Name: the bioconjugation and radiosynthesis of 89zr-dfo-labeled antibodies
Uploaded: 2015-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies at JoVE.com

Yazarlar yararlı konuşmalar Prof. Thomas Reiner, Jacob Houghton, Dr. Serge Lyaschenko teşekkür ederim.

Tarif in vivo hayvan deneylerinde tüm onaylanmış protokole ve Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) etik kurallar altında göre yapıldı. J591 için DFO-NCS 1. Konjugasyon <ol><li> 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 1 x fosfat tamponlu tuzlu çözelti (pH 7.4) ya da 0.5 M HEPES tampon (pH 7.4) ya da 1 ml J591 bir 2-5 mg / ml bir solüsyon hazırlanır. </li><li> 5-10 mM (3,8-7,6 mg / ml) arasında bir konsantrasyonda kuru DMSO içinde bulunan DFO-NCS ile çözülmüştür. Sonikasyon veya girdap tamamen çözünmesini kolaylaştırmak için iyice çözelti. </li><li> Az miktar 0.1 M Na-2 (&lt;10 | il) CO 3 eklenerek 8,8-9,0 için J591 çözeltinin pH ayarlayın. </li><li> Antikor çözeltisi doğru pH değerinde sonra, çift işlevli çelatör ve bir 3-4 kat molar fazlalık karşılık gelen DFO-NCS bir çözelti hacminin ilave edin. <ol><li> Sınavaple, bir 2 mg / ml J591 antikor çözeltisi, 1 ml (13.3 nmol J591) için 10 mM (7.6 mg / ml) DFO-NCS çözeltisi (40.4 nmol DFO-NCS), 4-5 ul ekle. Nihai sulu reaksiyon karışımı içinde DMSO miktarının% 2 v / v geçmemelidir. </li></ol></li><li> 350 rpm&#39;de çalkalanarak bir ısıtma bloğu üzerinde 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca reaksiyon inkübe edin. </li><li> 37 ° C&#39;de 1 saat sonra, yıkama sıvısı olarak 0.5 M HEPES tampon (pH 7.4) kullanılarak, 50,000 molekül ağırlığı kesmesi olan bir önceden paketlenmiş tek boyut dışlama tuz giderme kolonu kullanılarak elde edilen immünokonjugat temizler. Bu adım tamamlandıktan J591-DFO yapısının bir 2 ml solüsyon verecek. </li><li> UV-Vis spektrofotometre üzerinde inşa J591-DFO konsantrasyonu ölçün. </li><li> Yapının daha yüksek bir konsantrasyonu istendiğinde, 50,000 molekül ağırlığı kesmesi olan bir santrifüj filtre birimi kullanılarak J591-DFO çözelti konsantre edilir. </li><li> Karanlıkta -20 ° C&#39;de tamamlanan J591-DFO immünokonjügenin çözümü saklayın. </ol> 89 Zr 2. Radyo-etiketlenmesi J591-DFO DİKKAT: protokolün Bu adım işlenmesini ve radyoaktivite manipülasyonu içerir. Bu adımları gerçekleştirmeden veya ev kurumun Radyasyon Güvenliği Bölümü ile danışmalısınız radyoaktivite araştırmacılar ile başka bir iş yapmadan önce. Mümkün olan tüm adımlar iyonize radyasyona maruziyeti en aza indirmek için önlemler alınmalıdır. NOT: Uygun radyokimyasal not tutma adına, örnekteki radyoaktivite miktarı, bir doz kalibratörü kullanılarak ölçüldü ve kaydedildi edilmelidir aşağıdaki protokol Adımlar 2,2-2,13 sonra. Bu radyokimyasal verim ve belirli faaliyetlerin doğru kararlılıkla yardımcı olacaktır. <ol><li> 0.5 M HEPES tamponu, pH 7.5, 200 ul J591-DFO 0.5-2.0 mg ihtiva eden bir çözelti hazırlayın. </li><li> Hacmi Pipet &lt;2 ml&#39;lik plastik bir vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüpü içine 1,0-6,0 mCi (37-222 MBq) karşılık gelen (tipik olarak 1.0 M oksalik asit bulunur) destek&gt; 89 Zr 4+ stok çözeltisi. 1.0 M oksalik asit kullanılarak toplam 300 ul bu çözümün ses seviyesini ayarlayın. </li><li> 1,0 M Na-2 CO 3 ile 6,8-7,5 89 Zr 4+ çözeltinin pH ayarlayın. Istenen pH&#39;ı elde etmek üzere bir baz alikotları daha küçük (&lt;10 ul) ekleyin daha sonra 89 Zr 4+ çözeltisine CO 3 1.0 M Na-2 250 ul ekleyerek başlayın ve. </li><li> Aşama 2.1&#39;de elde J591-DFO çözeltisine pH ayarlı 89 Zr 4+ solüsyonunun arzu edilen miktarı ekleyin. </li><li> Bu 6,8-7,5 istenen aralık içine düşmesi için emin olmak için, radyo-etiketleme, reaksiyon karışımının pH değerini kontrol edin. </li><li> 350 rpm&#39;de çalkalanarak bir ısıtma bloğu üzerinde oda sıcaklığında 60 dakika süre ile, radyo-etiketleme reaksiyonu inkübe edin. </li><li> Kuluçkadan 60 dakika sonra, uçucu ölçmekRadyo-TLC kullanarak reaksiyonun ürünü iolabeling. <ol><li> Bu amaçla, bir silis emdirilmiş TLC şeridinde, radyo-etiketleme, reaksiyon karışımının 1 uCi nokta. 50 mM DTPA (pH 5.5) bir yıkama sıvısı kullanılarak TLC çalıştırmak, kısım kurumasını bekleyin ve bir radyo-TLC tarayıcı kullanarak TLC şerit analiz. 