Bu eser (no. 0312040 hibe) Max Planck Kurumu, Alman Kanser Araştırma Merkezi, Tübingen Üniversitesi ve Bundesministerium für Bildung und Forschung tarafından desteklenmiştir. Biz bize bu yazının dikkatli okumak için kuvvet eğrisi verileri ve Dr. Jakob Suckale analizi otomatik yardım için Eduard Hermann teşekkür ederiz.

Desteklenen Lipid Bilayers 1. Hazırlama (SLB) 11,12,21 <ol><li> Lipid Karışım ve çok katmanlı veziküllü Cezalı Hazırlanması <ol><li> Önceden aşağıdaki tamponlar hazırlayın. <ol><li> 2.7 mM KCI, konsantrasyonlarda, PBS tampon hazırlanması 1.5 mM KH 2 PO 4, 8 mM Na 2 HPO 4 ve 137 mM NaCl, pH 7.2. </li><li> 150 mM NaCI, 10 mM HEPES, pH 7.4 konsantrasyonlarda SLB (desteklenen lipid iki katmanlı) tamponunu hazırlayın. </li><li> 1 M CaCI2 ihtiva eden bir çözelti hazırlayın. </li></ol></li><li> İstenen bir konsantrasyonda kloroform içinde, aşağıdaki lipitleri çözülür: örneğin, di-oleoil-fosfatidilkolin, 10 mg / ml&#39;de 25 mg / ml ve kolesterol (Chol) 25 mg / ml, sfingomiyelin (SM) &#39;den (DOPC). </li><li> 2: 1: DOPC: SM: Kol mol oranında, bir 2 toplam lipidlerin 1 mg bir çözeltinin yapılması için DOPC 18.38 ul, SM 17.10 ul ve Chol 11.30 ul alır. Conce göre buna uygun hacimleri Vary1.1.2 hazırlanan lipitlerin ntrations. 2: 1: DOPC: SM: kol, zar 25 faz özelliklerini değiştirecek mol oranı değiştirilerek Ancak, 2 molar oranını korumak. </li><li> Vorteks tamamen çözüm karıştırın. Biri floresan mikroskop ile bilayeri görselleştirmek isterse 0.05 mol% bir floresan lipidik boya ekleyin. Not: Uzun zincirli dialkylcarbocyanines ailesini, yaptığımız gibi, DII ve Dio dalga boylarında geniş bir yelpazede hizmet ve ideal lipid membranlar etiketlemek için kullanılabilir. Seçenek olarak ise, rodamin-fosfatidiletanolamin ya da BODIPY-kolesterol gibi flüoresan etiketli lipidler kullanılabilir. Her durumda, boyanın konsantrasyonu lipid bağlı fluorofor yüksek konsantrasyonlarda lipid davranışı 19 değiştirebilirsiniz akılda tutarak, mikroskopi ayarına göre optimize edilmelidir. </li><li> N 2 gazı kullanılarak kloroform (veya herhangi bir kullanılabilir inert gaz gibi Ar gibi He) kapalı kurulayın. </li><li> Bundan başka, kuru tEn azından 1 saat için vakum altında bir karışım, kolesterol. Not: bu lipit karışımı depolamak için, soy gaz ile (N2, Ar veya He) hava üfleme ve -20 ° C&#39;de saklayın. Küçük kahverengi şişelere fazla lipidler-in-kloroform kısım. -20 ° C&#39;de soy gaz ile (N2, Ar veya He) ve mağaza hava yerini, lipit karışımı gibi benzer bir şekilde, kurutun. </li><li> 10 mg / ml&#39;lik bir konsantrasyona PBS tamponu içinde kurutuldu lipidleri çözülür. </li><li> 1 dakika vorteksleyin, yaklaşık 20 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde kanşım çok katmanlı veziküller içeren, bulanık bir süspansiyon elde etmek için. Flakon kenarlarına yapışmasını hiçbir lipit film olmadığından emin olun. </li><li> 10 ul alikotları (lipid 1 mg 10 bölüntülerin yapar) içine bu süspansiyon dağıtın. </li><li> Sonraki kullanıma kadar -20 ° C&#39;de muhafaza edin. </li></ol></li><li> Tek lamelli vesiküller hazırlanması Not: tek lamelli vesiküller çeşitli boyutlarda sonikasyon yöntemi ya da kalıptan çekme yöntemi ile hazırlanabilir. Sonikasyon s kullanıround enerji karışımı ajitasyon ve çok katmanlı süspansiyon katmanları ayırmak için. Bu puslu süspansiyon kadar takas ile gösterilir. Ekstrüzyon kesin bir gözenek büyüklüğüne sahip bir membran filtreden geçmesine çok katmanlı veziküller zorlar. <ol><li> Sonikasyon Yöntemi <ol><li> Çok katmanlı lipit süspansiyonlar 10 ul alın ve SLB tampon 150 ul ekleyin. </li><li> Küçük (2 mi) kapaklı cam şişelere karışımı aktarın ve Parafilm ile sızdırmaz. </li><li> 10 dakika süre ile ya da (çapı 50 nm altında, SUV), küçük tek tabakalı veziküller elde etmek için açık hale gelinceye kadar bir banyo sonikatörü içinde, oda sıcaklığında, karışım sonikasyon. </li></ol></li><li> Ekstrüzyon Yöntemi <ol><li> Çok katmanlı lipit