The mantık genellikle nadir olaylar veya gizli moleküler durumları maske etkileri ortalama kaçınmaktır. Bundan başka, bu gibi çevre uzunluğu Kuhn uzunluğu, yapışma serbest enerjisi gibi moleküler parametrelerin çok sayıda olabilirelde edilmiştir. Bu, aşağıdaki örneklerde detaylı olarak tarif edilmektedir. Tipik AFM SMFs deneyde, prob molekülü, bir bağlayıcı molekül vasıtası ile çok keskin ucu ile birleştirilir. ucu kendisi bükülebilir konsolun sonunda yer almaktadır. Uç yüzeyi ile temas haline getirilir ise prob molekülü, bu yüzey ile etkileşim. Yüzeyden molekülün koparılması için ucu, kuvvet ve dolayısıyla serbest enerji geri çekilmesi üzerine konsol sapmasını gözlemleyerek tespit edilebilir. Anlamlı istatistikleri elde etmek için, adı verilen kuvvet-mesafe eğrisi çok sayıda elde edilecek var. Ayrıca, prob molekülü AFM ucuna kovalent bağlanmış olmalıdır (yani, bir ve bütün deney süresi boyunca aynı prob molekülünü kullanarak) gerçek tek bir molekül deneyler var. Burada, bir kovalent bağ aracılığıyla oluşturulması, tek bir molekül ile konsol işlevsellik için bir deney protokolü sunulmaktadır. tek bir molekül ya da bir amino ya da bir tio üzerinden bağlanabilirAFM ucu l grubudur. birleşme işlemi kullanılan polimer çözme özelliklerini hesaba almak için (organik ve sulu) çözücülerin geniş bir yelpazesi içinde uygulanabilir. Birinci bölümde, genel bir protokol kovalent açıklanan bir AFM ucu bir bağlayıcı molekülü vasıtasıyla tek bir molekül (&quot;prob molekülü&quot;) eklemek için. Bu amaçla, organik NHS- ya da maleimid-kimya 13 kullanılır. Üç örnek moleküller için protokol ile birlikte, veri toplama, veri analizi işlemleri tarif edilmiştir ve daha fazla okuma referansları verilmiştir. Örnek moleküllerdir: (lineer) polimeri tirosin, ekleme polimer PI g PS ve lipit POPE. Örnek kovalent sisteinleri eklemek için bu protokolün hafif varyasyonları içerir. Buna ek olarak, bir bölümü, bir elmas yüzey, CH3 -Self monte tek ve lipid çift tabakaları gibi farklı yüzeylerin hazırlanması ile ayrılmıştır. Bu arayüzler ata vartr iyi referanslar ve örnek olmak.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution)</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35%), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v))</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane</td><td>Vectorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry acetone (&amp;lt; 50 ppm H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry chloroform (&gt; 99.9%)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure water</td><td>Biochrom, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di-sodium tetraborate (&gt;&amp;nbsp;99.5%)</td><td>Biochrom, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Biochrom, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monofunctional &amp;alpha;-methoxy-&amp;omega;-NHS PEG, 5 kDa, &amp;ldquo;methyl-PEG-NHS&amp;rdquo;</td><td>Rapp, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heterobifunctional &amp;alpha;,&amp;omega;-bis-NHS PEG, 6&amp;nbsp;kDa, &amp;ldquo;NHS-PEG-NHS&amp;rdquo;</td><td>Rapp, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heterobifunctional &amp;alpha;-maleimidohexanoic- &amp;omega;-NHS PEG, 5 kDa, &amp;ldquo;Mal-PEG-NHS&amp;rdquo;</td><td>Rapp, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probe molecule (polymer, lipid, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10&amp;nbsp;ml), glass Petri dishes (500 &amp;micro;l) and glass lids</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td>&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Laboratory oven model UF30</td><td>Memmert, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperature controlled sonicator</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma system &quot;Femto&quot;, 100 W</td><td>Diener, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>One separate glass syringe for each organic solvent</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes: 10-100 &amp;micro;l, 50-200 &amp;micro;l and 100-1,000&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM with temperature controlled fluid cell (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; MFP-3D with BioHeater)</td><td>Asylulm Research, Santa Barbara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; MLCT)</td><td>Bruker AXS, Santa Barbara</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

