Name: culturing human pluripotent and neural stem cells in an enclosed cell culture system for basic and preclinical research
Uploaded: 2016-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research at JoVE.com

Yazarlar Xvivo kapalı hücre kültür sistemi, özellikle Matt Freeman kullanmayı öğrenme yardım ettikleri için Biospherix kadroyla kabul etmek istiyorum; Miles &amp; Kelley İnşaat Şirketi, laboratuvar altyapısı, özellikle Russ Hughes kurma çalışmaları için Inc.&#39;in personel; laboratuvar şeklini, özellikle Adam Lukhard ve Devin Hugie koordine çalışmaları için Tesisleri ve Destek Hizmetleri Orange County bölümünün Çocuk Hastanesi personeli; veri yönetimi altyapısı ve uzaktan erişim, özellikle Viet Tran kurma yardım ettikleri için Bilgi Sistemleri Orange County bölümünün Çocuk Hastanesi personeli; Projenin, özellikle Dr. Maria minon ve Brent Dethlefs onların uzun süredir destek Orange County Üst Yönetim Ekibi Çocuk Hastanesi. Bu eser Çocuk Orange County Hospital ve Rejeneratif tıp için California Institute tarafından finanse edildiPHS hibe TR3-05476 üzerinden e. Tüm yazarlar, bu çalışmaya eşit katkıda bulundu.

<ol>
	<li>Brick, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Autism+Spectrum+Disorders+Stem+Cell+Resource+at+Children's+Hospital+of+Orange+County:+Implications+for+Disease+Modeling+and+Drug+Discovery.">The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery.</a> Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).</li><li>Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+by+lentiviral+transduction.">Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction.</a> Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).</li><li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+HIF1alpha+repress+the+differentiative+effects+of+BMPs+in+high-grade+glioma.">Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma.</a> Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).</li><li>Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+controls+the+expansion+of+human+CNS+precursors+and+the+generation+of+astrocytes+and+oligodendrocytes.">Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes.</a> Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).</li><li>Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+non-viable+airborne+particles+correlates+with+airborne+colonies+and+represents+an+acceptable+surrogate+for+daily+assessment+of+cell-processing+cleanroom+performance.">Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance.</a> Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).</li><li>Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+stem+cell+therapies+for+neurological+diseases.">The potential of stem cell therapies for neurological diseases.</a> Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapies+for+the+lysosomal+storage+diseases+-+the+quintessential+neurodegenerative+diseases.">Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases.</a> Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture.">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).</li><li>Stover, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process-based+expansion+and+neural+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation+and+disease+modeling.">Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling.</a> J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).</li><li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging.">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).</li><li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

