Yazarlar fare derisinde sporozoit motilite in vivo görüntüleme öğretim için resim ve Pauline Formaglio alarak yardım için Patricia Baldacci, Vanessa Lagal ve Sabine Thiberge eleştirel okuma, Irina Dobrescu ve Sabine Thiberge teşekkür ederiz. Biz de sivrisinek yetiştirme için Üretim ve Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) ve Enfeksiyon için Marek Szatanik ve Merkezi teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Laboratoire d&#39;Excellence &quot;Infectious Diseases Yükselen ve Bütünleştirici Biyoloji&quot; den AXA Araştırma Fonu ve fonlar tarafından desteklenmiştir (no. ANR-10-LabX-62-IBEID hibe).

<html> Tüm işlemler Pasteur Enstitüsü komitesi tarafından ve yerel Hayvan Deneyleri Etik Komitesi (Etik kurul IDF-Paris 1, Paris, Fransa; anlaşma numarası: 2012-0015) tarafından onaylanmış ve yürürlükteki kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 1. Malzemeler ve Reaktifler <ol><li> Daha önce 21 açıklandığı gibi 3-5 gün ortaya çıkması ve arka sonrası enfekte olmuş fareler üzerinde beslemek dişi Anopheles stephensi sivrisinek (Sda500 suşu) kullanın. </li><li> Kullanım parazitler yapısal ısı şok proteini 70 (HSP70) promoteri kontrolü altında yeşil floresan proteini (GFP) geni, Plasmodium berghei ANKA klonu. Bu parazit yaşam döngüsü 22 boyunca parlak floresan verir. </li><li> Kullanım dişi C57BL / 6JRj fareleri (7 haftalık). NOT: açıklanan protokol kullanılan tüm reaktifler Malzemeleri / Ekipman güçlü T listelenmiştir. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. Radyasyon-zayıflatılmış Sivrisinek Tükürük Bezleri gelen Sporozoit İzolasyon <ol><li> Bulaşıcı kan yemekten sonra 18-25 gün arasında, toplamak ve daha önce 21 açıklandığı gibi buz üzerinde bir 15 ml tüp içine sivrisinekler soğuk uyutmak. Dikkatle tersini tüp Petri kabı üzerine aktarabilirsiniz. buz üzerinde böcekleri korumak ve γ- veya x-radyasyon 12 Krad dozuna sivrisinek maruz bırakmaktadır. </li><li> Işınlanmış sivrisinek tükürük bezlerinden gelen zayıflatılmış sporozoit yalıtmak daha önce 21 nitelendirdi. sporozoit serbest ezmek yavaşça buz üzerinde 1 x Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) (15 ul) etrafında küçük bir hacme enfekte tükürük bezleri toplayın ve. Not: kendi güçlü bir ifade ile kanıtlandığı gibi kritik bir küçük bir hacim içinde oldukça konsantre bir parazit süspansiyonu enjeksiyonu, önceden seçilmiş de enfekte sivrisinek yüksek sayıda tükürük bezi yeterli sayıda hasat etmek gereklidirYeşil-floresan. </li><li> kümeleri ve sivrisinek artıkları yok etmek için düşük bir yapışma 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü için uyarlanmış bir 35 um hücre filtresi kapağı ile sporozoit süspansiyon filtre. </li><li> Daha önce 21 açıklandığı gibi izole sporozoitlerine toplam sayısını ve 83000 sporozoit / ul elde etmek için soğuk 1x DPBS ile parazit süspansiyonu konsantrasyonunu ayarlamak. Bir sonraki adımlar devam ederken buz üzerinde parazit saklayın. </li><li> Negatif kontrol olarak kullanılan ve adım 2.2 ve 2.3 açıklandığı gibi örnek işleme