investigating single molecule adhesion by atomic force spectroscopy

Atomik kuvvet spektroskopisi yüzeyleri ve arayüzleri de molekülleri incelemek için ideal bir araçtır. Kovalent bir AFM ucu üzerine çift tek moleküllerin büyük bir çeşitlilik için deneysel bir protokol sunulmuştur. Aynı zamanda AFM ucu ucuna AFM bağlı tek molekülleri incelemek için bir ön koşuldur ucu ve alt tabaka arasındaki spesifik etkileşimleri önlemek için pasifize edilir. Analizler yapışma kuvveti, yapışma uzunluğu, kısa bir süre sunulmaktadır ve ileri okuma için dış referanslar verilmektedir katı yüzeyler ve biyo-arayüzleri bu moleküllerin serbest enerjisini belirlemek için. Örnek molekülleri, poli (amino asit) polytyrosine olan ekleme polimer PI g PS ve fosfolipid POPE (1-palmitoil-2-oleoil sn -glisero-3-fosfoetanolamin). Bu moleküller CH 3 -SAMs gibi farklı yüzeyler, hidrojen sona elmas kusturulmuş ve çeşitli çözücü koşullarda lipit katmanlarını desteklenmektedir. Son olarak,kuvvet spektroskopik tek bir molekül deneyler avantajları gerçekten tek bir molekülün deneyde incelenmiştir belirtilen yöntemler karar da dahil olmak üzere ele alınmaktadır.

Aşağıda yukarıda belirtilen sonuçları örneğin molekülleri, yani polimer poli (amino asit) polytyrosine tarif ekleme polimer PI g PS ve fosfolipid POPE sunulmaktadır. İlk olarak her örnek için temin edilmiştir, veri toplama ve veri hazırlama için özel ayrıntıları deney. Daha sonra, bu moleküller, farklı yüzeylerden dezorbe deneylerde için örnek sonuçlar (CH 3 -SAMs, hidrojen sona elmas ve lipid bilayers) gösterilmektedir. Yapışma kuvveti, yapışma uzunluğu ve serbest ene...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy at JoVE.com

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Atomik Kuvvet Spektroskopi Tek Molekül Yapışma incelenmesi

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

investigating-single-molecule-adhesion-by-atomic-force-spectroscopy

Research

JoVE Journal

Engineering

10.3K Görüntüleme.  Technische Universität München. A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Video: Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

Kolloidal Probe Nanoscopy kullanarak parçacık-parçacık Etkileşimleri Nicel ve Nitel Sınav

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

Kimya

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

Yapışma için Frekans Testi Yerinde</emHücre-Hücre Arayüz Çapraz Junctional Moleküler Etkileşimler> Kinetik Analizi

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Biyomühendislik

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Biyokimya

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Tek Molekül Kuvvetleri Spektroskopisi kullanarak İnorganik Malzemelerle Amino Asitler ve Peptitler Etkileşimi içine Trendleri

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and surfaces. For a true single molecule experiment, covalent attachment of the probe molecule is essential because only then can hundreds of force-extension traces with one and the same single molecule be obtained. Many traces are in turn necessary to prove that a single molecule alone is probed. Additionally, passivation is crucial for preventing unwanted interactions between the single probe molecule and the AFM cantilever tip as well as between the AFM cantilever tip and the underlying surface. The functionalization protocol presented here is reliable and can easily be applied to a variety of polymers. Characteristic single molecule events (i.e., stretches and plateaus) are detected in the force-extension traces. From these events, physical parameters such as stretching force, desorption force and desorption length can be obtained. This is particularly important for the precise investigation of stimuli-responsive systems at the single molecule level. As exemplary systems poly(ethylene glycol) (PEG), poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) and polystyrene (PS) are stretched and desorbed from SiOx (for PEG and PNiPAM) and from hydrophobic self-assembled monolayer surfaces (for PS) in aqueous environment.

Covalent attachment of probe molecules to atomic force microscopy (AFM) cantilever tips is an essential technique for the investigation of their physical properties. This allows us to determine the stretching force, desorption force and length of polymers via AFM-based single molecule force spectroscopy with high reproducibility.

AFM tabanlı Kuvvet Spektroskopisi için Tek Moleküllerin Kovalent Eki

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Konsol Tabanlı Nanogirinti: Hava ve Sıvıda Nanoölçekte Mekanik Özellik Ölçümleri

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

Mühendislik

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

Tek-T hücreleri veya tek parçacık Immünolojik tek hücreli kuvvet spektroskopisi ile Atomic Force mikroskop Cantilevers functionalization

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

Atomik Kuvvet Spektroskopi Tek Molekül Yapışma incelenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

PLAYLIST