geri odasına mikroskop ve bölmeyi işlenmesine inkübatör hareket olarak CPF içinde yetiştirilen hücreler, oksijen veya karbondioksit konsantrasyonları herhangi bir değişiklik görüyoruz. Her bölme koşullar hücre kuluçka makinesinden çıkarılır önce hücreler tutulduğu özellikle inkübatör eşleştirilir kritiktir. aparat içindeki atmosfer sürekli HEPA filtreli ve oksijen ve karbondioksit konsantrasyonları ile ilgili özelleştirilebilir. Hücreler PSC&#39;ler veya NSC&#39;lerde,% 5 ve sırasıyla% 9, standart konsantrasyonlarda yetiştirilen olabilir; ya da seçenek konsantrasyonlarının farklı hücre tipleri için ya da belirli deneyler için seçilebilir. Bu nedenle, cihaz bir tıbbi dereceli oksijen, karbon dioksit ve azot ile (Şekil 4) sabit kaynakları ile birlikte verilir. Bu gazların tamamı üç sabit malzemeleri temin gaz özgü manifoldu sistemleri tarafından sağlanır. Cihaz, aynı zamanda bir kalibrasyon gazı karışımı, aşağıdakilerden oluşan besleniroksijen içinde% 10 (% 0.01 ±) karbon dioksit. manifoldu sistemleri, hücre üretim tesisi dışında yerleştirilmiştir ve gazlar tavan üzerinden tesis içine taşınıyor edilir. Kalibrasyon gazı tesisi içinde yer alır. Cihaz ayrıca da tavan üzerinden, ev vakumu ile birlikte verilir. gönderme birimleri bir elektronik izleme sistemini kullanarak ve kablosuz, tüm manifoldların çıktı basınçları sürekli izlenir. Herhangi bir basınç aralığında düşüyor durumunda, hücre üretim tesisi operatörleri otomatik olarak telefon ve uygun önlemler alınabilir şekilde bildirilir. aparatın güç gereksinimleri tavandan inen altı adanmış 120 V devreleri tarafından karşılandı ve sürekli tedarik sağlamak için hastanenin yedekleme jeneratörler bağlanır. aparatın operasyon bir kesintisiz güç kaynağı ile güçlendirilmiş bir PC tabanlı bir bilgisayarda yazılım üzerinden kontrol edilir. Bu güç ve bilgisayar düzenlemeleritemin etmesi, sürekli bile kamu gücü sistemi arızası durumunda sistem fonksiyonları. Aparatı kontrol yazılımı oksijen ve karbondioksit konsantrasyonları kontrolü yanı sıra sıcaklık, nem, ve oda basınçlar için izin veren bir kullanıcı dostu grafik arayüzü (Şekil 1). Tüm bu parametrelerin değerleri sürekli tüm cihaz parametreleri çalışan kaydını sağlamak için kaydedilmektedir. Bu veriler, bütünlüğünü korumak için her gece bir uzak sunucu üzerine yedeklenir. bilgisayar ve yazılım değerlendirmek ve / veya herhangi bir parametreyi değiştirmek için yönetici kullanıcılar tarafından uzaktan erişilebilir. Ayrıca, bilgisayar ve yazılım aygıtı parametrelerinin interaktif değerlendirmesine imkân ve yerel kullanıcılar ile sorun giderme, uzaktan erişilebilir. Ek bir alarm gönderme birimi cihazına bağlı hücre üretim tesisi operatörleri düzeneğin bir dışı hız durumunu belirten bildirilmesi gibi. Uzaktan erişim cKapasiteler giriş ve out-of-aralık durumunun özelliklerini değerlendirilmesi izin verir. Cihaz modüler bir sistem olarak hem makro ve mikro anlamda tasarlanmıştır. Bu kuluçka ve işlem odaları gibi tek bir hücre kültürü modüller birbirlerine göre olan boyutlar ve ihtiyaçları söz konusu olduğu gibi, hem de kendi düzeninde özelleştirilebilir. Ayrıca, bireysel modüllerin kontrol fonksiyonlarının çoğunu kendileri modüler böyle bireysel atmosferik gaz kontrolörleri, örneğin, kolayca sisteme önemli bir kesinti olmadan değiştirilebilir