89 Zr 4+ kökenli görünecektir J591-DFO yapı bağlı (R &lt;Zr 89 serbest 4+ katyonlar DTPA ile şelatlı edilecek ve çözücü ön (R f ile Zehir olurken 0.1),&gt; 0.9) f. </li><li> , Radyokromatogramdır entegre eğrinin altındaki toplam alan ile 0,0-0,1 f R eğri altında kalan alan bölünmesi ve 100 ile çarpılması ile reaksiyonun Radyoetiketleme verimi,. </li></ol></li><li> Radyoetiketleme verimi, yeterli (tipik olarak&gt; 2 mCi / mg teorik spesifik aktivite) olması durumunda, 50 mM DTPA, pH 5.5, 5 ul ile reaksiyonun söndürülmesi. </li><li> Elde immünokonjugat usi arındırınng, 5 mg / mL gentisik asit ile 5 mg / mL gentisik asit veya 0.25 M sodyum asetat (pH 5.5) ile% 0.9 steril tuzlu su ya da bir yıkama sıvısı kullanılarak bir 50,000 molekül ağırlığı kesmesi olan bir önceden paketlenmiş tek boyut dışlama kullanımlık tuz alıcı sütun . Bu adım tamamlandıktan 89, Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate bir 2 ml solüsyon verecek. </li><li> Aşama 2.7 de tarif edildiği gibi saflaştırmadan sonra, radyo-TLC kullanarak 89, Zr-DFO-J591 radyokimyasal saflığının doğrulanması. </li><li> Ilk olarak saflaştırılmış 89, Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate izole radyoaktivite miktarına göre antikor çözeltisine ilave etkinlik miktarını bölerek reaksiyonun tüm Radyoetiketleme verimi,. </li><li> Radyoetiketleme reaksiyonunda DFO-J591 ilk kütle itibariyle arındırılmış 89, Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate izole aktivitesi miktarının bölünerek nihai spesifik aktivite hesaplanır. </li><li> Daha yüksek bir konsantrasyonu, arzu edildiği takdirde, inci konsantreE 89 50000 molekül ağırlığı kesmesi olan bir santrifüj filtre birimi kullanılarak, Zr-DFO-J591 çözeltisi. NOT: Son arıtma aşamasında kullanılan gentisik asit nedeniyle radyoliz antikorun zararın en aza düşürülmesi için kullanılan bir radyo-koruyucu olduğu 46 da 4 ° C &#39;de en fazla 48 saat için 89, Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate depolanması. mümkün, bu tavsiye edilmez. Radioimmunoconjugate saklanabilir ise, hipoklorit aracılı radyoliz riskini en aza indirmek amacıyla, depolama tamponu olarak, 5 mg / mL gentisik asit 0.25 M sodyum asetat (pH 5.5) kullanın. 47 </li></ol> 89 Zr-DFO-J591 ile Vivo PET Görüntüleme 3. DİKKAT: Protokol Bölüm 2&#39;de olduğu gibi, protokol, bu adımı işlenmesini ve radyoaktivite manipülasyonu içerir. Bu adımları gerçekleştirmeden önce araştırmacılar kendi kurumun Radyasyon Güvenliği Bölümü ile başvurmalısınız. Tüm possible adımlar iyonize radyasyona maruziyeti en aza indirmek için önlemler alınmalıdır. <ol><li> Erkek atimik çıplak farelerde deri altından, 5 x 10 6 LNCaP prostat kanser hücreleri implant ve bu (3-4 hafta, aşılamadan sonra) 100-150 mm3 xenograft büyümeye izin verir. 44 &#39; </li><li> % 0.9 steril tuzlu su içinde 1.0 mCi / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar 89, Zr-DFO-J591 radioimmunoconjugate seyreltin. </li><li> 89, Zr-DFO-J591 çözeltisi (200 uCi, 7.4 MBq) 200 ul enjekte edilir. Nakil doku taşıyan kobay farelerinin yanal kuyruk damarı içine 48 </li><li> Istenen görüntüleme zaman noktasında (örneğin, 12, 24, 48, 72, 96 ya da 120 saat sonra enjeksiyon), bir% 2 izofluran ile anestezi fare: oksijen gazı karışımı. </li><li> Küçük hayvan PET tarayıcı yatakta farenizle ve% 1 izofluran kullanarak tarama sırasında anestezi korumak: Oksijen gazı karışımı. Tarayıcı yatakta hayvan yerleştirerek önce, ayak-tutam yöntem ve Uyg kullanarak anestezi doğrulamakanestezi sırasında kurumasını önlemek için fare gözleri y oftalmik merhem. 49 </li><li> 350-700 keV enerji penceresi ve 6 nsaniye bir tesadüf zamanlama penceresini kullanarak 40 milyon tesadüf olaylar minimum statik tarama yoluyla fare PET veri elde. 50 </li><li> Görüntü yakalanmasını tamamladıktan sonra, gözetimsiz fare bırakmayın ve bilinci kazanmış kadar diğer fareler ile bir kafese koymayın. </li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Inşaat, Radyoetiketleme ve görüntüleme 89 Zr-DFO-etiketli radioimmunoconjugates oldukça basit prosedür genellikle iken, bu sürecin her aşamasında akılda birkaç önemli hususlar tutmak önemlidir. Örneğin, diyelim prosedürün konjugasyon aşamasında endişe en muhtemel nedeni birleşme reaksiyonu sırasında antikorun toplanmasıdır. Bu sorun, genellikle DFO-NCS stok çözeltisi ilave edildikten sonra birleşme reaksiyonu zayıf bir karıştırma ürünüdür. Bu durumda, DFO-NCS homojen olmaya...

