Yazarlar yazının kendi incelenmek üzere Karsta Luettich ve Grégory VUILLAUME teşekkür etmek istiyorum.

<ol>
	<li>Rodgman, A., Perfetti, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The chemical components of tobacco and tobacco smoke. , (2013).</li><li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).</li><li>Zock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+high+content+screening+in+life+science+research+combinatorial+chemistry+&amp;+high+throughput+screening.">Applications of high content screening in life science research combinatorial chemistry &amp; high throughput screening.</a> Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 132 (9), 870-876 (2009).</li><li>US Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Harmful and potentially harmful constituents in tobacco products and tobacco smoke; established list, federal register. , 20034-20037 (2012).</li><li>Gonzalez-Suarez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+Biology+Approach+for+Evaluating+the+Biological+Impact+of+Environmental+Toxicants+in+Vitro.">Systems Biology Approach for Evaluating the Biological Impact of Environmental Toxicants in Vitro.</a> Chem. Res. Toxicol. 27 (3), 367-376 (2014).</li><li>Camilleri-Broet, S., Vanderwerff, H., Caldwell, E., Hockenbery, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+alterations+in+mitochondrial+mass+and+function+characterize+different+models+of+apoptosis.">Distinct alterations in mitochondrial mass and function characterize different models of apoptosis.</a> Exp. Cell. Res. 239 (2), 277-292 (1998).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c+and+dATP-dependent+formation+of+Apaf-1/caspase-9+complex+initiates+and+apoptotic+protease+cascade.">Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates and apoptotic protease cascade.</a> Cell. 91 (4), 479-489 (1997).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+strand+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139.">Double strand breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J. Biol. Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Westwick, J. K., Weitzel, C., Minden, A., Karin, M., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+&#945;+stimulates+AP-1+activity+through+prolonged+activation+of+the+c-jun+kinase.">Tumor necrosis factor &#945; stimulates AP-1 activity through prolonged activation of the c-jun kinase.</a> J. Biol. Chem. 269 (42), 26396-26401 (1994).</li><li>Bindokas, V. P., Jord&#225;n, J., Lee, C. C., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+production+in+rat+hippocampal+neurons:+selective+imaging+with+hydroethidine.">Superoxide production in rat hippocampal neurons: selective imaging with hydroethidine.</a> J. Neurosci. 16 (4), 1324-1336 (1996).</li><li>Barhoumi, R., Bailey, R. H., Burghardt, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+glutathione+in+anchored+cells+with+monochlorobimane.">Kinetic analysis of glutathione in anchored cells with monochlorobimane.</a> J. Cytometry. 19 (3), 226-234 (1994).</li><li>Huang, T. C., Lee, J. F., Chen, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pardaxin+an+antimicrobial+peptide,+triggers+caspase-dependent+and+ROS-mediated+apoptosis+in+HT-1080+Cells.">Pardaxin an antimicrobial peptide, triggers caspase-dependent and ROS-mediated apoptosis in HT-1080 Cells.</a> Mar. Drugs. 9 (10), 1995-2009 (2011).</li><li>Bao, S., Knoell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+modulates+cytokine-induced+lung+epithelial+cell+barrier+permeability.">Zinc modulates cytokine-induced lung epithelial cell barrier permeability.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291 (6), L1132-L1141 (2006).</li><li>Xia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound+Cytotoxicity+Profiling+Using+Quantitative+High-Throughput+Screening.">Compound Cytotoxicity Profiling Using Quantitative High-Throughput Screening.</a> Environ Health Perspect. 116 (3), 284-291 (2008).</li></ol>

Tüm yazarlar Philip Morris International&#39;ın çalışanlarıdır. Philip Morris International, bu projenin finansman ve sponsor tek kaynağıdır.