olmasıdır. bu mikro görselleştirme ve hücre kültürlerinin manipülasyonu için bir gibi özel işlem odaları, sisteme kolayca adapte edilir. Her iki faz-kontrast ve floresan mikroskop hücreleri canlı lekeli böylece sistemin (Şekil 6) içindedir ve koloniler t içinde aynı atmosferik şartlarda disseke edilebilirO Kuluçka makineleri. Işleme odasının yan duvarlarında mühürlü halkalardan geçirerek kabloların Yönlendirme güç kaynakları ve bilgisayarlar genellikle bir arabaya (Şekil 6) üzerine, aparatın dışında tutulması gibi donanımları tanır. Hücre üretim tesisinde işleme odaları geleneksel BSC&#39;ler farklı bir hava akımı desen var. Geleneksel BSC&#39;ler olarak, hava akımı merkezi havalandırma çıkışının aşağı akar ve daha sonra kabinenin kat ön ve arka kısmında iki farklı emme menfezleri tarafından alınan iki ayrı akım, ayrılır. Buna karşılık, CPF tavan ön kısmında tek delik vardır. Hava aşağı ve daha sonra bir giriş menfezi içine yukarı doğru çekilir bölme, arkasına doğru akar. FKP doğal, çok temiz olmasına rağmen, bu eşsiz hava akımı desen teknisyenleri biraz kontaminasyon riskini azaltmak için kendi tekniğini ayarlamak zorunda olduğu anlamına gelir. geleneksel BSC, bir laboratuar işçi s gibiAçık hücre kültür plakaları ve medya şişeleri yukarı ellerini koyarak hould kaçının. Ancak, yukarı olan yönü CPF değiştirilmiştir Hücre üretim tesisi laboratuvarı kendisi oldukça standart ve -20 ° C derin dondurucuda ile donatılmış olarak geliyor, -80 ° C derin dondurucuda, 4 ° C buzdolabı, bir santrifüj ve su banyosu. Laboratuvar de uygun eller serbest kullanım için ayak kontrolleri ile bir lavabo vardır. fonksiyonel klinik hücre üretim tesisi haline Bu laboratuvarda için, ancak, birkaç ek modifikasyonlar hala yapılmalıdır. Birincisi, cihaz kendisi uçucu organik bileşikler, partikülleri ve dekontaminasyon için kullanılan klor dioksit konsantrasyonlarının izlenmesi kapasitesine sahip yükseltilmiş olması gerekir. İkinci olarak, bir FACS makinesi ihtiva eden bir prosesleme gözü kapatıldı ve bir tampon modülü ile cihazının geri kalanına bağlanabilir. Bu hücre sıralama ve tr saflaştırılması için sağlayacakUygun çevre koşullarında ansplantable hücre popülasyonları. Son olarak, tüm cihaz yumuşak bir duvar temiz oda içinde muhafaza edilmelidir. Bu aparat 5 Standardizasyon (ISO) sınıfı 8 çevre için Uluslararası Örgütü sağlar. CPF yüksek sterilite ve bilgisayar kontrollü doğası hücre bazlı tedavi ve iyi üretim süreçleri ile gelecekteki uygulamalar için ideal bir sistem yapar. kirlenme riski büyük oranda hafifletilmiş, ama daha da önemlisi, hücre genişleme koşulları otomatik olarak kaydedilir ve bilgisayar sistemi tarafından arşivlenir. gaz konsantrasyonları, sıcaklık, nem, ve sisteme erişim tüm olaylarda sapmalar titizlikle belgelenmiştir. Ürün kalitesi sorunlarını araştıran bu ölçüde yardımcı olabilir. Ancak, yine de sınırlamalar vardır. Her türlü reaktifler ve sarf malzemeleri kullanımı (örneğin, medya bileşenleri, pipetler, plakalar) ayrı olarak belgelendirilmelidir. Eklemekitionally, Cpf izleme sistemi tarafından belgelenmiş değişkenlere tamamen ilgisiz olan ortaya çıkabilir (insan hatası birçok formları dahil) potansiyel sorunlar çok sayıda vardır. Böylece, yüksek eğitimli personel ve görevleri ayrıntılı manuel belgeler ihtiyacı yerinde kalır.