süspansiyonlar 10 ul alın ve SLB tampon 150 ul ekleyin. </li><li> Kriyojenik bir tüp içine süspansiyon aktarın. </li><li> Sıvı azot içinde bir kaç saniye için kriyojenik tüp daldırılması lipid süspansiyonu dondurun. </li><li> Çözülmebir kaç dakika için bir su banyosu oda sıcaklığında veya 37 ° C kriyojenik tüp daldırarak Lipid süspansiyonu. Donma-çözülme adımları en az 10 kere tekrarlanır. </li><li> Lipid süspansiyonu ekstrüde etmek amacıyla, 200 nm gözenek boyutuna sahip olan bir polikarbonat membran kullanımı ticari bir ekstrüzyon tertibatı 26 (diğer gözenek boyutları 100 nm ya da 400 nm gibi mevcuttur). Not: Şu anda, iki ekstruder cihazları piyasada mevcut vardır: manuel ekstrüzyon küçük hacimleri (bir kaç ml 200 ul) için mevcuttur. Bu durumda, Örnek elle iki şırınga arasında ileri ve geri süspansiyon iterek zardan basınç altında geçirilir. Üreticisine bağlı olarak, lipid tümbölenler set up asgari hacme ulaşmak için kombine edilmesi gerekir. Daha büyük hacimler için (en fazla 50 mi) daha karmaşık cihazlar kullanıldığı süspansiyon sıkıştırılmış gaz kullanarak polikarbonat zardan itilir. Set-up ve ekstrüzyon koşulları mod göre değişebilirEl. Kullanmadan önce üreticinin talimatlarına bakın. Bu protokol, küçük miktarlar için manuel ekstruder anlamına gelir. </li><li> Ekstruder üzerinden su geçirilerek su içinde ekstrüderi dengelenmesi. Suda membran daldırın. </li><li> Iki piston arasında zarın cihazı monte ve bir şırınga diğerine, ekstrüzyon yoluyla tampon geçirilerek, tampon maddesi içinde dengeye. Bu adım ayrıca sistemin leakiness test sağlar. Bu sızıntı varsa, sökmeye ve tekrar zar değişiyor yenilemek. </li><li> Ekstruder bir şırıngayı (&#39;kirli yüzü&#39;) ile lipid süspansiyon atın. </li><li> Tek odasının lipit süspansiyon ve karşıt odasının boş şırınga içeren şırınga takın. </li><li> Bir ucunda şırınga itin. Zarından ve rakip şırınga içine çözüm geçirin. Bu 1. pass. </li><li> 31 kat gibi bir toplam zar geçirinÇözelti rakip şırınga (&#39;temiz tarafı&#39;) üzerine biter. Not: ekstrüzyon sonra membran kontrol ediniz. Kırık, sonra ekstrüzyon işlemi başarılı değildi ve tekrar edilmesi gerekir. </li><li> Küçük bir tüp içine şırınga boşaltın. 4 ° C &#39;de muhafaza edilmesi durumunda Büyük tek tabakalı veziküller (LUVler) 1-2 gün boyunca stabildir. </li></ol></li></ol></li><li> Mika ve lameller hazırlanması <ol><li> Yıkama etanol önce su ve daha sonra lamelleri. Kuru hava. </li><li> Mika diskleri alın ve yapışkan bant kullanılarak dış katman soyulabilir. </li><li> Lamel üzerine mika diski takın. Biri floresan mikroskop ile bilayers kontrol edebilirsiniz böylece Şeffaf optik yapıştırıcılar optimum bulunmaktadır. </li><li> Optik tutkal / gres kullanarak plastik silindirler (2.5 cm dış çapı 2 cm iç çapı ve 0,5 cm yükseklik) takın. Her şey sızdırmaz olduğundan ve sızıntı olmadığından emin olun. Kolayca inci ayrılabilir olarak silindirlerin yeniden kullanmak isteyen yaparken gres kullanınE lamel ve yıkanmıştır. Plastik silindir boyutları AFM konsol tutucu büyüklüğüne bağlıdır ve buna uygun olarak ayarlanmalıdır. </li></ol></li><li> Katı Destek tek katmanlı veziküller birikmesi <ol><li> Pipetleyin mika doğrudan bütün lipozom çözüm. 300 ul bir hacim ulaşmak için daha fazla SLB tamponu ekleyin. </li><li> 3 mM Ca2 + nihai konsantrasyona ulaşmak için, 1 M kalsiyum klorür çözeltisinin 0.9 ul ekleyin. </li><li> 2 dakika ve daha sonra en az 10 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta, 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Her tampon ile iki katmanlı kapsamaktadır. Hava ve hava kabarcıkları ile irtibat onu yok edecek. Gerekirse İnkübasyon sırasında, yüksek sıcaklıklarda kuluçka, özellikle daha fazla tampon eklemek. Not: İnkübasyon ısılarının, ihtiyaç duyulan lipid karışımları ve fazlar göre değişir. En az 10 dakika kuluçkalama süresi desteklenen iki katmanlı yapılar oluşturmak için gerekli olan, ancak sıcaklık ve bileşimine bağlı