Dolayı belirgin bir duyarlılık, afinite ve seçicilik için, antikorlar çok kanser hücrelerine radyoizotoplar verilmesi için gelecek vaat eden vektörler olarak kabul edilmiştir. Ancak, pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntüleme başvurularının kendi etiketleme için uygun bir pozitron yayan radyoizotop eksikliği engel olmuştur. Radioimmunoconjugates tasarımında en kritik hususlar 1-3 birisi fiziksel çürüme eşleştirme yarı antikor in vivo farmakokinetik radyoizotop hayatı. Daha özel olarak, antikorlar, çoğu zaman, nispeten uzun, çok günlük biyolojik yarılanma ömürlerine sahiptir ve bu nedenle benzer fiziksel yarı ömrü olan radyoizotoplar ile işaretlenmelidir. PET görüntüleme uygulamaları için, antikorlar geleneksel 64 Cu (t 1/2 = 12.7 saat), 86 Y (t 1/2 = 14.7 saat), ya da 124 I (t 1/2 = 4.18 d). 4 ile radyoaktif işaretli olmuştur, 5 Bununla birlikte, her birBu radyoizotoplar klinik görüntüleme için uygunlukları engel önemli sınırlamalar sahiptir. 86 Y ve 64 Cu ile etiketlenmiş radioimmunoconjugates Klinik öncesi araştırmalarda umut verici kanıtlamış olmakla birlikte, her iki izotoplar insanlarda görüntüleme için etkili olduğu için çok kısa olan bir fiziksel yarılanma ömürlerine sahiptirler. 124 I, aksine, bir hemen hemen ideal fiziksel bir yarı ömre sahip antikorlar ile görüntüleme, ama pahalı ve nispeten düşük çözünürlüklü klinik görüntüleri neden optimal çürüme özelliklere sahiptir. Bundan başka, 124-işaretli radioimmunoconjugates, in vivo olarak tümör-zemin aktivitesi oranını düşürebilir bir işlem ite tabi olabilir. 6,7 Sürücü 64 Cu, 86 Y yerini bir pozitron yayan radyoizotop bulmak ve radioimmunoconjugates 124 Ben 89 Zr-etiketli antikorlar araştırma son dalgalanma körükledi. 8-12 T89 Zr habercisi de nedeni basittir: radiometal tanısal PET radioimmunoconjugates kullanım için ideale yakın kimyasal ve fiziksel özelliklere sahip 13 89 Zr 89 Y (p, n) bir kullanan bir siklotron 89 Zr reaksiyonu vasıtasıyla üretilir. ticari olarak temin edilebilen ve% 100 doğal olarak bol miktarda 89 Y, hedef. 14,15 radiometal,% 23 pozitron verim vardır 78.4 saatlik bir yarılanma ömrü ile azalır ve 395,5 keV (Şekil 1) nispeten düşük enerji pozitronlar neşreden. 13,16,17 Bu 89 Zr, aynı zamanda yüksek bir enerji yayar ki dikkat etmek önemlidir, 909 keV γ-ray% 99 verim ile. Bu emisyon yayılan 511 keV fotonlar ile enerjik karışmaz iken, ulaşım, taşıma, ve dozimetrisi ile ilgili ekstra dikkate gerektirir. Bu uyarı rağmen, bu çürüme özellikleri sonuçta 89 Zr daha olumlu bir h sahip değil sadece anlamınaCu 86 Y ve 64 den antikorlar ile görüntüleme için alf-hayat değil, aynı zamanda yüksek 687 ve 975 keV enerjilerin yanı sıra 100-150 keV içinde enerjiler ile fotonların sayısı ile pozitron yayan, hangi 124 Ben daha yüksek çözünürlüklü görüntüler üretebilir 511 keV pozitron oluşturulan fotonlar. 13 Dahası, 89 Zr onun radyoaktif iyot meslektaşı daha etkili de tümörlerde, işlemek için daha güvenli üretmek için daha az pahalı ve residualizes olduğunu. 89 Zr 18,19 potansiyel bir sınırlama yok ki terapötik isotopologue, örneğin, 86 Y (PET) vs 90 Y (tedavi). Bu onların tedavi meslektaşları için dozimetrik izciler olarak istihdam edilebilir kimyasal özdeş, vekil görüntüleme ajanları yapımını engeller. O dedi, araştırmalar 89 Zr-etiketli antikorlar 90 Y- ve 177 Lu-etiketli immünoeşlenikler görüntüleme suretler olarak potansiyeli var olduğunu göstermektedir.20,21 Kimyasal bir bakış, bir grup IV metal, 89 Zr, sulu çözelti içinde bir 4 katyon olarak bulunur. Zr 4+ iyon yüksek, nispeten büyük (etkin iyonlu yarıçapı = 0.84 A) doldurulur ve bir &quot;sert&quot; katyon olarak sınıflandırılabilir. Bu nedenle, bu sekiz sabit anyonik oksijen donör kadar taşıyan ligandlar için bir tercih sergilemektedir. Kolayca 89, Zr-etiketli radioimmunoconjugates en sık kullanılan kenetleme maddesi desferrioksamin olan (DFO), üç hidroksamat grubu taşıyan bir siderofor türetilmiş asiklik şelatör. Ligand stabil biyolojik ilgili pH seviyelerinde oda sıcaklığında hızlı ve temiz Zr 4+ katyon koordinatları ve ortaya çıkan Zr-DFO kompleksi tuz, kan serumunda birden fazla gün boyunca sabit kalır ve tam kan. 22 Hesaplamalı çalışmalar kuvvetle öneririz DFO metal merkez üç neut koordinatlanmış olan Zr 4+ bir hexacoordinate kompleks oluşturmasıRal ve ligand üç anyonik oksijen donör olarak, iki ekzojen su ligandlar (Şekil 2). 