Standard stem cell culture techniques suffer from several environmental constraints that place undue stresses on the cells and expose the cells to unacceptable risks of contamination. Among the stresses that cells may endure under standard cell culture conditions are precipitous changes in the levels of carbon dioxide and oxygen concentrations3,4. This occurs when the cells are moved from the incubator to the biosafety cabinet and/or microscope which may not be optimal for the cells. Previous studies have confirmed the advantages of culturing both pluripotent and neural stem cells in hypoxic conditions4,11, and for best results, these conditions need to be continuous. Moreover, risks of cellular contamination are higher as the laboratory environment and personnel impinge upon the cells at almost every step of their culture and manipulation. Traditional clean rooms comprise one effective method to greatly decrease contamination risks but they are expensive, have a large footprint and fail to address stressors related to carbon dioxide and oxygen concentrations. 
A cell production facility that can address both contamination risks and gas concentrations and that can be qualified to meet cGMP criteria9 provides high quality cells for basic science research as well as clinical applications1,6,7. Such a cell production facility consists, at a minimum, of the following components: a process chamber, which acts as a heated workspace for the feeding and manipulation of cell cultures; a laminar flow hood, for the initial sterilization of reagents, tubes, and tools; two buffering airlock chambers in between the hood and the process chamber; two cell culture incubators accessible from the process chamber; a microscope chamber adjacent to the process chamber; and finally, computer software to set and monitor the conditions within these modules. Using this basic infrastructure, a wide variety of tasks can be performed, such as standard feeding and passaging of pluripotent stem cells and multipotent neural stem cells, as well as more specialized methods like Sendai virus-based reprogramming, in vitro migration studies, and differentiation of neural stem cells for electrophysiological characterization.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;i&gt;Xvivo System&lt;/i&gt;</td><td>Biospherix</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>&lt;i&gt;Xvivo&lt;/i&gt; Software</td><td>Biospherix</td><td>version i.o.2.1.2.1</td><td></td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Manifold</td><td>Amico</td><td>P-M2H-C3-S-U-OXY</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Manifold</td><td>Amico</td><td>M2H-C3-D-U-CO2</td><td></td></tr><tr><td>N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Manifold</td><td>Western Innovator</td><td>CTM75-7-2-2-BM</td><td></td></tr><tr><td>Microscope with DP21 camera and fluorescence</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>StemPro hESC Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>A100006-01</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Sodium</td><td>Hyclone</td><td>9236</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor 2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AFL233</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Protide</td><td>PP1130</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s-based Cell dissociation Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>Oct-3/4 Antibody</td><td>Millipore</td><td>AB3209</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4260</td><td></td></tr><tr><td>SSEA4 Antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>BIT-9500 Serum Supplement</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Consumable Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml Serological pipet</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-102</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-107</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>T25 flask</td><td>TPP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T-75 flask</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;l pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491130</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491148</td><td></td></tr><tr><td>1,000 pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491156</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Scientific</td><td>5000.102</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>BDH</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Sanimaster 4</td><td>Ecolab</td><td>65332960</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>A714239</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing human pluripotent and neural stem cells in an enclosed cell culture system for basic and preclinical research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Bu el yazması bazı ayrıntılı bir hücre üretim tesisi ve kapalı bir sistem içinde hücrelerin kültürlenmesi benzersiz özelliklerini açıklar. Hücre üretim