olarak, daha uzun olabilir. </li><li> YıkamaSıcak (65 ° C) ile iki tabakalı SLB tamponu 15-20 kat kalsiyum ve kaynaşmamış kesecikler kaldırmak için. Tamponu altında bilayeri tutmak için yıkama adımları sırasında ekstra özen ve yavaşça bilayeri yok önlemek için yıkama solüsyonu pipetlemeyin. </li><li> AFM ölçümlerinden önce oda sıcaklığında soğutun desteklenen bilayers. Bu membran, farklı fazlar oluşturabildiğini gibi alet termal kaymasını en aza indirmek için gereklidir. </li></ol></li></ol> 2. Atomik Kuvvet Mikroskobu Ölçümleri 11,12 <ol><li> Görüntüleme Not: İletişim modu veya mod dokunarak atomik kuvvet mikroskopisi görüntüleme gerçekleştirin. Çözelti içinde Resim desteklenen bilayers; Bu bilayers yok gibi çözüm tamamen buharlaşması için izin vermez. Tek tampon ile çalışıyor olacak gibi, herhangi AFM kısmı sıvı dökülmelerine karşı korumalı olduğunu emin güvenlik önlemlerini dikkate alınız. <ol><li> Yumuşak bir konsol seçin (0.2 N / m yay sabiti tavsiye edilir altında) ve t monteO AFM. Konsol sertlik seçimi kuvvet spektroskopisi için daha önemlidir (ve bu daha sonra ele alınacaktır). </li><li> AFM sahnede örnek takın ve tüm titreşim izolasyonu modülleri açık olduğundan emin olun. Dengeye ve sistemin termal sürüklenme azaltmak için en az 15 dakika boyunca bekleyin. AFM set-up bağlı olarak, ayarlama ve görüntüleme özellikleri değişebilir. Üreticinin kullanma kılavuzuna bakınız. </li><li> Temas edene kadar AFM ucu ile örnek yaklaşın. </li><li> Lipid bilayers genellikle yüksekliği 4 nm olduğundan, (örneğin 1.5 mikron için) en yüksek z-çözünürlüğü verecek cihazın Z-dizi kullanın. </li><li> Görüntünün bir bölge seçin. Çift katlı lipid genel bir bakış, x 25 mikron bölge imajı için iyi bir başlangıç ​​noktası olacaktır 50 mm x 50 mm veya 25 mikron almak için. Daha küçük özellikler belirirse, küçük alanlarda bir kutu görüntüsü (10 mm x 10 mm veya 2 mm x 2 mm). görüntüleme alanının seçimi de çalışma r bağlıdırPiezoelektrik tarayıcı ange. Bunun için alet kılavuzuna bakınız. </li><li> Bilayers çok kırılgan olduğu için, numune ile temas korurken, termal sürüklenme için en az kuvvet ve doğru tutmak için görüntüleme sırasında AFM ucu ayar noktasını ayarlayın. Iletişim modunda, ayar noktasını en aza indirmek. Modunda dokunarak, set noktasını maksimize. </li><li> Polinom tesviye işlevlerine her tarama satırı takarak Süreç görüntüler. AFM üretim şirketi özel yazılım kullanılarak membran ile temas kaybetmek taramalar için hat kaldırma gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Kuvvet Spektroskopisi <ol><li> Üreticinin protokolüne göre yönergeleri izleyerek konsol ayarlayın. Kalibrasyon fotodiyotlar kuvvete (Şekil 1B) elektrik sinyalinin dönüşüm sağlar. <ol><li> Volt uç duyarlılığını (uzunluk birimi olarak) z-piezo hareketi olarak sapma ölçmek yerine, elektrik sinyalini kalibre edin. <br /&gt; Not: AFM bir lazer kullanarak konsol sapmasına değişiklikler konsolun arkasında yansıyan algılar. Lazer mekansal lazer nokta pozisyonunu tespit edebilen bir fotodiyot ulaşır. Bu numune ile temas üzerine eğilir olarak konsol sapmasına bir değişiklik &quot;dikey sapma&quot; olarak foto diyot tarafından tespit edilir ve bu gerilimin birimleri cinsindendir. Konsol z piezo ile taşınır için, düşey sapma, z-piezo hareket ile ilgilidir. Dikey sapma ve z hareketi arasındaki oran hassasiyeti denilen ve mesafe gerilim dönüştürür. </li><li> Genellikle AFM yazılımı dahil termal gürültü frekans yöntemi kullanılarak konsol bahar sabitini hesaplayınız. Bu yöntemde, güç spektrumu yoğunluk arsa oluşturma, salınım frekansına göre gürültü titreşimin genliğini çizilir. Bu arsa rezonans frekansı etrafında bir tepe gösterecektir. Frekans nerede genlik iEn büyük s rezonans frekansı olduğunu. Yazılım tarafından otomatik olarak yay sabitini hesaplamak için tepe etrafında Lorentz işlevi takın. Isıl gürültü yönteminin teorisi için bazı yararlı kaynaklar referanslar 27-30 verilmiştir. </li></ol></li><li> Çift katlı bir alanı görüntüleme sonra kuvvet spektroskopisi gerçekleştirmek için iki katmanlı bir 5 mm x 5 mm bölgeyi seçin. </li><li> O bölgenin 16 x 16 grid kuvvet eğrileri alır, böylece AFM ayarlayın. Bu bölgenin başına 256 kuvvet eğrileri ile sonuçlanır. iki komşu nokta arasındaki boşluk membran alanı sonraki noktaya denk olur bir noktada tarafından tanınacak olan önlemek için yeterli olmalıdır. Bu uç yarıçapına bağlıdır. İki nokta arasında bir 100 mil mesafesi ideal olacaktır. 