23,24 89 Zr-DFO çekimleri iskele istihdam radioimmunoconjugates in vivo davranış genellikle mükemmel olmuştur. Bununla birlikte, bazı durumlarda, görüntüleme ve akut biyolojik dağılım çalışmaları 89, Zr-etiketli antikorlar ile enjekte edilen farelerin kemik yükseltilmiş aktivite düzeylerini Zr 4+ katyon, daha sonra in vivo olarak kenetleme salınır ve 89 osteophilic mineralleşir düşündürmektedir verileri ortaya koymuştur Kemikte. sekiz oksijen donör literatürde adı geçen 25 en son, yeni 89 Zr 4+ kenetleme geliştirilmesine yönelik araştırmalardan bir dizi özel olarak, şu anda Bununla birlikte, 24,26,27. ligandları DFO en yaygın olarak kullanılan şelatördür 89 yılında bir farkla radioimmunoconjugates Zr-etiketli. Farklı bir dizibioconjugation stratejileri bioorthogonal tıklama kimya, antikorda sistein ile inşa tiol-reaktif DFO reaksiyonu ve ester taşıyan DFO antikorda bir lisin ile inşa aktif reaksiyonunu da dahil olmak üzere antikorlar DFO eklemek için kullanılmaktadır. 4,28- 30 kolayca en yaygın strateji, ancak, 22 sağlam Bu ticari olarak temin edilebilen iki fonksiyonlu kenetleyici. DFO, DFO-NCS bir izotiyosiyanat taşıyan bir türevinin kullanılması ile (Şekil 2) olan ve güvenilir bir şekilde bir lisin ile sabit, kovalent tioüre bağlar oluşturan olan antikoru (Şekil 3). Son birkaç yıl içinde, 89, Zr-DFO-işaretli radioimmunoconjugates çok çeşitli literatürde bildirilmiştir. Klinik öncesi araştırmalar gibi CD105-hedefleme T gibi cetuximab, bevacizumab ve trastuzumab daha ezoterik antikorların daha iyi bilinen arasında değişen antikorlar içeren, özellikle bol olmuşturRC105 ve 5A10 sPSA hedefleme. 30-36 Daha yakın zamanlarda, 89, Zr-DFO etiketli antikorlar kullanılarak erken faz klinik çalışmaların az sayıda literatürde ortaya çıkmıştır. 89 Zr-DFO-CMAB U36, 89, Zr-DFO-ibritumomab tiuksetan ve 89 Zr-DFO-trastuzumab. 21,32,37 Ayrıca, 89 ile diğer klinik çalışmaların bir dizi istihdam Özellikle, Hollanda&#39;da gruplar yayınladık çalışmalar Zr-etiketli radioimmunoconjugates prostat kanseri görüntüleme için PSMA hedefleme 89 Zr-DFO-J591 ve meme kanseri görüntüleme için HER2-hedefleme 89 Zr-DFO-trastuzumab ile Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi&#39;nde burada soruşturma da dahil olmak üzere, halen devam etmektedir. 23, Radyo-etiketli antikorlar, en çok 89, Zr-etiketli radyofarmasötik kalır Buna ek olarak, 30, radiometal da artan bir peptit, protein, ve nano malzemelerin de dahil olmak üzere başka vektörler ile kullanılmıştır. 38-43 </sup&gt; Bu 89 Zr-DFO etiketleme metodolojisi modülerlik muazzam bir varlıktır. biyobelirtecin hedefleme antikorların repertuar sürekli genişleyen ve bu yapıları kullanarak in vivo PET görüntülemede performans ilgi hızla büyüyor olmasıdır. Sonuç olarak, biz daha standart uygulamalar ve protokollerin geliştirilmesi alanını yararlanabilir inanıyorum. DFO-NCS konjugasyon ve 89 Zr Radyoaktif için mükemmel bir yazılı deneysel protokol zaten Vosjan tarafından yayımlanmış, vd. 22 Biz bu işin tarafından sağlanan görsel gösteri daha bu tekniklerin yeni müfettişler yardımcı olabilir hissediyorum. Eldeki Protokolde, prostat spesifik membran antijeni hedefleyen antikor J591 göstermek için bir model sistem olarak kullanılır (1) bir antikora DFO-izotiyosiyanat çift işlevli çelatör bioconjugation, 89 (2) radiosynthesis ve arıtma Zr-DFO mAb radioimmunoconjugate,ve (3) &#39;de bir kanser sıçangil modelinde 89, Zr-DFO mAb radioimmunoconjugate in vivo PET görüntülemesi. 23,44,45