tesisi toplu küçük bir ayak izi vardır ve kolayca bir 6 x 7,5 m 2 Oda (Şekil 2) içinde muhafaza edilebilir bir ısmarlama, Kapalı, hücre kültürü cihazı içermektedir. Hiçbir zaman laboratuar personeli veya ortama maruz kalan cihaz içinde hücrelerdir. Cihaz birkaç modülden oluşmaktadır: bir süreç odasını, bir laminer akış kaput, kaput ve süreç odasının, iki hücre kültür kuluçka merkezleri ve süreç odasına bitişik bir mikroskop odası arasında 2 tamponlama airlock odaları (Şekil 3). Sistem çevresel değişkenler (Şekil 1) kontrol ve izlenmesine olanak tanıyacak yazılım tarafından kontrol edilir. Bu yazılımı çalıştıran bilgisayar, bir kesintisiz güç kaynağı üzerindedir. Gazlar th besleniroksijen, azot ve karbon dioksit (Şekil 4) için manifoldlar bir dizi e sistemi. Etkin bir set ve bir yedek kümesi - aygıt için Gazlar tankların iki takım her vardır manifoldu sistemleri tarafından sağlanır. Aktif seti aşağı çekildiğinde, manifoldu otomatik olarak yedek ayarlanır ve personel sipariş yedek tankları geçer. güç bir yedek jeneratör sistemi üzerindedir. Pluripotent ve nöral kök hücreler yeni ekipman doğasında ekledi komplikasyonları olan, daha önce geliştirilen protokoller 9 kullanarak bu tesiste hipoksik koşullarda yetiştirilebilir. Pluripotent kök hücreler daha sonra izole edilir ve genişletilmiş tam transfekte koloniler, tespit etmek pluripotense-spesifik antikorlar kullanılarak, Sendai virüsü kullanılarak elde edilebilir. (Şekil 5A ve B), bu iPSCs kaynaktan, nöral kök hücreleri ve nöronların çifte SMAD inhibisyonu kullanılarak elde ve bunların fenotipi USI doğrulanabilir<html> ng NSC-özgü antikorlar (Şekil 5C ve D). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig1.jpg" /> Hücre Üretim Tesisi için Şekil 1. Grafik Arayüzü. (A) CPF grafiksel gösterimi varsayılan ekran ve (Şekil 1 2F) Şekil 3. Tampon Modülü 1 üzerinde fare bir tıklama gösterilen çizim CAD maçları O 2 değerleri (Şekil 3&#39;te 3) işlem odasını eşleşecek şekilde ayarlanır kendi kontrol ekranı (B) açılır. Benzer şekilde, Süreç tıklayarak Odası veya İnkübatör 1 değerleri uygun şekilde değiştirilebilir veya izlenebilir kendi kontrol ekranlarında (sırasıyla C ve D), getirir.<html> rYer = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig2.jpg" /> Hücre Üretim Tesisi 2. Şekil. (A) bir ön sağ görünümden görüldüğü gibi sistem. sağa mikroskop aksesuarları ve bilgisayar ile tavana güç ve gaz bağlantılarını ve arabası unutmayın. (B) sağda görülen tampon modülleri erişim kapıları ile laminer akış kaputu. Arkada görülen (C) iki indikatörler (siyah kapılar) ile işlem odası. (D) sistemin sağ tarafında üzerinden bir görünüm mikroskop gösteren ve mesafe görülen tampon odalarına kapılar izlemek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> t &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53685/53685fig3.jpg" /> Hücre Üretim Tesisi Şekil 3. A CAD Drawing. Cihazı giren tüm öğeler ilk laminer akış kaputu kurutulmuş alkol ve hava ile sildi (1). Öğeler sonra UCPC modülüne geçirilmeden önce ön tampon modülü (2F) uygun atmosfere geçiş, ya da Proses Odası (3). Hücreler, iki kuluçka (4, 5) &#39;de kültürlenmiştir. Canlı hücre boyama, koloni toplama, genel hücresel morfoloji ve göç analizi değerlendirilmesi UPC modülünde yer alan, ya da Mikroskop Odası (6). Son olarak, atık arka tampon modülü (2R) aracılığıyla sisteme çıkar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> &lt;<html> / P&gt; <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53685/53685fig4.jpg" /> Gazların ve Güç Şekil 4. kaynakları. (A) laboratuvarın tüm inkübatör malzemeleri olarak CO 2 manifoldu 4 x 4 kurulum. (B) O 2 manifoldu 2 x 2 kurulum ve malzemeler sadece hücre üretim tesisidir. Sistem için azot aynı zamanda otomatik olarak (sol alt) cryofreezers doldurur (sağda) bir sıvı azot manifolduna bağlı (sadece çıkış işareti altında, C) bir buharlaştırıcı oluşturulur. Manifold 160 litre sıvı azot tank iki çift beslenir 2 x 2 ayarlanır. CO2, O2 ve N2 durdurucular (d) &#39;tavandan temin edilmektedir. Ev tipi vakum, aynı zamanda bu konumda temin edilir. sisteme güç kaynağı elektrik kabloları bir çift sadece tedarik Gaz durdurucular arkasında gördüm.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53685/53685fig5.jpg" /> Sendai virüsü ile Hipokside türetilmiş Şekil 5. pluripotent kök hücrelerin (A). SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (terminolojisi Stover et al. 9 bulunur), faz kontrast 10X. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs AF-594-etiketli Tra-1-60, 1 canlı boyanmış: Medyada 100 seyreltme. Tüm iPSCs Sendai virüsü ile% 5 O 2 hücre üretim tesisinde kalıt. Oda slaytlar% 5 O 2 yetiştirilen SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 iPSC türetilmiş NSC&#39;lerde (C) Faz kontrast. Hücreler daha sonra% 4 paraformaldehid içinde sabitlendi ve anti-insan Nestin birincil antikor ile boyanmış ve Alex-488 ikincil antikor edildi. Tüm ölçek çubukları 100 altındadır1;. M <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research at JoVE.com