16 x 16 ızgara içine 5 mm x 5 mm bölgesini bölün. Faz büyüklüğüne bağlı olarak, bir küçük veya daha büyük bölgeyi seçmek ve daha sonra buna göre ızgara boyutunu ayarlayabilirsiniz. </li><li> Ayarlayın z-piezo deplasman400 nm. Bu z-piezo maksimum hareket aralığını belirler. Bu konsol tamamen ölçümler arasında numune uzak geri emin olmak için yeterince büyük olmalıdır. </li><li> 800 nm / sn yaklaşım hızını ayarlamak ve 200 nm / sn hıza geri çekin. Iki tabakalı yapısı ve lipit fazı 6.16 incelenecek bağlı 6.000 nm / sn 400 arasında bir yaklaşım hızı kullanın. </li><li> Tüm parametreleri ayarladıktan sonra, AFM yazılımı &quot;run&quot; düğmesine basarak, kuvvet eğrileri kazanır. </li><li> Yükseklik eğrileri vs kuvvet olarak kuvvet eğrileri (z-piezo hareketinin bir ölçüsü) kaydedin. Bu husus örnek ile temas dikkate konsol bükülmesini almaz. Veri işleme adımı sırasında, AFM yazılım iki tabakalı kalınlığı için uygun değerler verecek uç-numune ayırma eğrileri (Şekil 1C), vs kuvveti elde etmek için eğilme konsol için düzeltme sağlar. Düzeltme değerleri, genellikle calibr içinde bu buluşa katılmıştırHer kuvvet eğrisi ile kaydedilir tirme. Belirli bir noktada piezo hareketinden, dikey saptırma çıkarılarak uç-numune ayırma hesaplayın. Not: yaklaşım kuvvet eğrisinde tepe (kuvvet değeri aşağı konsol hareketi yaklaşım döngüsü hala olsa bile gider) membran atılım gücüdür iken bu zirve pozisyon ve nokta konum arasındaki fark kuvvet yükselmeye başladığı tekrar zarın kalınlığı sağlar. </li><li> Iyi istatistikler elde etmek için her durum için en az 500 kuvvet eğrileri edinin. Menşe veya MatLab gibi programları kullanarak değerleri bir histogram çiziniz ve dağıtım zirve ve genişliğini almak için Gauss dağılımına histogramlar uygun. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscope.">Atomic Force Microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).</li><li>Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Tunneling+Microscopy+and+Atomic+Force+Microscopy:+Application+to+Biology+and+Technology.">Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology.</a> Science. 242, 209-216 (1988).</li><li>Gaczynska, M., Osmulski, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+of+biological+complexes:+What+can+we+learn.">AFM of biological complexes: What can we learn.</a> Curr, Opin. Colloid In. 13, 351-367 (2008).</li><li>Goksu, E. I., Vanegas, J. M., Blanchette, C. D., Lin, W. -. C., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+for+structure+and+dynamics+of+biomembranes.">AFM for structure and dynamics of biomembranes.</a> BBA-Biomembranes. 1788, 254-266 (2009).</li><li>Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM:+A+Nanotool+in+Membrane+Biology.">AFM: A Nanotool in Membrane Biology.</a> Biochemistry-US. 47, 7986-7998 (2008).</li><li>Redondo-Morata, L., Giannotti, M. I., Sanz, F., Bar&#243;, A. M., Reifenberger, R. G., Sanz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Atomic Force Microscopy in Liquid: Biological Applications. , (2012).</li><li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+supported+lipid+bilayers:+From+biophysical+studies+to+sensor+design.">Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design.</a> Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).</li><li>Frederix, P. L. T. M., Bosshart, P. D., Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+of+Biological+Membranes.">Atomic Force Microscopy of Biological Membranes.