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-SCN-Bn-DFO</td><td>Macrocyclics</td><td>B-705</td><td>Store at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;89&lt;/sup&gt;Zr]Zr-oxalate</td><td>Various, including Perkin-Elmer</td><td></td><td>Caution: Radioactive material</td></tr><tr><td>PD-10 Desalting Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01&amp;nbsp;</td><td>Store at room temperature</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC805024</td><td>Store at room temperature</td></tr><tr><td>Silica Gel Impregnated RadioTLC Paper</td><td>Agilent Technologies</td><td>SGI0001</td><td>Cut into strips 0.5 cm wide</td></tr></tbody></table>

the bioconjugation and radiosynthesis of 89zr-dfo-labeled antibodies

antikorların olağanüstü afinite, özgüllük ve seçicilik onlara tümör hedefli PET radyofarmasötikler için olağanüstü cazip vektörleri yapmak. Dolayı çok günlük biyolojik yarı-ömrü, antikorlar nispeten uzun fiziksel bozunma yarı ömürleri ile pozitron yayıcı radyonüklitler ile etiketlenmiş olması gerekir. Geleneksel olarak, pozitron yayan izotoplar 124 I (t 1/2 = 4.18 d), 86 Y, (t 1/2 = 14.7 saat) ve 64 Cu (t 1/2 = 12.7 saat) için antikorlar etiketlemek için kullanılmıştır PET görüntüleme. Daha yakın zamanlarda, ancak, saha antikor bazlı PET görüntüleme ajanları pozitron yayan radiometal 89 Zr kullanımında bir artışa şahit olunmaktadır. Fiziksel bir yarısını sahip gibi 89 Zr, immünoeşlenikler ile PET görüntüleme için neredeyse ideal bir radyoizotop antikorların in vivo farmakokinetikleri ile uyumlu olan ve nispeten düşük bir enerjini yayar Ömrü (t 1/2 = 78.4 saat)yüksek çözünürlüklü görüntüler üretir rgy pozitron. Bundan başka, antikorlar doğrudan, siderofor türetilmiş kenetleme maddesi desferrioksamin (DFO) ile 89 Zr ile etiketlenebilir. Bu protokol, prostat spesifik membran antijeni hedefleyen antikor J591 göstermek için bir model sistem olarak kullanılır (1) bir antikor, (2) radiosynthesis ve 89 Zr- saflaştırılması kadar izotiyosiyanat DFO çift işlevli çelatör bioconjugation Kanser bir murin modelinde 89, Zr-DFO mAb radioimmunoconjugate ile DFO mAb radioimmunoconjugate, ve (3) &#39;de in vivo PET.