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Temel ve Klinik öncesi Araştırma bir Kapalı Hücre Kültürü Sistemi İnsan Pluripotent ve Sinir Kök Hücre Kültürleme

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

culturing-human-pluripotent-neural-stem-cells-an-enclosed-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.2K Görüntüleme.  Childrens Hospital of Orange County Research Institute. Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Video: Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

A Novel Kültür Modeli İnsan Pluripotent için Plasenta klimalı Medyada Jelatin üzerinde hücre çoğalma Kök

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Gelişim Biyolojisi

Passaging Human Neural Stem Cells

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes as well as to explore many fundamental processes of human neural development and pathology.  This protocol presents a simple method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of standardizing this technique and increasing reproducibility of human stem cell research.  The hNSPCs we use were isolated from cadaveric postnatal brain cortices by the National Human Neural Stem Cell Resource and grown as adherent cultures on flasks coated with fibronectin (Palmer et al., 2001; Schwartz et al., 2003).  We culture our hNSPCs in a DMEM:F12 serum-free media supplemented with EGF, FGF, and PDGF and passage them 1:2 approximately every seven days.  Using these conditions, the majority of the cells in the culture maintain a bipolar morphology and express markers of undifferentiated neural stem cells (such as nestin and sox2).

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro allows to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes and to explore human neural development. This protocol presents a method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of increasing reproducibility of human stem cell research.

İnsan Nöral Kök Hücreler Pasajlanması

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Biyoloji

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

Atılan İnsan Fetal Kortikal Doku Sinir Kök Hücre Üretimi

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Nörobilim

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Tek Hücre Kültürünü Kullanarak Etkin Nöral Farklılaşma

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Otomatik Kültür Sistemi Kullanılarak İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre Farklılaşması

An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, including the elucidation of rare disease pathologies, the development of new medicines, and regenerative medicine aiming to restore damaged organs. Despite this, the social implementation of hiPSCs is still limited. This is partly because of the difficulty of reproducing differentiation in culture, even with advanced knowledge and sophisticated technical skills, due to the high sensitivity of iPSCs to minute environmental changes. The application of an automated culture system can solve this issue. Experiments with high reproducibility independent of a researcher's skill can be expected according to a shared procedure across various institutes. Although several automated culture systems that can maintain iPSC cultures and induce differentiation have been developed previously, these systems are heavy, large, and costly because they make use of humanized, multi-articulated robotic arms. To improve on the above issues, we developed a new system using a simple x-y-z axis slide rail system, allowing it to be more compact, lighter, and cheaper. Furthermore, the user can easily modify parameters in the new system to develop new handling tasks. Once a task is established, all the user needs to do is prepare the iPSC, supply the reagents and consumables needed for the desired task in advance, select the task number, and specify the time. We confirmed that the system could maintain iPSCs in an undifferentiated state through several passages without feeder cells and differentiate into various cell types, including cardiomyocytes, hepatocytes, neural progenitors, and keratinocytes. The system will enable highly reproducible experiments across institutions without the need for skilled researchers and will facilitate the social implementation of hiPSCs in a wider range of research fields by diminishing the obstacles for new entries.

Yazar Spotlight: Gelişmiş Tekrarlanabilirlik için iPSC Kültürünü Otomatikleştirme 

Here, we present a protocol for an automated cell culture system. This automated culture system reduces labor and benefits the users, including researchers unfamiliar with handling induced pluripotent stem (iPS) cells, from the maintenance of iPS cells to differentiation into various types of cells.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin korunması ve ayırt edilmesi için otomatik bir kültür sistemi

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

İnsan Pluripotent için alternatif Kültürleri Hücre Üretim, Bakım ve Genetik Analizi Kök

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Enfeksiyon ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Embriyonik Fare Beyni Karışık Hücre Kültürleri

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of neurons, astrocytes, oligodendrocytes, and microglia. Due to increasing efforts to replace and reduce animal use, a variety of in vitro cell culture systems have been developed to explore innate cell properties, which allow the development of therapeutics for CNS infections and pathologies. Whilst certain research questions can be addressed by human-based cell culture systems, such as (induced) pluripotent stem cells, working with human cells has its own limitations with regard to availability, costs, and ethics. Here, we describe a unique protocol for isolating and culturing cells from embryonic mouse brains. The resulting mixed neural cell cultures mimic several cell populations and interactions found in the brain in vivo. Compared to current equivalent methods, this protocol more closely mimics the characteristics of the brain and also garners more cells, thus allowing for more experimental conditions to be investigated from one pregnant mouse. Further, the protocol is relatively easy and highly reproducible. These cultures have been optimized for use at various scales, including 96-well based high throughput screens, 24-well microscopy analysis, and 6-well cultures for flow cytometry and reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analysis. This culture method is a powerful tool to investigate infection and immunity within the context of some of the complexity of the CNS with the convenience of in vitro methods.

Yazar Spotlight: Enfeksiyon ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Embriyonik Fare Beyinlerinden Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürlerinin Kurulması  

This protocol presents a unique way of generating central nervous system cell cultures from embryonic day 17 mouse brains for neuro(immuno)logy research. This model can be analyzed using various experimental techniques, including RT-qPCR, microscopy, ELISA, and flow cytometry.

Embriyonik Fare Beyinlerinden Enfeksiyonu ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürleri Oluşturmak

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of ...

Temel ve Klinik öncesi Araştırma bir Kapalı Hücre Kültürü Sistemi İnsan Pluripotent ve Sinir Kök Hücre Kültürleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

PLAYLIST