edilecek bulaşmamış sivrisineklerden tükürük bezlerinin eşdeğer sayıda toplamak. süspansiyon içinde tükürük bezi özleri içindeki konsantrasyonu elde etmek için, yukarıda belirtildiği gibi örnek seyreltilir. Not: Sporozoitler 2 saatlik bir süre için buz üzerinde saklanabilir. Ancak, ideal olarak da tükürük bezleri ezme sonra bir saat içinde enjekte edilir. </li></ol> Dermal La içine sporozoitlerine 3. EnjeksiyonKulak Yer <ol><li> ketamin intraperitoneal enjeksiyonu (50 mg / kg) / ksilazin (5 mg / kg) karışımı, hayvanların anestezisi. Fare bilinçsizlik durumda olması ve kornea kurumasını önlemek için gözleri oftalmik merhem uygulamak için 5-8 dakika bekleyin. iki arka ayakları üzerinde yumuşak bir ayak tutam yaparak anestezi derinliği değerlendirin. NOT: Anestezi dozu az 20 dakika sürer, bu nedenle sonraki adımlar hızla yapılmalıdır. </li><li> Daha önce bir stereomikroskopta (Şekil 1A) altına şeffaf bir bantla ventral tarafı sabitleme ile fare kulak kulak kepçesi stabilize. Yavaşça damarların zarar görmesini önlemek için kulak basın. </li><li> Yeniden süspanse parazitlerin 10 0.6 ul 10 ul şırınga / 35 ölçü eğimli iğne yükleyin. </li><li> Ile dikkatlice epidermis altında, kulak (Şekil 1A) dorsal tarafında iğne sokarak 4 enjeksiyon siteleri (site başına 0.15 ul) sporozoit süspansiyon sununkonik kadar herhangi bir kan damarları önlemek için özen. Birkaç saniye çıkarmadan önce, enjekte geri akmasını önlemek için iğne dermis kalmasına izin. Bir prosedür (Şekil 1B ve 1C) sonunda her enjeksiyon noktasında karakteristik papül dikkate alınmalıdır. </li><li> Enjeksiyondan sonra, dikkatlice kasetten kulak çıkarın. </li><li> adım 3.2-3.4 izleyerek parazitlerin aynı dozda karşı kulak enjekte edilir. </li><li> yalnız enjeksiyon ve dermis sivrisinek materyalin birikimi ile oluşan iltihabi yanıtı değerlendirmek amacıyla 1x DPBS 0.6 ul veya enfekte olmayan sivrisineklerden 1x DPBS + tükürük bezi ekstraktı 0.6 ul ya 2 ek fareler enjekte edilir. </li><li> kafes içine geri koymadan önce anestezi fare kurtarma izleyin. Not: Cilt uygun sporozoit yerleştirme floresan mikroskobu (Şekil 2A ve 2B ile izlenebilirPrevisously 23 tarif edildiği gibi), fare hazırlanmaktadır. </li></ol> 4. Deri ve boşaltılması lenf nodu diseksiyonu <ol><li> standart ortam (SM) hazırlanması şu şekilde: Dulbecco&#39;nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) + 25 mM 4- (2-hidroksietil) 400 U ile takviye edilmiş 1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) / ml kolajenaz ve 50 ug / ml deoksiribonükleaz (Dnase) . </li><li> dLn örnekleri için oyuk başına + 70 um hücre filtresi 4.5 mi SM (plaka) ve deri örnekleri için oyuk başına 4.5 mi SM (Levha B) buz üzerinde iki adet 6 gözlü düz dipli doku kültürü plakaları hazırlayın. </li><li> sporozoit inokülasyondan sonra arzu edilen bir zaman noktasında, derin intraperitonal ketamin enjekte (125 mg / kg) / ksilazin (12.5 mg / kg) karışımı ile önceden servikal dislokasyon ile fare anestezi. Fare klinik ölüm belirtileri gösteren emin olun ve hemen diseksiyonu başlar. Not: miyeloid hücre alımı kinetiği inj sonra farklı zamanlarda incelenebilirection (yani 2 saat, 4 saat ve daha önce tarif edildiği gibi 14 24 saat). </li><li> bulaşma olasılığını azaltmak için aşılanmış kulak ve% 70 etanol ile ilgili boyun bölgesini dezenfekte. </li><li> Steril makas ve forseps kullanarak, aseptik çevreleyen yağ toplama olmadan proksimal aurikular dLn teşrih. jugulo-carotidian sulkusta bir ilk kesi gerçekleştirmek ve işletme alanında tüyleri. çevre dokuya kıyasla grimsi görünür dLn açığa 2 forseps ile kesi gerin. </li><li> onun çıkarılmasını kolaylaştırmak için forseps ile dLn üstünde dikkatle bağ dokuları çimdik. Lenfoid doku (Şekil 3A ve 3B) altında bir forseps yerleştirerek dLn çıkarın. iyi içeren 4,5 ml SM + 70 mikron hücre süzgeç (Levha A) dLn yerleştirin. </li><li> Steril keskin bir makas ve forseps (Şekil 4A) kullanarak tüm inoküle kulak hasat. Separkısma ve iki forseps (- 4E Şekil 4B) ile biten kesim dışında boşluk ile kulağın dorsal ve ventral yönlerini yedik. Her iki dokular tamamen ortamda batırılır emin iyi içeren 4.5 ml SM (Levha B) içine yerleştirin. Not: Deney güvenilirliğini artırmak ve ilgi hücre sayısını arttırmak için, havuz 2 numune başına aynı fare kulağı ya da 2 dLNs enjekte edildi. </li><li> Kulakları ve 1x DPBS veya tükürük bezi özleri ya ile aşılanmış farelerin dLNs paralel olarak hasat ve süreç. Negatif ve tek boyama tazminat kontrolleri için naif bir fare hasat 2 ek kulak ve lenf nodu örnekleri ekleyin. </li></ol> Lenf düğümleri 5. Hücre İzolasyonu <ol><li> Hafif ajitasyon altında 15 dakika boyunca 37 ° C ila +% 5 CO2 lenf düğümleri (plaka) inkübe edin. kolajenaz ve DNaz acti nötralize etmek için oyuk başına 10 mM son etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ilavevities. buz üzerinde sonraki adımları gerçekleştirin. </li><li> 5 ml şırınga pistonu üst ucunu kullanarak lenf düğümleri ayırmak. kalan tüm kadar süzgeç karşı dairesel hareketlerle basın beyaz bağ dokusu olduğunu. </li><li> 500 ul 1x DPBS +% 2 fetal sığır serumu (FBS) + 2mM EDTA ile iki defa hücre süzgecinden durulayın. 15 ml&#39;lik bir tüp içinde oyuk tüm hacmi aktarın. </li><li> +% 2 FBS + 2 mM EDTA, 500 ul 1 x DPBS ile de iki kez yıkayın ve 15 ml tüp içine ses transferi. buz üzerinde tüpler tutun. </li></ol> Kulak Cilt 6. Hücre İzolasyonu <ol><li> Hafif ajitasyon altında, 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de 5% CO2 kulak bildiri (levha B) inkübe edin. Not: inkübasyon 20 dakika sonra, doku sindirimi kolaylaştırmak ve kalan 40 dakika boyunca kuluçka makinesi içinde tekrar örnek koymak için küçük parçalar halinde makas kulak bildiriler kesti. Tek hücre inkübasyon süresi sonunda ortam içinde görülmektedir. </li><li> 10 mM finalini ekle<html> oyuk başına EDTA kolajenaz ve DNaz eylemlere karşı. buz üzerinde sonraki adımları gerçekleştirin. </li><li> Yeni kuyu bir 1ml pipet kullanarak 70 mikron hücre süzgeç içeren kulak doku parçaları ve orta tüm hacmi aktarın. daha kolay kulak doku parçaları toplamak için ucunun sonundan itibaren 2 ila 3 mm