</a> Biophys. J. 96, 329-338 (2009).</li><li>Mennicke, U., Salditt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Solid-Supported+Lipid+Bilayers+by+Spin-Coating.">Preparation of Solid-Supported Lipid Bilayers by Spin-Coating.</a> Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).</li><li>Raviakine, I., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Supported+Phospholipid+Bilayers+from+Unilamellar+Vesicles+Investigated+by+Atomic+Force+Microscopy.">Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy.</a> Langmuir. 16, 1806-1815 (2000).</li><li>Chiantia, S., Ries, J., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+AFM+and+Two-Focus+SFCS+Study+of+Raft-Exhibiting+Model+Membranes.+.">Combined AFM and Two-Focus SFCS Study of Raft-Exhibiting Model Membranes. .</a> ChemPhysChem. 7, 2409-2418 (2006).</li><li>Unsay, J., Cosentino, K., Subburaj, Y., Garcia-Saez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+effects+on+membrane+structure+and+dynamics.">Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics.</a> Langmuir. 29, 15878-15887 (2013).</li><li>Dom&#232;nech, &. #. 2. 1. 0. ;., Sanz, F., Montero, M. T., Hern&#225;ndez-Borrell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+and+structural+study+of+the+main+phospholipid+components+comprising+the+mitochondrial+inner+membrane.">Thermodynamic and structural study of the main phospholipid components comprising the mitochondrial inner membrane.</a> BBA-Biomembranes. 1758, 213-221 (2006).</li><li>Dom&#232;nech, &. #. 2. 1. 0. ;., Morros, A., Caba&#241;as, M. E., Teresa Montero, M., Hern&#225;ndez-Borrell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+from+hexagonal+phases.">Supported planar bilayers from hexagonal phases.</a> BBA-Biomembranes. 1768, 100-106 (2007).</li><li>Garcia-Saez, A. J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+line+tension+on+the+lateral+organization+of+lipid+membranes.">Effect of line tension on the lateral organization of lipid membranes.</a> J Biol Chem. 282, 33537-33544 (2007).</li><li>Alessandrini, A., Seeger, H. M., Caramaschi, T., Facci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Force+Spectroscopy+on+Supported+Lipid+Bilayers:+Effect+of+Temperature+and+Sample+Preparation.">Dynamic Force Spectroscopy on Supported Lipid Bilayers: Effect of Temperature and Sample Preparation.</a> Biophys. J. 103, 38-47 (2012).</li><li>Butt, H. -. J., Franz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rupture+of+molecular+thin+films+observed+in+atomic+force+microscopy+I.+Theory.">Rupture of molecular thin films observed in atomic force microscopy I. Theory.</a> Physical Review E. 66, 031601 (2002).</li><li>Garcia-Manyes, S., Oncins, G., Sanz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Temperature+on+the+Nanomechanics+of+Lipid+Bilayers+Studied+by+Force+Spectroscopy.">Effect of Temperature on the Nanomechanics of Lipid Bilayers Studied by Force Spectroscopy.</a> Biophys. J. 89, 4261-4274 (2005).</li><li>Chiantia, S., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raft+domain+reorganization+driven+by+short-+and+long-chain+ceramide:+a+combined+AFM+and+FCS+study.">Raft domain reorganization driven by short- and long-chain ceramide: a combined AFM and FCS study.</a> Langmuir. 23, 7659-7665 (2007).</li><li>Canale, C., Jacono, M., Diaspro, A., Dante, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+spectroscopy+as+a+tool+to+investigate+the+properties+of+supported+lipid+membranes.">Force spectroscopy as a tool to investigate the properties of supported lipid membranes.</a> Microsc. Res. Techniq. 73, 965-972 (2010).</li><li>Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J., Chiantia, S., Salgado, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pore+Formation+by+a+Bax-Derived+Peptide:+Effect+on+the+Line+Tension+of+the+Membrane+Probed+by+AFM.">Pore Formation by a Bax-Derived Peptide: Effect on the Line Tension of the Membrane Probed by AFM.