Bu protokol antikora DFO-NCS konjugasyon ilk adım genellikle oldukça sağlam ve güvenilir. Genel olarak, saflaştırılmış, kenetleme maddesi ile modifiye edilmiş immüno&gt;% 90 verimle elde edilebilir ve ilk birleşme reaksiyonu içinde bulunan DFO-NCS 3 mol eşdeğeri kullanılarak bir derece-of-etiketleme, yaklaşık 1,0-1,5 arasında kenetleme DFO verecek / mAb. Işlemin 89, Zr, radyo-etiketleme ve saflaştırma aşamaları aynı şekilde basittir. Yukarıdaki protokole belirtilen konsantrasyonlard...

Watch this Scientific Journal Video about The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies at JoVE.com

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

Bioconjugation ve radiosynthesis<sup&gt; 89</sup&gt;, Zr-DFO-etiketli antikorlar

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

the-bioconjugation-and-radiosynthesis-of-89zr-dfo-labeled-antibodies

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Chemistry

Unit 1

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Fundamentals of Chemistry

SCIENTISTS IN ACTION

17.1K Görüntüleme.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described. 

Video: The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 &plusmn; 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (&gt;99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

A detailed procedure for the synthesis of a 125I-labeled azide and the radiolabeling of dibenzocyclooctyne (DBCO)-group-conjugated, 13-nm-sized gold nanoparticles using a copper-free click reaction is described.

Bir Kullanarak Altın Nanopartiküller Verimli Radyoaktif bir Optimize Protokolü<sup&gt; 125</sup&gt; I-etiketli Azid Protez Grubu

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient ...

Kimya

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

Hazırlama ve Değerlendirilmesi<sup&gt; 99m</sup&gt; Bioorthogonal Kimya Kullanarak Öncesi hedeflemek için üç dişli Şelatlar Tc-etiketli

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a 64Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with 64Cu or 89Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a 64Cu-labeled radioligand.

Pretargeted PET Görüntüleme Bioorthogonal Ters Elektron Talep Diels-Alder Katılma Harnessing

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for ...

Biyomühendislik

Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction

While radioimmunotherapy (RIT) is a promising approach for the treatment of cancer, the long pharmacokinetic half-life of radiolabeled antibodies can result in high radiation doses to healthy tissues. Perhaps not surprisingly, several different strategies have been developed to circumvent this troubling limitation. One of the most promising of these approaches is pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). PRIT is predicated on decoupling the radionuclide from the immunoglobulin, injecting them separately, and then allowing them to combine in vivo at the target tissue. This approach harnesses the exceptional tumor-targeting properties of antibodies while skirting their pharmacokinetic drawbacks, thereby lowering radiation doses to non-target tissues and facilitating the use of radionuclides with half-lives that are considered too short for use in traditional radioimmunoconjugates. Over the last five years, our laboratory and others have developed an approach to in vivo pretargeting based on the inverse electron-demand Diels-Alder (IEDDA) reaction between trans-cyclooctene (TCO) and tetrazine (Tz). This strategy has been successfully applied to pretargeted positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) imaging with a variety of antibody-antigen systems. In a pair of recent publications, we have demonstrated the efficacy of IEDDA-based PRIT in murine models of pancreatic ductal adenocarcinoma and colorectal carcinoma. In this protocol, we describe protocols for PRIT using a 177Lu-DOTA-labeled tetrazine radioligand ([177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz) and a TCO-modified variant of the colorectal cancer targeting huA33 antibody (huA33-TCO). More specifically, we will describe the construction of huA33-TCO, the synthesis and radiolabeling of [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz, and the performance of in vivo biodistribution and longitudinal therapy studies in murine models of colorectal carcinoma.

This protocol describes the synthesis and characterization of a trans-cyclooctene (TCO)-modified antibody and a 177Lu-labeled tetrazine (Tz) radioligand for pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). In addition, it details the use of these two constructs for in vivo biodistribution and longitudinal therapy studies in a murine model of colorectal cancer.