kesin. </li><li> 5 ml şırınga pistonu üst ucunu kullanarak kulak doku parçaları ayırmak. kalan tüm kadar süzgeç karşı dairesel hareketlerle basın beyaz bağ dokusu olduğunu. </li><li> 500 ul 1x DPBS +% 2 FBS + 2 mM EDTA ile iki kez hücre gericileri durulayın. </li><li> 70 mikron hücre süzgecinden 50 ml&#39;lik tüp içine de tüm hacmi aktarın. </li><li> de 500 ul 1x DPBS +% 2 FBS + 2 mM EDTA yıkayın ve 50 ml&#39;lik bir tüp içine ses transferi. buz üzerinde tüp tutun. Not: farklı adımlar cilt toplam hücrelerin izole edilmesi ve dLn dokular Şekil 5&#39;te özetlenmiştir. </li></ol>başlığı &quot;&gt; 7. Kont ve Canlılık Toplanan Hücreler <ol><li> 4 ° C&#39;de 450 x g&#39;de 5 dakika boyunca deri ve dLn örnekleri santrifüj ve supernatant atın. Yavaşça 300 ul 1x DPBS +% 2 FBS + 2 mM EDTA ile pelletini. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak deri ve dLn izole hücrelerin toplam sayısını saymak için, her numune, küçük bir hacim toplayın. % 0.04 hücre yaşayabilirliğini belirlemek için tripan mavisi ekleyin. </li></ol> Sigara 8. Bloklama antijene özgü bağlanma <ol><li> işaretsiz CD16 / CD32 Fc Block antikorunun 10 ug / ml ilave edilir. (Daha uzun gidebilir), 4 ° C&#39;de 20 dakika inkübe edilir. </li><li> Soğuk 1x DPBS +% 2 FBS + 2 mM EDTA 2 ml ilave edilir. 4 ° C&#39;de 450 x g&#39;de 5 dakika boyunca numune santrifüj ve supernatant atın. Yavaşça +% 2 FBS + 2 mM EDTA, 300 ul 1 x DPBS pelletini ve buz üzerinde örneklerin korumak. </li></ol> 9. Boyama Deri ve Lenf Nodu Myeloid Hücreleri <ol><li> Daha önce bloke ski inküben ve dLn canlı / ölü izleyicinin (örneğin 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol ve DAPI), anti-CD45 ve anti-CD11 b özgü antikorlarla hücreleri izole edilmiştir. NOTLAR: ilgi miyeloid hücre alt-popülasyonunu, özellikle az olanları zenginleştirmek için, CD45 + hücreleri ve lenfositler, sırasıyla deriden saflaştırılabilir veya manyetik boncuk kolaylaştırıcı hücre sıralama ile dLn tükenmiş. DLn izole hücrelerin çoğu bu yana CD45 +, anti-CD45 kullanılması zorunlu değildir bulunmaktadır. Diğer belirteçleri pozitif veya negatif-yolluk strateji ile ilgi miyeloid hücre alt popülasyonlarını belirlemek için dahil edilebilir. Bu protokol, dLn olarak silah miyeloid hücrelerin CD8α + hücreler hariç tutarak zenginleştirildi (tüm T hücresi bölümü, hem anti-CD3 spesifik antikor kullanılarak hedeflenebilir). </li><li> Karanlıkta 4 ° C&#39;da 30 dakika kuluçkalayın. 4 ° C&#39;de 450 x g&#39;de 500 ul 1x DPBS +% 2 FBS + 2 mM EDTA, santrifüj numune 5 dakika ekleyin ve supe atınrnatant. iki kez yıkama adımı yineleyin. </li><li> 300 ul 1x DPBS +% 2 FBS + 2 mM EDTA ile örnekleri yeniden süspanse edin. 35 mikron hücre süzgecinden FACS tüp içinde tüm hacim aktarın. 100 ul 1x DPBS +% 2 FBS + 2 mM EDTA ile durulayın. </li><li> bir akış sitometresinin lekeli hücrelerin çalıştırın. Kapı tek hücreleri canlı (DAPI - FSC-W) ölü hücreleri ve ikilileri dışlamak için. DLN (Şekil 6B) için CD11b + olaylar - Deri (Şekil 6A) ve (CD45 +) CD8α için arsa CD45 + CD11b + olaylar. </li></ol>