Hayvan deneyleri alternatifler için ve yeni yüksek kapasiteli test yaklaşımları için ihtiyaçları yaygın olarak son yıllarda ele alınmıştır. Bu yakından hedef dokuların fizyolojisini taklit hücresel deneyleri kullanılarak standart toksisite testleri için alternatif yöntemler, araştırmak için bilim adamları ve düzenleyici otoriteleri yol açmıştır. Bu çalışmada, insan akciğer epitel hücreleri üzerinde tek CS bileşenlere maruz kalma etkisini değerlendirmek için bir içeriği yüksek tarama (HCS) platformu ile gerçek zamanlı hücre analizörü (RTCA) birleştirerek uygulanabilirliğini göstermiştir. Bu kurulum benzer diğer çeşitli havada bulunan kirleticilerin, havadaki partiküllerin ve nanopartiküller tarafından uyarılan sitotoksisite değerlendirmek için uygulanabilir. Ayrıca, elde edilen sonuçlar nedensel biyolojik ağlarına dayalı tam genom transkriptomik ve hesaplama yöntemleri gelenler ile uyumlu olabilir. Önceden bildirildiği gibi, bu yaklaşım moleküler yolu verileri doğrulamak için bize izinHCS bitiş noktaları ile CS maruz 5 üzerine pertürbasyon, ayrıca fenotipik bu yolu tedirginlikler ele. Bir akış deneyi olarak, gerçek zamanlı hücre analiz dozu ve maruz kalma süresi noktası aşağı analiz 14 için uygun olabilir daha iyi karar verme sağlayan bir doz ve zamana bağımlı çözünürlük, hücre canlılığı ile ilgili bilgi sağlar. analizörü ilkesi bir altın mikroelektrot ile kaplı bir kültür de yüzeyde takmak ve yayılma olarak hücreler tarafından üretilen elektrik empedans değişikliklere dayanır. Empedans sonuçta morfolojisi ve hücre canlılığı, yayma, hücre yapışmasını izlemek için kullanılabilir hücre dizini adlı bir boyutsuz parametre, dönüştürülür. Bu teknik sitotoksik mekanizmaları hakkında bilgi sağlamaz rağmen, duyarlılığı bile HCS bilgilendirici olmadığı çok düşük dozlarda morfolojik hücresel değişimlerin tespit edilmesini sağlar (veriler gösterilmemiştir). Kümelenme Strateji dayalılı deneyler, biz RTCA metodoloji HCS bitiş noktaları ile karşılaştırıldığında daha düşük dozlarda morfolojik değişiklikleri tespit etmek mümkün olduğunu kaydetti. Gerçek zamanlı hücre analizörü ile ilk gösteriminin ardından, bir HCS platformu her HPHC tarafından ortaya sitotoksisite tür daha derinlemesine bilgi elde etmek için kullanıldı. hücre bölmeleri üzerindeki potansiyel etkileri doğru HPHCs profil izin HCS tahlil paneli / organelleri yanı sıra genotoksisite veya oksidatif stres yol açanlara tanımlamak için. Analiz seçilen HPHCs NHBE hücrelerinde sitotoksisite neden bu sayede farklı profiller ortaya çıkardı. Genel olarak, tüm bileşikler, fenol hariç test edilen en yüksek dozda nekroza neden olduğu bulunmuştur. potansiyel genotoksisite için bir marker olarak H2AX kanser gelişimi 1-aminonaphtalene indüklediği fosforilasyon rolü ise mitokondriyal toksisite okuma bu HPHC de ortaya çıkarılan aktivite HCS paneli (kütle artarak sitokrom C Relea tutarlıse) ve oksidatif stres (GSH azalması). Daha önce de tarif edildiği gibi, fenol