Pretargeted Radioimmunotherapy ters elektron talep Diels-Alder reaksiyonu üzerinde dayalı

While radioimmunotherapy (RIT) is a promising approach for the treatment of cancer, the long pharmacokinetic half-life of radiolabeled antibodies can ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

Sentez ve Site seçici olarak oluşturulması için Thiol reaktif reaktif Bioconjugation Immunoconjugates modifiye

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Positron Emission Tomography Imaging of Cell Trafficking: A Method of Cell Radiolabeling

Stem cell and chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies are emerging as promising therapeutics for organ regeneration and as immunotherapy for various cancers. Despite significant progress having been made in these areas, there is still more to be learned to better understand the pharmacokinetics and pharmacodynamics of the administered therapeutic cells in the living system. For noninvasive, in vivo tracking of cells with positron emission tomography (PET), a novel [89Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN)-mediated cell radiolabeling method has been developed utilizing 89Zr (t1/2 78.4 h). The present protocol describes a [89Zr]Zr-DBN-mediated, ready-to-use, radiolabeling synthon for direct radiolabeling of variety of cells, including mesenchymal stem cells, lineage-guided cardiopoietic stem cells, liver regenerating hepatocytes, white blood cells, melanoma cells, and dendritic cells. The developed methodology enables noninvasive PET imaging of cell trafficking for up to 7 days post-administration without affecting the nature or the function of the radiolabeled cells. Additionally, this protocol describes a stepwise method for the radiosynthesis of [89Zr]Zr-DBN, biocompatible formulation of [89Zr]Zr-DBN, preparation of cells for radiolabeling, and finally the radiolabeling of cells with [89Zr]Zr-DBN, including all the intricate details needed for the successful radiolabeling of cells.

Presented here is a protocol to radiolabel cells with a positron emission tomography (PET) radioisotope, 89Zr (t1/2 78.4 h), using a ready-to-use radiolabeling synthon, [89Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN). Radiolabeling cells with [89Zr]Zr-DBN allows noninvasive tracking and imaging of administered radiolabeled cells in the body with PET for up to 7 days post-administration.

Hücre Kaçakçılığının Pozitron Emisyon Tomografisi Görüntülemesi: Bir Hücre Radyo-Etiketleme Yöntemi

Stem cell and chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies are emerging as promising therapeutics for organ regeneration and as immunotherapy for ...

Kanser Araştırmaları

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used in cancer treatment and imaging due to increased cellular accumulation over current ACs. During early AC in vitro development, fluorescence techniques and radioimmunoassays are sufficient for determining intracellular localization, accumulation efficiency, and target cell specificity. Currently, there is no consensus on standardized methods for preparing cells for evaluating AC intracellular accumulation and localization. The initial testing of ACs modified with virus-derived peptides is critical especially if several candidates have been constructed. Determining intracellular accumulation by fluorescence can be affected by background signal from ACs at the cell surface and complicate the interpretation of accumulation. For radioimmunoassays, typically treated cells are fractionated and the radioactivity in different cell compartments measured. However, cell lysis varies from cell to cell and often nuclear and cytoplasmic compartments are not adequately isolated. This can produce misleading data on payload delivery properties. The intravenous injection of radiolabeled virus-derived peptide-modified ACs in tumor bearing mice followed by radionuclide imaging is a powerful method for determining tumor targeting and payload delivery properties at the in vivo phase of development. However, this is a relatively recent advancement and few groups have evaluated virus-derived peptide-modified ACs in this manner. We describe the processing of treated cells to more accurately evaluate virus-derived peptide-modified AC accumulation when using confocal microscopy and radioimmunoassays. Specifically, a method for trypsinizing cells to remove cell surface bound ACs. We also provide a method for improving cellular fractionation. Lastly, this protocol provides an in vivo method using positron emission tomography (PET) for evaluating initial tumor targeting properties in tumor-bearing mice. We use the radioisotope 64Cu (t1/2 = 12.7 h) as an example payload in this protocol.

Viral-derived peptides coupled to antibody-conjugates (ACs) is an approach gaining momentum due to the potential of delivering molecular payloads with increased tumor cell accumulation. Utilizing common methods to evaluate peptide conjugation, AC and payload intracellular accumulation, and tumor targeting, this protocol helps researchers during the key initial development phases.