<ol>
	<li>Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+immunity+produced+by+the+injection+of+x-irradiated+sporozoites+of+plasmodium+berghei.">Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei.</a> Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).</li><li>Hoffman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+humans+against+malaria+by+immunization+with+radiation-attenuated+Plasmodium+falciparum+sporozoites.">Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites.</a> J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).</li><li>Mueller, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+liver+stage+developmental+arrest+by+depletion+of+a+protein+at+the+parasite-host+interface.">Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).</li><li>Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schl&#252;ter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+attenuated+Plasmodium+berghei+liver+stages+persist+and+elicit+sterile+protection+primarily+via+CD8+T+cells.">Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells.</a> Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).</li><li>Tarun, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protracted+sterile+protection+with+Plasmodium+yoelii+pre-erythrocytic+genetically+attenuated+parasite+malaria+vaccines+is+independent+of+significant+liver-stage+persistence+and+is+mediated+by+CD8++T+cells.">Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells.</a> J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).</li><li>van Dijk, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+attenuated,+P36p-deficient+malarial+sporozoites+induce+protective+immunity+and+apoptosis+of+infected+liver+cells.">Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).</li><li>Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superior+antimalarial+immunity+after+vaccination+with+late+liver+stage-arresting+genetically+attenuated+parasites.">Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites.</a> Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).</li><li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+T+cell+immunity+against+malaria+liver+stage+after+vaccination+with+live+sporozoites+under+chloroquine+treatment.">Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment.</a> J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).</li><li>Behet, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporozoite+immunization+of+human+volunteers+under+chemoprophylaxis+induces+functional+antibodies+against+pre-erythrocytic+stages+of+Plasmodium+falciparum.">Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum.</a> Malar J. 13, 136 (2014).</li><li>Amino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+Plasmodium+transmission+from+mosquito+to+mammal.">Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal.</a> Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).</li><li>Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+sporozoites+trickle+out+of+the+injection+site.">Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site.</a> Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).</li><li>Gueirard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+malaria+parasite+in+the+skin+of+the+mammalian+host.">Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).</li><li>Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrahepatic+exo-+erythrocytic+forms+of+rodent+malaria+parasites+at+the+site+of+inoculation:+clearance+after+immunization,+susceptibility+to+primaquine,+and+contribution+to+blood-stage+infection.">Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection.</a> Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).</li><li>Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+lymphocytes+protective+against+malaria+liver+stages+are+primed+in+skin-draining+lymph+nodes.">CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes.</a> Nat Med. 13 (9), (2007).</li><li>Obeid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-draining+lymph+node+priming+is+sufficient+to+induce+sterile+immunity+against+pre-erythrocytic+malaria.">Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria.</a> EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).</li><li>Amino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+traversal+is+important+for+progression+of+the+malaria+parasite+through+the+dermis+to+the+liver.">Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver.</a> Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).</li><li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph-node+resident+CD8&#945;++dendritic+cells+capture+antigens+from+migratory+malaria+sporozoites+and+induce+CD8++T+cell+responses.">Lymph-node resident CD8&#945;+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses.</a> PLoS Pathog. 11 (2), e1004637 (2015).</li><li>da Silva, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+skin+immunological+disturbance+after+Plasmodium-infected+mosquito+bites.">Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites.</a> Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).</li><li>Mac-Daniel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+immune+response+to+injection+of+Plasmodium+sporozoites+into+the+skin.">Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin.</a> J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).</li><li>Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+capture+of+infected+neutrophils+by+dendritic+cells+in+the+skin+inhibits+the+early+anti-leishmania+response.">Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response.</a> PLoS Pathog. 8 (2), e1002536 (2012).</li><li>Thiberge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo.+imaging+of+malaria+parasites+in+the+murine+liver.">In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).</li><li>Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium-dependent+protein+kinase+regulates+Plasmodium+ookinete+access+to+the+midgut+epithelial+cell.">A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell.</a> Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).</li><li>Amino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+malaria+sporozoites+in+the+dermis+of+the+mammalian+host.">Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).</li><li>Ploemen, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+liver+load+following+parenteral+sporozoite+administration+in+rodents.">Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents.</a> Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).</li><li>Epstein, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+attenuated+malaria+vaccine+designed+to+protect+through+hepatic+CD8+T+cell+immunity.">Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity.</a> Science. 334 (6055), 475-480 (2011).</li><li>Roestenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+protection+against+malaria+after+experimental+sporozoite+inoculation:+an+open-label+follow-up+study.">Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study.</a> Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).</li><li>Seder, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+malaria+by+intravenous+immunization+with+a+nonreplicating+sporozoite+vaccine.">Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine.</a> Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).</li><li>Douradinha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+attenuated+P36p-deficient+Plasmodium+berghei+sporozoites+confer+long-lasting+and+partial+cross-species+protection.">Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection.</a> Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function.">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Bütün sporozoit sıtma aşısı kullanan insanların büyük ölçekli aşılama perspektifinde, üstesinden gelmek için ana sorunlardan biri başarılı bağışıklama ve koruma 24,25 sağlamak için optimize yolları ve parazit uygulama yöntemlerini geliştirmektir. İnsanlarda, canlı azaltılmış parazitler (LAP) tarafından aracılık edilen koruyucu etkinlik değerlendirilmesi doğal sivrisinek takip gerçekleştirilmiştir 2, hem de intradermal, deri altı 25,26 ve IV&#39;ü...