</a> Biophys. J. 93, 103-112 (2007).</li><li>Moreno Flores, S., Toca-Herrera, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+future+of+scanning+probe+microscopy:+Combining+atomic+force+microscopy+with+other+surface-sensitive+techniques,+optical+microscopy+and+fluorescence+techniques.">The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques.</a> Nanoscale. 1, 40-49 (2009).</li><li>Simons, K., Vaz, W. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+Systems,+Lipid+Rafts,+and+Cell+Membranes1.">Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1.</a> Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).</li><li>Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rafts+defined:+a+report+on+the+Keystone+symposium+on+lipid+rafts+and+cell+function.">Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function.</a> The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).</li><li>Kahya, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Lipid+Mobility+of+Raft-exhibiting+Model+Membranes+by+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy.">Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).</li><li>Akbarzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome:+classification,+preparation+and+applications.">Liposome: classification, preparation and applications.</a> Nanoscale Research Letters. 8, 102 (2013).</li><li>Butt, H. -. J., Jaschke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+thermal+noise+in+atomic+force+microscopy.">Calculation of thermal noise in atomic force microscopy.</a> Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).</li><li>Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+validation+of+theoretical+models+for+the+frequency+response+of+atomic+force+microscope+cantilever+beams+immersed+in+fluids.">Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids.</a> Journal of Applied Physics. 87, 3973 (2000).</li><li>Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+response+of+cantilever+beams+immersed+in+viscous+fluids+with+applications+to+the+atomic+force+microscope.">Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 84, 64 (1998).</li><li>Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+scaling+law+for+stiffness+measurement+of+small+bodies+with+applications+to+the+atomic+force+microscope.">General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 97, 12490310 (2005).</li><li>Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognizing+and+avoiding+artifacts+in+atomic+force+microscopy+imaging.">Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging.</a> Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).</li><li>Lee, M. -. T., Chen, F. -. Y., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+Pore+Formation+Induced+by+Membrane+Active+Peptides.">Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides.</a> Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).</li><li>Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+membrane+elasticity+by+micro-pipette+aspiration.">Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration.</a> The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).</li><li>Nichols-Smith, S., Teh, S. -. Y., Kuhl, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+and+mechanical+properties+of+model+mitochondrial+membranes.">Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes.</a> BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).</li><li>Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Line+Tension+at+Fluid+Membrane+Domain+Boundaries+Measured+by+Micropipette+Aspiration.">Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration.</a> Phys. Rev. Lett. 98, (2007).</li><li>Rigaud, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins:+functional+and+structural+studies+using+reconstituted+proteoliposomes+and+2-D+crystals.">Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