Antikor conjugates ilk değerlendirilmesi ile Viral kaynaklı peptidler hücresel birikimi artan ve tümör hedefleme artırmak için değiştirilmiş

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte cell culture and 64Cu-antibody receptor targeting of the cells. In vitro evaluation of the radiolabel and non-invasive in vivo cell tracking in an animal model of an airway delayed-type hypersensitivity reaction (DTHR) by PET/CT are described.
In detail, the conjugation of a mAb with the chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) is shown. Following the production of radioactive 64Cu, radiolabeling of the DOTA-conjugated mAb is described. Next, the expansion of chicken ovalbumin (cOVA)-specific CD4+ interferon (IFN)-&#947;-producing T helper cells (cOVA-TH1) and the subsequent radiolabeling of the cOVA-TH1 cells are depicted. Various in vitro techniques are presented to evaluate the effects of 64Cu-radiolabeling on the cells, such as the determination of cell viability by trypan blue exclusion, the staining for apoptosis with Annexin V for flow cytometry, and the assessment of functionality by IFN-&#947; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the determination of the radioactive uptake into the cells and the labeling stability are described in detail. This protocol further describes how to perform cell tracking studies in an animal model for an airway DTHR and, therefore, the induction of cOVA-induced acute airway DHTR in BALB/c mice is included. Finally, a robust PET/CT workflow including image acquisition, reconstruction, and analysis is presented.
The 64Cu-antibody receptor targeting approach with subsequent receptor internalization provides high specificity and stability, reduced cellular toxicity, and low efflux rates compared to common PET-tracers for cell labeling, e.g.64Cu-pyruvaldehyde bis(N4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Finally, our approach enables non-invasive in vivo cell tracking by PET/CT with an optimal signal-to-background ratio for 48 h. This experimental approach can be transferred to different animal models and cell types with membrane-bound receptors that are internalized.

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Following the preparation of a 64Cu-modified monoclonal antibody binding to a transgenic murine T cell receptor, T cells are radiolabeled in vivo, analyzed for viability, functionality, labeling stability and apoptosis, and adoptively transferred into mice with an airway delayed-type hypersensitivity reaction for non-invasive imaging by positron emission tomography/computed tomography (PET/CT).

tarafından Kemirgen Lenfosit Etiketleme<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antikor Reseptör için hedefleme<em&gt; In Vivo</em&gt; PET / CT ile hücre Trafik

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Determining Binding Affinity (KD) of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens

Determining binding affinity (KD) is an important aspect of the characterization of radiolabeled antibodies (rAb). Typically, binding affinity is represented by the equilibrium dissociation constant, KD, and can be calculated as the concentration of antibody at which half the antibody binding sites are occupied at equilibrium. This method can be generalized to any radiolabeled antibody or other protein and peptide scaffolds. In contrast to cell-based methods, the choice of immobilized antigens is particularly useful for validating binding affinities after long-term storage of antibodies, distinguishing binding affinities of fragment antigen-binding region (Fab) arms in bispecific antibody constructs, and determining if there is variability in antigen expression between different cell lines. This method involves immobilizing a fixed amount of antigen to specified wells on a breakable 96-well plate. Then, nonspecific binding was blocked in all wells with bovine serum albumin (BSA). Subsequently, the rAb was added in a concentration gradient to all wells. A range of concentrations was chosen to allow the rAb to reach saturation, i.e., a concentration of antibody at which all antigens are continuously bound by the rAb. In designated wells without immobilized antigen, nonspecific binding of the rAb can be determined. By subtracting nonspecific binding from total binding in the wells with immobilized antigen, specific binding of the rAb to the antigen can be determined. The KD of the rAb was calculated from the resulting saturation binding curve. As an example, binding affinity was determined using radiolabeled amivantamab, a bispecific antibody for epidermal growth factor receptor (EGFR) and cytoplasmic mesenchymal-epithelial transition (cMET) proteins.

Determining Binding Affinity KD of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens

Here, a method is described to determine the binding affinity (KD) of radiolabeled antibodies to immobilized antigens. KD is the equilibrium dissociation constant that can be determined from a saturation binding experiment by measuring the total, specific, and nonspecific binding of a radiolabeled antibody at various concentrations to its antigen.

Radyoaktif Etiketli Antikorların İmmobilize Antijenlere Bağlanma Afinitesinin (KD) Belirlenmesi

Determining binding affinity (KD) is an important aspect of the characterization of radiolabeled antibodies (rAb). Typically, binding affinity is ...

Tıp

Pretargeted Radioimmunotherapy: A Method for Targeted Delivery of Therapeutic Radionuclides to Tumors

Source: Membreno, R., et al. <a href="https://www.jove.com/v/59041"> Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the technique of pretargeted radioimmunotherapy or PRIT, in which immunoconjugates followed by radioligands are administered for treating tumors. This radioimmunotherapy reduces radiation doses to healthy tissues and utilizes radionuclides with very low half-lives incompatible with antibody-based vectors.

Önceden Hedeflenmiş Radyoimmünoterapi: Terapötik Radyonüklidlerin Tümörlere Hedefe Yönelik Verilmesi İçin Bir Yöntem

Source: Membreno, R., et al.  Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction. J. Vis. Exp. (2019).
This video ...

Bioconjugation ve radiosynthesis

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bir Kullanarak Altın Nanopartiküller Verimli Radyoaktif bir Optimize Protokolü

Hazırlama ve Değerlendirilmesi