mitokondriyal işlev bozukluğu indükler ve DNA hasarı gibi GSH tüketilmesine neden olarak tespit edilmiştir. Krom (VI), grup I kanserojen olarak sınıflandırılmıştır bileşiklerden biri ve Crotonaldehyde de hem özellikle krom (VI) aynı zamanda kaynaklı apoptosis (kaspaz çağlayanı etkinleştirme) ve krotonaldehit ROS üretimini artış neden olarak genotoksik tespit edilmiştir. Son olarak arsenik (V), stres kinaz yolu aktivasyonunun bir belirtecidir cJun fosforilasyonu uyardığı bulunmuştur. Bu çalışmada, in vitro olarak akciğer epitel hücreleri için bir model olarak NHBE hücreleri kullanılmıştır. Bir HCS ortamda bu hücreleri kullanılarak görülmemiş ve genotoksisite ve oksidatif stres belirteçleri de dahil olmak üzere uç noktalar, daha geniş bir yelpazede soruşturma sağladı. canlı hücre ve sabit hücre boyama yaklaşımları Hem genel teknik esneklik göstererek bizim protokoller dahilinde tarif edildi. fişlem, aynı protokoller bir flüoresan boya veya antikor kullanılarak saptanabilir hedefleri daha geniş bir yelpazesi için uygulanabilir. Canlı boyama protokollerin başarıyla uygulanması için, boyalar, bazı sınırlı yarılanma ömrü ve görüntü alma tamamlanmadan önce azalabilir floresan sinyali olarak, inkübasyon süresi saygı önemlidir. Farklı bir hücre tipi kullanılırsa, tüm boyama koşullarının uygun boya konsantrasyonu, yeniden değerlendirilmeli ve inkübasyon süresi farklı olabileceğini dikkate almak da önemlidir. Geçerli yazıda sadece beş bileşikler HCS metodolojisi ile tarandı bir senaryo tarif var. daha önce tarif edilen plaka düzeni göz önüne alındığında, bu şekilde daha fazla bileşik ya da eş zamanlı olarak taranması için sağlayan 24 levha (6 deneyleri, 2 zaman noktalarında) levha .bir sayısı da artırılabilir toplam 2 farklı levhayı dozlandı yatırımcılarınDaha fazla uç noktaları sunda. Bunu yapmadan önce, ancak, bir belirli uç noktalar (GSH ve ROS) derhal satın gerektiren dikkate almalı ve bunun sonucu olarak, plakaların dozaj önceki plaka satın izin vermek için kademeli bir şekilde yapılmalıdır. Plakalar daha sonraki bir aşamada boyama işleminin tamamlanması için, tespit sonrasında herhangi bir aşamada iletişim kuralı bölerek istiflenebilir Diğer taraftan, sabit bir hücre boyama protokolü kullanılarak bir avantajı temsil eder. Bu yaklaşım, örneğin veri kalitesinden ödün vermeden tüm canlı hücre boyama plakaları tamamlamak için zaman operatör sağlayacaktır. ayrıca plakaların sayısını azaltarak iş akışını optimize etmek için, aynı zamanda birlikte daha uç noktaları multipleks mümkün olacaktır. Bu bağlamda DNA Hasarı ve Stres Örneğin Kinaz farklı c yayan fluorochromes sadece iki ikincil antikor kullanılarak birbirine araştırılması olabilirhannels. Sürekli tam otomatik Hücre Serpilmesi bileşik seyreltme, dozajlama ve boyama dahil HCS platformun geliştirilmesi, hem de yeni uç noktaları ilavesi, epitelyal ilgili HPHCs ve diğer hücre tipleri için güçlü bir profil aracı olarak HCS platformun kapasitesini artıracaktır .