DOPC oluşan SLBs: SM: Kol (2: 2: 1), kalsiyum klorür ile indüklenen vezikül adsorpsiyon ve yırtılması sonrasında mika oluşmuştur. Bu lipit kompozisyonu L D ve L değeri O fazlar ayrıldı. Ğ fazı sfingomyelin ve kolesterol açısından zengin ve L, D aşaması 11&#39;den daha az sıvı / daha viskoz (Şekil 1A) olarak bulunmuştur. L d aşamasından L o ayrılması çevreleyen (Şekil 1B, C) ​​y...

Atomik Kuvvet mikroskopisi (AFM), çok keskin ucu 1 ile konsol kullanılarak numunenin bir alanı boyunca tarama bir yüzeyin bir görüntü oluşturur. konsol hareketi numunesinin yüzey topolojisini araştırıyor. Sıvı 2-5 hava ya da doğala yakın halde sabit örnekleri analiz çok yönlülüğünü nedeniyle, protein, DNA, ve membran da dahil olmak üzere - AFM yaygın biyolojik moleküllerin uygulanmıştır. Apart nanometre aralığında, yüksek çözünürlüklü görüntüleme yeteneği gelen, AFM konsol etkileşim kuvvetlerini (yapışma ve itme) ve örnek 5,6 mekanik özelliklerini araştırmak üzere bir yay gibi davranır. Bu kuvvet spektroskopisi diye bilinmektedir. Bu modda, prob birinci numune (Şekil 1A) ile temasını kaybeder kadar daha sonra geri çekilir, örnek yaklaşır ve bunun üzerine bir kuvvet uygular. oluşturulan eğriler uygulama hem de konsol mesafenin bir fonksiyonu olarak kuvvet gösterirhamamböceği ve geri çekilme. Elastikiyet modülüne dahil olmak üzere birçok özellikler, bir malzemenin sertliğini ölçmek için, ve yapışma güçleri elde edilebilir. Desteklenen ikili lipid tabakalarıdır bir katı destek üstünde yatan biyolojik model membranlar - genellikle mika, borosilikat cam, erimiş silis veya silikon 7 oksitlenmiş. Bunlar vesikül birikimi gibi çeşitli teknikler kullanılarak hazırlanmaktadır, Langmuir-Blodgett yöntemi ve 8,9 spin kaplama. AFM görüntüleme bu desteklenen ikili tabakalar 10 oluşumunu takip ve farklı bileşimler 11-15 membranları tarafından oluşturulan farklı yapıları incelemek için kullanılmıştır. Yaklaşım eğrisi de bir zirve desteklenen bilayers sonuçlarına kuvvet spektroskopisi gerçekleştirme. Bu zirve bilayeri delmek için gerekli kuvveti gösterir ve atılım kuvvet denir. iki tabakalı kalınlığı da kuvvet eğrisi 6 kullanılarak ölçülebilir. bilayers tipik atılım gücü1-50 arasındaki aralık NN 6. Bu özellikler, lipit ambalaj (sıvı veya jel fazı) ve yapının (asil zincir uzunlukları ve doymamışlık derecesi) ve zar-aktif maddeler 16 tarafından değiştirilmiş bağlıdır. rüptür arkasındaki teori 17 açıklanmıştır ve bu konsol yumuşaklık, uç yarıçapı ve yaklaşım hızı gibi diğer deneysel parametreler de atılım gücü 15,16,18 etkiler. Kuvvet spektroskopisi zar 21 stabilitesi, farklı lipit fazları 11,19, peptidler gibi bir bileşim bağımlı değişiklikler 12,20, hem de diğer biyomoleküllerin etkileri özelliklerini analiz etmek için kullanılmıştır. Desteklenen iki katmanlı yassı yönelimi daha iyi bir yapı ve membran özelliklerini karakterize etmek için bu yüzey plazmon rezonans 22 ve floresan mikroskobu 11,19 gibi diğer yöntemler ile AFM birleştirilmesi için avantajlıdır. Bu ayrıntılı video protocol vezikül birikimi kullanarak desteklenen lipit katmanlarını hazırlamak ve AFM ve kuvvet spektroskopisi ile bunları analiz etmek amaçlanmaktadır. Çeşitli büyüklüklerde veziküller iki katmanlı yapılar hazırlamak için kullanılabilir olsa da, bu protokol, küçük ve büyük tek lamelli vesiküller odaklanmaktadır. Faz sıvı emretti (ğ) ve sıvı düzensiz (L d) aşamalarında ayırmak Desteklenen bilayers 11,15 karakterize edildi. 2: 1 oranında membran 2 di-oleoil-fosfatidilkolin (DOPC), sfingomiyelin (SM) ve kolesterol (kol) oluşmaktadır. Bu kompozisyon modelleri, protein kaçakçılığı ve sıralama, hücre sinyalizasyon ve diğer hücresel süreçleri 23,24 önemli platformlar olarak davranmaya önerilmiştir lipid sallar.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850375P</td><td>Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Visit &lt;a href=&quot;http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp;amp;view=article&amp;amp;id=1679&amp;amp;Itemid=398&quot;&gt;here&lt;/a&gt; for more information on storage and handling.</td></tr><tr><td>Sphingomyelin (Brain, Porcine)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>860062P</td><td>Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Visit &lt;a href=&quot;http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp;amp;view=article&amp;amp;id=1679&amp;amp;Itemid=398&quot;&gt;here&lt;/a&gt; for more information on storage and handling.</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>700000P</td><td>Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Visit &lt;a href=&quot;http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp;amp;view=article&amp;amp;id=1679&amp;amp;Itemid=398&quot;&gt;here&lt;/a&gt; for more information on storage and handling.</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl), 99.8%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl), 88%</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogenphosphate (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;), &gt;99%</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogenphosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;), 99%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;), molecular biology grade</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4689</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, molecular biology grade</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip, 24&amp;nbsp;x&amp;nbsp;60&amp;nbsp;mm, 1&amp;nbsp;mm thickness</td><td>Duran Group</td><td>2355036</td><td></td></tr><tr><td>Punch and Die Set</td><td>Precision Brand Products, Inc</td><td>40105</td><td></td></tr><tr><td>Optical Adhesive</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA 88</td><td>Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Mica blocks</td><td>NSC Mica Exports Ltd.</td><td></td><td>These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.&amp;nbsp; Always handle mica with gloves or tweezers.</td></tr><tr><td>Laboratory Equipment Grease</td><td>Borer Chemie AG</td><td>Glisseal N</td><td></td></tr><tr><td>Liposome Extruder</td><td>Avestin</td><td>LiposoFast-Basic</td><td>As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.</td></tr><tr><td>Adhesive Tape</td><td>3M</td><td>Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)</td><td></td></tr><tr><td>Bath Sonicator</td><td>Bandelin Sonorex Digitec</td><td>DT-31</td><td>No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (&lt;a href=&quot;http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf&quot;&gt;Data sheet&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>Silicon Nitride AFM Cantilever&amp;nbsp;</td><td>Bruker AFM Probes</td><td>DNP-10</td><td>Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60&amp;nbsp;nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.</td></tr><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200</td><td></td></tr></tbody></table>