Sıtma her yıl yarım milyondan fazla kişi öldü dünyanın en ölümcül bulaşıcı hastalıklardan biridir. Plasmodium hastalığın nedensel maddesi ile enfeksiyon, bir eritrositik öncesi (PE), faz başlar. Bu aşamada, bir dişi anopheline türü sivrisinek tarafından konak deriye enjekte sporozoitler kan yoluyla karaciğere ulaşır ve hastalığın belirtilerini kırmızı kan hücreleri enfekte ve neden parazit formları içine iç hepatositler ayırt. Plasmodium PE aşamaları, anti-sıtma aşısı için ayrıcalıklı bir hedef temsil etmektedir. Nitekim, bu tür radyasyon zayıflatılmış sporozoitlerle (RAS) olarak bu aşamaların karşı zayıflatılmış aşılar, canlı, genetik tutuklandı parazitler (GAP) ya da kemoprofilaksi ve sporozoitler (CPS) kemirgen ve insan ana 1-9 hem korumak için kapasitelerini ortaya koymuşlardır. kemirgen modelinde, çok aşılama çalışmaları intravenöz bağışıklık kullanılarak yürütülmektedirKoruyucu etkinlik açısından altın standart hangi. Ancak, cilt aşamasında tanımı ve koruması sağlamaya cilt ilişkili lenf düğümüne (DLN) önemi PE aşaması algı değişti ve enjeksiyon intradermal yolunun önemini vurgulamıştır. P. Intravital görüntüleme kemirgen derisine enjekte berghei sporozoitler aşı sadece ~% 25 kan yoluyla karaciğer ulaşır göstermiştir. ~ Geri kalan% 75, küçük bir oranda deri hücrelerinin 12,13 içinde haftalarca canlı dönüştürmek ve kalabilir proksimal dLn (~% 15) ve cilt (~% 50) 10,11 arasında dağıtır. Ayrıca, daha sonraki çalışmalarda, intradermal aşılamadan sonra etkin koruyucu bağışıklık kurulması özellikle parazit spesifik CD8 + T hücreleri, aktive deri dLn, yer alır ve sadece marjinal karaciğer veya dalak-dLNs 14,15 bu tarif. İkençalışmaların çoğu koruyucu bağışıklık yanıtının kurulmasında rol efektör hücrelerin karakterizasyonu üzerine yoğunlaşmıştır, çok daha az doğuştan gelen bağışıklık sistemi ile özellikle etkileşimleri, deri içine enjekte canlı zayıflatılmış parazitlerin akıbeti hakkında bilinmektedir. Özel olarak, CD8 + T hücreleri için, parazit antijen alımı, işleme ve sunumunda rol alan antijen sunan hücreler karakterizasyonu PE antijen alıcı deri ve dLn bölümlerinde hem oluşabilir bilerek kritik önem taşımaktadır. Önceki intravital görüntüleme çalışmaları sporozoitler ve dendritik hücreler arasındaki ilk etkileşimler dLn 10,17 gözlenmiştir ise enfeksiyon sivrisinek ısırığı 16 Aşağıdaki deri, parlak floresan Lys-GFP pozitif hücrenin erken akışını tarif. Daha yakın zamanda, sivrisinekler tarafından deri aşılanmış sporozoitler deri hem de dendritik ve düzenleyici T hücrelerinin hareketliliği artırdığı bildirilmiştirfareler, antijen sunan hücre bir azalma sayısı dLn 18 gözlenmediğini gösterdi. Belirlemek ve daha kesin olarak, lökosit alt kümelerini cilt alınmış ve RAS 19 dozlarının immünize intradermal enjeksiyonu takiben parazit ile etkileşim gibi da dLn gelen ölçmek için amaçlanmıştır. Bu bağlamda, her iki dokulardan miyeloid hücreler (CD45 + CD11 +) izole edilmiş ve sitometrisi = çoklu parametre akış ilgi subpopülasyonunun karakterize edilir. Leishmania majör deri enfeksiyonu 20 erken evrede açıklanan immün yanıt ile tutarlı, enjeksiyon sporozoitlerden birincil konak yanıtı inflamatuar monositler (CD45 + CD11 b takip polimorfonükleer nötrofillerin (CD45 + CD11 b + Ly6G + Ly6C int) bir ardışık işe oluşur + Ly6G - differenti temelinde tanımlanan Ly6C +)Ly6G ve Ly6C yüzey belirteçleri al ifadesi. Farenin deri miyeloid hücrelerin izole edilmesi ve dLn enfekte sivrisinek tükürük bezlerinden ekstre RAS dozlarının immünize intradermal enjeksiyonu takiben burada bir protokol açıklar. Tekrarlanabilir intradermal enjeksiyonları ve doku işleme enfekte dokular içinde hücre popülasyonu infiltre fenotipik değişiklikleri ölçmek için kritik adımlar vardır. Aşağıda ayrıntılı bir yaklaşım güvenilir bir deney Plasmodium paraziti cildin ve dLn enflamatuar tepkiyi değerlendirmek için çeşitli deney sistemlerinde uzatılabilir içerir.