Toksikolojik risk değerlendirmesi tarihsel yaşam bilimlerindeki temel olsa da, aynı zamanda insanlar ve yüksek maliyet tutarsız çevirilebilirlik olarak eksiklikleri ile bağlantılıdır, hayvan modellerinin kullanımı dayanmıştır. Ayrıca, &quot;3R&quot; 2 (değiştirme, azaltma ve arıtma) ruhu hayvan testlerine alternatifler bulmak için giderek artan bir çaba olmuştur. Bu çaba, son birkaç yıl içinde ivme kazanmıştır çünkü sadece özellikle Avrupa Birliği&#39;nde bu tür yüksek verimlilik teknikleri ve aynı zamanda, çünkü hayvanlar üzerinde test kullanımını kısıtlayan mevzuat sistem biyolojisi yaklaşımları olarak son gelişmeler, evi. Toksik hakaretlere tepki düzenleyen hücresel sinyal yollarının karmaşıklığı tek toksikolojik son noktalar kullanılarak bazı bileşiklerin toksikolojik temelini açıklamak için yeterli olmayacaktır o belli yapar. Bunun için, etkileşen p yüzlerce etkileşimibiyolojik ağa katkıda roteinler de dikkate alınması gerekir. Bu ağlarda Toksik maddelerin etkisini araştırmak için, fenotipik orta ve yüksek verimli tarama deneyleri ile kombine bir sistem toksikoloji yaklaşımı güçlerini anlaması ve aynı zamanda bireysel toksik maddelerin etki mekanizması hakkında daha fazla bilgi sağlamak için yararlıdır. Bu çalışmada elde süreç ve spesifik flüoresan bazlı hücresel analizlerden elde edilen görüntü verilerini analiz otomatik bir mikroskop ve bir biyolojik yazılım uygulaması oluşan güçlü bir tarama aracı, yanı HCS kullanılabilir. Bu, tek bir hücre ya da hücre-altı seviyede, sayısal olarak bir hücre içinde görsel değişiklikler sağlar ve birçok parametre eş zamanlı olarak analiz edilmesi. 3, örneğin, DNA, iki iplikçikli kırılmalar histon H2AX fosforilasyon bir antikor bazlı kimlik kullanılarak değerlendirildi ve reaktif oksijen türleri (ROS), bir hücre-Perm kullanılarak ölçüldüEable süperoksit duyarlı boya. Akciğer epitel hücreleri sigara dumanı olmak üzere solunan toksik maddelerin, karşı ilk biyolojik bariyer temsil çünkü, biz Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi tarafından yayınlanan HPHCs etkisini profil bir in vitro model olarak primer bronş epitel hücreleri kullanılmaktadır. 4 Bu el yazması bir takip olduğunu biz HPHCs farklı bir alt kümesi biyolojik etkilerini değerlendirdi olan önceki bir çalışmada 5 üzerinde -up. In vitro sitotoksisite değerlendirmek için bizim iş akışının bir parçası olarak, başlangıçta bize sonraki HCS için uygun doz aralıkları, kurmalarına izin (RTCA) sistemi, bir empedans tabanlı gerçek zamanlı hücre analiz kullanılarak, 15 HPHC en bir seçim potenslerine değerlendirdi analiz (Şekil 1). Daha sonra hücresel toksisite dokuz çok parametrik son noktalar kullanılarak gerçekleştirilmiştir bir toksikolojik HCS değerlendirme, her iki zaman noktalarında (4 ve 24 saat) izlenir. Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi, 7 aktivitesi, sitokrom C salınımı ve hücre membran geçirgenliği - kullanılan belirteçler mitokondriyal toksisite, DNA hasarı, stres kinaz, reaktif oksijen türlerinin (ROS), glutatyon (GSH) içeriği, kaspaz 3&#39;ün göstermekteydi. Bizim yaklaşım etkin kimlik ve doza ve zamana bağımlı örnekleme yoluyla sigara duman bileşenlerinin etkisi karakterizasyonu. Sonuç olarak, bu durum, her HPHC için bir in vitro toksikolojik profil üretilmektedir. Çok omik yaklaşımlar da daha HCS analizi tamamlamak için kullanılabilir. Bu nihayet hücre haberleşmesi ve / veya transkripsiyon seviyesinde etkileri daha derin bir anlayış sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td>Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader</td><td>Thermo</td><td>N01-0002B</td><td></td></tr><tr><td>xCelligence RTCA MP</td><td>ACEA</td><td>05331625001</td><td></td></tr><tr><td>Screener (HCS)</td><td>Genedata</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CASY counter TTC</td><td>Roche</td><td>05 651 719 001</td><td></td></tr><tr><td>e-Plates VIEW 96</td><td>ACEA</td><td>06 472 451 001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Frame 96</td><td>ACEA</td><td>05232392001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Cardio Temperature Tool</td><td>ACEA</td><td>2801171</td><td></td></tr><tr><td>Plate sealer breathseal</td><td>Greiner bio-one</td><td>676051</td><td></td></tr><tr><td>Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-2540</td><td>non-smoking 60-year-old Caucasian male donor&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BEGM BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Warm at 37 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>ReagentPack Subculture Reagents kit</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td>Warm at 37 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (100x)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Easy Flask filter cap 75&amp;nbsp;cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-349</td><td></td></tr><tr><td>96 well assay plate&amp;nbsp; black&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-62249</td><td></td></tr><tr><td>Draq5 (For Far Red Nuclear Staining)</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7513</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: Dihydroethidium</td><td>Sigma</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: CellROX</td><td>Life