atomic force microscopy imaging and force spectroscopy of supported lipid bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

DOPC oluşan Desteklenen lipid bilayers: SM: Chol (2: 2: 1) AFM içinde görüntülendi (Şekil 2 AC). Çünkü lipit kompozisyonu, SM / Chol-zengini L o ve DOPC zengin L d fazlar gözlenmiştir. AFM görüntüleme yükseklik profili zar yapısı hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Yükseklik profili bakarak, iki tabakalı kalınlığı temin edilebilir membranın (Şekil 2B), veya L o / L D fazlar arasındaki yükseklik farkından kusur...

Watch this Scientific Journal Video about Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers at JoVE.com

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

atomic-force-microscopy-imaging-force-spectroscopy-supported-lipid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.7K Görüntüleme.  Interfaculty Institute for Biochemistry. We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Video: Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Biyokimya

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Atomik Kuvvet Spektroskopi Tek Molekül Yapışma incelenmesi

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Mühendislik

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

We present a method for achieving sub-nanometer resolution images with amplitude-modulation (tapping mode) atomic force microscopy in liquid. The method is demonstrated on commercial atomic force microscopes. We explain the rationale behind our choices of parameters and suggest strategies for resolution optimization.

Sıvı olarak Genlik modülasyonu Atomik Kuvvet Mikroskobu ile alt nanometre Çözünürlüklü Görüntüleme

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Biyomühendislik

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Mika hazırlanması Yüksek Çözünürlüklü Optik Mikroskopi Görüntüleme için lipit tabakalarının Desteklenen

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Visualizing Solution Structure at Solid-Liquid Interfaces using Three-Dimensional Fast Force Mapping

Amongst the challenges for a variety of research fields are the visualization of solid-liquid interfaces and understanding how they are affected by the solution conditions such as ion concentrations, pH, ligands, and trace additives, as well as the underlying crystallography and chemistry. In this context, three-dimensional fast force mapping (3D FFM) has emerged as a promising tool for investigating solution structure at interfaces. This capability is based on atomic force microscopy (AFM) and allows the direct visualization of interfacial regions in three spatial dimensions with sub-nanometer resolution. Here we provide a detailed description of the experimental protocol for acquiring 3D FFM data. The main considerations for optimizing the operating parameters depending on the sample and application are discussed. Moreover, the basic methods for data processing and analysis are discussed, including the transformation of the measured instrument observables into tip-sample force maps that can be linked to the local solution structure. Finally, we shed light on some of the outstanding questions related to 3D FFM data interpretation and how this technique can become a central tool in the repertoire of surface science.

<meta charset="utf8"></head><body>Üç Boyutlu Hızlı Kuvvet Haritalaması Kullanarak Katı-Sıvı Arayüzlerinde Çözüm Yapısını Görselleştirme

Here, we present a protocol for using three-dimensional fast force mapping - an atomic force microscopy technique - for visualizing solution structure at solid-liquid interfaces with the subnanometer resolution by mapping the tip-sample interactions within the interfacial region.

Üç Boyutlu Hızlı Kuvvet Haritalaması Kullanarak Katı-Sıvı Arayüzlerinde Çözüm Yapısını Görselleştirme

Amongst the challenges for a variety of research fields are the visualization of solid-liquid interfaces and understanding how they are affected by the ...

Kimya

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Konsol Tabanlı Nanogirinti: Hava ve Sıvıda Nanoölçekte Mekanik Özellik Ölçümleri

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

PLAYLIST