<table><tbody><tr><td>Ketamine: Imalgene&amp;reg; 1,000</td><td>Merial</td><td>-</td><td>50 mg/kg: prior sporozoite injection

125 mg/kg: prior sacrifice</td></tr><tr><td>Xylazine: Rompun&amp;reg; 2%</td><td>Bayer</td><td>-</td><td>5 mg/kg: prior sporozoite injection

12.5 mg/kg: prior sacrifice</td></tr><tr><td>NanoFil syringe + 35 gauge needle</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Omnican&amp;reg; 50 Insulin syringe 0.5 ml/50 I.U.</td><td>B. Braun Medical&amp;nbsp;</td><td>9151125</td><td>-</td></tr><tr><td>MultiwellTM 6 well tissue culture plate &amp;ndash; Flat Bottom</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>353046</td><td>-</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m cell strainer&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>352350</td><td>-</td></tr><tr><td>2 ml syringe</td><td>Terumo</td><td>SS-02S</td><td>-</td></tr><tr><td>BLUE MAXTM 15 ml Polypropylene conical tube</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>352097</td><td>-</td></tr><tr><td>BLUE MAXTM 50 ml Polypropylene conical tube</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>352098</td><td>-</td></tr><tr><td>5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35 &amp;micro;m Cell-Strainer Cap</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>352235</td><td>-</td></tr><tr><td>DPBS 1x CaCl&lt;sup&gt;2-&lt;/sup&gt; and MgCl&lt;sup&gt;2-&lt;/sup&gt;-free</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td>-</td></tr><tr><td>DMEM 1x + GlutaMAXTM</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>-</td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C5138</td><td>400 U/ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D5025</td><td>50 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>EDTA disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>E-5134</td><td>10 mM or 2.5 mM</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1810-500</td><td>-</td></tr><tr><td>HEPES buffer solution (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>25 mM</td></tr><tr><td>Trypan blue Stain (0,4%)</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Dilution 1:10&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>10 &amp;micro;g/ml final (1:50)</td></tr><tr><td>DAPI FluoroPure&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; grade</td><td>Life Technologies</td><td>D21490</td><td>1 &amp;micro;g/ml final</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 (30-F11 clone)</td><td>BD Biosciences</td><td>559864</td><td>&amp;nbsp;Dilution 1:200</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11b (M1/70 clone)</td><td>BD Biosciences</td><td>557657</td><td>&amp;nbsp;Dilution 1:400</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD8&amp;alpha; (5H10 clone)</td><td>Life Technologies</td><td>MCD0830</td><td>&amp;nbsp;Dilution 1:100</td></tr><tr><td>Female C57BL/6JRj mice (7-week-old)&amp;nbsp;</td><td>Janvier Laboratories</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

myeloid cell isolation from mouse skin and draining lymph node following intradermal immunization with live attenuated plasmodium sporozoites

Plasmodium sporozoit aşaması bir sivrisinek ağzın içinden bir memeli konakçının derisine inoküle edildiğinde sıtma enfeksiyonu başlar. son derece hareketli parazit sadece hepatositler istila ve eritrosit-enfektif forma dönüşme karaciğere ulaşır. Aynı zamanda deri içine ve tanınan ve ikamet ve / veya işe miyeloid hücreleri tarafından bozulmuş olabilir enjeksiyon yerinde, drene yakın lenf nodu geçirir. Intravital görüntüleme parlak floresan Lys-GFP pozitif cilt lökositler ve lenf düğümünde sporozoitlerle ve CD11c&#39;nin + hücreler arasındaki etkileşimlerin erken işe bildirdi. Biz burada, kurtarmak belirlemek ve fare cilde işe ve bir fare modelinde sporozoitlerine dozlarının immünizasyon intradermal enjeksiyonu takiben lenf nodu tüketiyor miyeloid hücre alt grupları numaralandırmak için verimli bir prosedür mevcut. Fenotipik karakterizasyonu kullanarak çok parametrik akış sitometri sağlargüvenilir bir tahlil Plasmodium enfeksiyona inflamatuar yanıt sırasında erken dinamik hücresel değişiklikler değerlendirmek.

Biz son zamanlarda P. immünizasyon dozlarda o iğne şırınga enjeksiyonu gösterdi fare derisi, deri ve dLn 19 iltihaplı monositler ve ardından polimorfonükleer nötrofillerin ardışık işe indükler bölgesindeki berghei sporozoitler. Protokol Yukarıdaki bölümde başarılı kulak dermisteki sporozoitler çok sayıda çoklu enjeksiyonlardan sonra, her iki doku canlı miyeloid hücreleri izole etmek için kullanılan prosedürü detayları tarif edi...

Watch this Scientific Journal Video about Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites at JoVE.com

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında Fare Deri ve akan lenf düğümü gelen Myeloid Hücre İzolasyonu<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoitler

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

myeloid-cell-isolation-from-mouse-skin-draining-lymph-node-following

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

17.2K Görüntüleme.  Institut Pasteur. We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Video: Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-enfekte Fare

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Hücre Kültürü

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and epidermis home a variety of immune cells in both homeostatic and inflammatory conditions. Tools to obtain skin cell release for cytofluorimetric analyses are, therefore, very useful in order to study the complex network of immune cells residing in the skin and their response to microbial stimuli. Here, we describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin to rapidly and efficiently obtain single-cell suspensions. This protocol allows maintenance of maximum cell viability without compromising surface antigen expression. We also describe how to take and digest skin samples from different anatomical locations, such as the ear, trunk, tail, and footpad. The obtained suspensions are then stained and analyzed by flow cytometry to discriminate between different leukocyte populations.