technologies</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: MitoSOX</td><td>Life technologies</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>GSH Dye: Monochlorobimane</td><td>Sigma</td><td>69899</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>GSH Dye: Monobromobimane</td><td>Life technologies</td><td>M-1378</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Membrane permeability Dye: YO-PRO-1&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>Y3603</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Membrane permeability Dye: TO-PRO-1&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T3602</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Membrane permeability Dye: TOTO-1&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T3600</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green</td><td>Life technologies</td><td>C10423</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Cytochrome C antibody (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA5-11823</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA5-15889</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA1-2022</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG DyLight 650&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab96878</td><td></td></tr><tr><td>10x permeabilization buffer</td><td>Fisher</td><td>8408400</td><td></td></tr><tr><td>4% Formaldehyde solution</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>10x blocking buffer</td><td>Fisher</td><td>8408500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt solution</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Sigma</td><td>S4400</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma</td><td>V0627</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Paraquat</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Anisomycin</td><td>Sigma</td><td>A9789</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Ethacrynic acid</td><td>Sigma</td><td>E4754</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>1-Aminonaphthalene</td><td>Sigma</td><td>34390</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>2-Nitropropane</td><td>Sigma</td><td>130265</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Acetamide</td><td>Sigma</td><td>695122</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma</td><td>A9099</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Arsenic (V)</td><td>Sigma</td><td>A6756</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Benzene</td><td>Sigma</td><td>12540</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Chromium (VI)</td><td>Sigma</td><td>216623</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Crotonaldehyde</td><td>Sigma</td><td>262668</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Methyl ethyl ketone</td><td>Sigma</td><td>34861</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Nickel&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>203866</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Nitrobenzene</td><td>Sigma</td><td>48547</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma</td><td>P5566</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Quinoline</td><td>Sigma</td><td>241571</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sigma</td><td>34866</td><td>Toxic</td></tr></tbody></table>

high content screening analysis to evaluate the toxicological effects of harmful and potentially harmful constituents (hphc)

Sigara dumanı (CS), kardiyovasküler ve akciğer hastalıkları için önemli bir risk faktörüdür. CS onun genel toksisite bireysel bileşenlerin katkıları değerlendirmek için zorlu 1 7.000 &#39;den fazla kimyasal madde içeren karmaşık bir aerosol olduğu için. ABD Gıda ve İlaç tarafından tanımlanan tek tek bileşenlerin yanı sıra karışımların toksikolojik profilleri, ancak verimlilikte bir tütün dumanının zararlı ve Potansiyel Zararlı Bileşenlerinin (HPHCs) ve profil oluşturma özelliği sağlar tarama araçları, yüksek uygulayarak, in vitro kurulabilir İdaresi (FDA). 2 Bir ilk değerlendirmenin, bir empedans tabanlı enstrüman bileşiğin toksisite gerçek zamanlı, etiket ücretsiz değerlendirme için kullanıldı. alet okuması hep birlikte hücre durumuna genel bir bakış sağlamak hücre yapışması, canlılığı ve morfolojisi dayanır. Hücre indeksi adında bir boyutsuz parametre, ölçümü için kullanılır. dif kümesiferent boyama protokolleri bir floresan görüntüleme bazlı soruşturma için geliştirilmiştir ve bir HCS platformu her HPHC tarafından ortaya sitotoksisite tür daha derinlemesine bilgi elde etmek için kullanıldı. Onlar hesaplanabilir LD 50 (&lt;20 mM) kayıtlı olarak test edilen 15 bileşenlerin, sadece beş HCS tabanlı analiz için seçilmiştir. Bu 1-aminonaphtalene, Arsenik (V), Krom (VI), Crotonaldehyde ve Fenol dahil. HCS&#39;de etkilerini esas alarak, 1-aminonaphtalene ve Fenol artan histon H2AX fosforilasyonuna dayanan genotoksik krom (VI) ile birlikte, mitokondriyal disfonksiyon indüklemek için tespit edilebilir ve. Krotonaldehit stres kinaz yolu aktivatörü gibi bir oksidatif stres indükleyici ve arsenik olarak tespit edilmiştir. Bu çalışma, empedansı bazlı ve HCS teknolojilerinin bir kombinasyonu CS bileşenlerin in vitro değerlendirilmesi için sağlam bir araç sağlar göstermektedir.

Rtca Hiçbir toksik etki tespit edildiğinde HCS bitiş noktaları bilgilendirici olmayacaktır, çünkü görünmüyor bileşiklerdir HCS (Şekil 3b, c, d, g, k, l, m tarafından test edilmez RCTA en yüksek konsantrasyon hücre canlılığı kadar azaldı p). Bileşikler gösteren sadece en yüksek konsantrasyonda hücre canlılığı azalmıştır (Şekil 3e, o) da HCS için seçimi kaldırılır. Son olarak, bir hesaplanabilir LD 50 (&lt;20 mm) tek bileşeni daha HCS analizi (Şekil 3a, f, h, j, n) seçilir. yukarıda bahsi geçen HPHCs şunlardır: 1-aminonaphtalene, Arsenik (V), krom (VI) &#39;ya, krotonaldehit&#39;in ve fenol yer alır. HCS Kalite Kontrolü (QC) gibi, pozitif kontrol fi vardırilk doğru gerçekleştirildiğini boyama işlemini sağlamak için analiz edilmiştir. Pozitif kontrol ile muamele edilmiş hücrelerin Örnek Resimlerde Şekil 6 &#39;da gösterilmiştir. Veriler değerleri, daha önce tarif edildiği gibi araca normalleştirilir. Doz-yanıt eğrileri, sadece üç doz test edilir olarak çizilir ve üç doz, her bir zaman noktasında kabul edilir değildir. uygun yanıtlar 4 saat, 24 saat, her iki her nokta için gözlenir, böylece pozitif kontrol dozlar seçilir (önceki deneylere dayanarak, veriler gösterilmemiştir). Özellikle dozlarda 1 ve 2 doz 2 ve 3 24 saat sonra etkisini değerlendirmek için kullanılır ise 4 saat sonra etkisini değerlendirmek için kullanılır. cevap yok pozitif kontrol dozları gözlenmesi halinde Tabaklar atılır. mitokondrial membran potansiyeli ve GSH içeriği dışındaki tüm uç noktalar için, sinyal yoğunluğunda bir artış beklendiğini unutmayın. Fenol hariç tüm bileşikler, bir nekrotik fenoksi neden<html> türü, artan hücre membran geçirgenliği (Şekil 7a, f, h, i) göre. 1-aminonaphtalene, krom (VI), krotonaldehid ve Fenol artan histon H2AX fosforilasyonu (Şekil 7E, j, n, p) göre genotoksik olarak tespit edilmiştir. Fenol ve 1-aminonaphtalene ciddi mitokondriyal disfonksiyon 1-aminonaphtalene ile artan bir sitokrom C salınımı (Şekil 7c) yol açtı (Şekil 7b, o) neden olduğu bulunmuştur. artan kaspaz 3/7 aktivitesinin tespiti krom maruz kaldığında apoptotik olayın kanıt sağladı. Oksidatif stres indüksiyonlu (TSH veya GSH) ayrıca 1-aminonaphtalene, krotonaldehit&#39;in ve fenol (Şekil 7d, m, q,) ile muamele edilerek tespit edildi. Transkripsiyon faktörü cJun (Şekil 7G) artmış fosforilasyon ile gösterildiği gibi son olarak, arsenik, hücre gerilimi indükler. yük / 53987 / 53987fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. Bileşik Tox-Profiler İş Akışı a.) Iş akışının şematik Bu çalışmada izledi. İlk olarak, bir doz oranı bulma sonra HCS bileşiği özgü toksisite profillerinin b.) Çalışma deneysel tasarım karakterize etmek için uygun dozlar seçmek için RTCA platformu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. HCS uç noktalar 4 