The skin is home to a complex immune cell network. We describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin, from different parts of the animal's body, in order to obtain a single-cell suspension and analyze the different leukocyte populations resident in the skin by flow cytometry.

Farklı Fare Cilt Bölgelerinden sitoflüorimetrik analize için tek hücre süspansiyonları hazırlanması

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

ile Enfeksiyon sırasında boşaltılması Lenf düğümleri içine Fare Cilt Dendritik Hücre Göç Eğitim Bir KAKE tabanlı Testi<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Basil Calmette-Guerin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

Vivo Tahlil antijen spesifik T-hücre Cytolytic işlevi bir aşı modeli kullanılarak tespiti için

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

In vivo Function of Differential Subsets of Cutaneous Dendritic Cells to Induce Th17 Immunity in Intradermal Candida albicans Infection

The skin is the outermost barrier organ in the body, which contains several types of dendritic cells (DCs), a group of professional antigen-presenting cells. When the skin encounters invading pathogens, different cutaneous DCs initiate a distinct T cell immune response to protect the body. Among the invading pathogens, fungal infection specifically drives a protective interleukin-17-producing Th17 immune response. A protocol was developed to efficiently differentiate Th17 cells by intradermal Candida albicans infection to investigate a subset of cutaneous DCs responsible for inducing Th17 immunity. Flow cytometry and gene expression analyses revealed a prominent induction of Th17 immune response in skin-draining lymph nodes and infected skin. Using diphtheria toxin-induced DC subset-depleting mouse strains, CD301b+ dermal DCs were found to be responsible for mounting optimal Th17 differentiation in this model. Thus, this protocol provides a valuable method to study in vivo function of differential subsets of cutaneous DCs to determine Th17 immunity against deep skin fungal infection.

In vivo Function of Differential Subsets of Cutaneous Dendritic Cells to Induce Th17 Immunity in Intradermal Candida albicans Infection

Here, we demonstrate the in vivo function of cutaneous dendritic cell subsets in Th17 immunity of deep dermal Candida albicans infection.

The skin is the outermost barrier organ in the body, which contains several types of dendritic cells (DCs), a group of professional antigen-presenting ...

Murin Dermal Lenfatik Kılcal Damarlardan Endotel Hücrelerinin İzole Edilmesi

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic endothelial cells is an important process for lymphatic research, as it allows the performance of in vitro and biochemical experiments on the isolated cells. Moreover, the development of Cre-lox technology has enabled the tissue-specific deficiency of genes that cannot be globally targeted, leading to the precise determination of their role in the studied tissues. The dissection of the role of certain genes in lymphatic physiology and pathophysiology requires the use of lymphatic-specific promoters, and thus, the experimental verification of the expression levels of the targeted genes.
Methods for efficient isolation of lymphatic endothelial cells from wild-type or transgenic mice enable the use of ex vivo and in vitro assays to study the mechanisms regulating the lymphatic functions and the identification of the expression levels of the studied proteins. We have developed, standardized and present a protocol for the efficient isolation of murine dermal lymphatic endothelial cells (DLECs) via magnetic bead purification based on LYVE-1 expression. The protocol outlined aims to equip researchers with a tool to further understand and elucidate important players of lymphatic endothelial cell functions, especially in facilities where fluorescence-activated cell sorting equipment is not available.

Yazar Spotlight: Murin Dermal Lenfatik Endotel Hücrelerinin Manyetik Boncuk Tabanlı İzolasyonu

This paper describes a method for magnetic bead-based isolation of murine endothelial cells from dermal lymphatic capillaries. The isolated lymphatic endothelial cells can be used for downstream in vitro experiments and protein expression analysis.

Murin Dermal Lenfatik Endotel Hücre İzolasyonu

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...

Canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında Fare Deri ve akan lenf düğümü gelen Myeloid Hücre İzolasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu

Farklı Fare Cilt Bölgelerinden sitoflüorimetrik analize için tek hücre süspansiyonları hazırlanması

Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

ile Enfeksiyon sırasında boşaltılması Lenf düğümleri içine Fare Cilt Dendritik Hücre Göç Eğitim Bir KAKE tabanlı Testi

Vivo Tahlil antijen spesifik T-hücre Cytolytic işlevi bir aşı modeli kullanılarak tespiti için

In vivo Function of Differential Subsets of Cutaneous Dendritic Cells to Induce Th17 Immunity in Intradermal Candida albicans Infection

Murin Dermal Lenfatik Endotel Hücre İzolasyonu

Murin Dermal Lenfatik Endotel Hücre İzolasyonu