incelenmiş ve 24 saat dozlama sonra. Grubunda ise, 24 saat tohumlama sonrası, hücreler ilave edildi ve empedans değerleri sürekli takip eden 24 saat boyunca izlenen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig2.jpg" /> Şekil 2. RTCA Pozlama Plate. Bileşik ana plakası ilk beş adım 1:10 seri seyreltme yapılarak üretilir. Her bir bileşik,(Doz 0) araç kontrolü dahil olmak üzere, daha sonra kontrol olarak orta ve staurosporin ile birlikte maruz plakasına üç kopya halinde ilave edilir. Araç kontrolleri sıra numarası 7. iken dizisi transferi üzerine korunur dozlar, en yüksek doz sıra numarası 1 unutmayın <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53987/53987fig3.jpg" /> Şekil 3. Örnek RTCA Hücre Canlılığı Sonuçlar a.) 1-aminonaphtalene, b) 2-nitropropan, Cı) asetamid, d) Aseton, e) akrilamid, f) Arsenik (V), g), benzen, lH) Krom (VI) j) krotonaldehid, k) metil etil keton, L) Nickel (II) &#39;, m) nitrobenzen, n) fenol, o) kinolin, s) Toluen. 24 saat sonra-dozlama, eğri (AUC) altındaki alan, 0 ila 0 aktivitesini yansıtır -100% aktivitesi (y-ekseni), aralığında ve normalize (pozitif kontrol ve araç da dahil olmak üzere), her doz için hesaplanmış araç ve pozitif kontrol -100. Değerler daha sonra çizilen ve dört parametreli bir Hill denklemine ve mümkün olduğu LD50 hesaplandı kullanılarak monte edildi. Konsantrasyonları bir günlük ölçeğinde (x-ekseni) ifade edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53987/53987fig4.jpg" /> Şekil 4&#39;te HCS Tahliller için pozitif kontrol bileşikleri için seyreltme cetveli. Pozitif kontroller) Toplama ve ziyaretindeseri seyreltme plakası. b) pozitif kontroller seri seyreltme. c) 200X pozitif kontroller dozlar. de) orta (01:40 içinde 200x pozitif kontrol dozlarda seyreltilmesi) için hicle 5x dozları içeren pozitif kontrol plaka üretmek için. ) Her doz maruziyet plakada son düzenini yansıtmak için üç kez seyreltilmiş unutmayın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53987/53987fig5.jpg" /> Şekil 5. HCS Pozlama Plate. Bileşik ana plakası ilk beş adımlı bir seyreltme yapılarak üretilir. araç kontrol de dahil olmak üzere her bir bileşik olup, (doz 0) daha sonra pozitif kontroller ile birlikte maruz plakasına üç kopya halinde ilave edilir. , Dozlar sipariş transferi üzerine muhafaza unutmayınAraç kontrolleri sıra numarası 7. iken yüksek doz sıra numarası 1 olan <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig5large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/53987/53987fig6.jpg" /> Antikor ya da boya-boyalı hücrelerin Şekil 6. Örnek Floresan Resimler: a) Nükleer parametreler - Nükleer boya. Canlı veya sabit hücrelerde DNA bağlanan bir geçirgen bir boya. Bu leke çekirdek bölge etiketleme tek tek hücrelerin tanımlamak için kullanılır b) Nekroz - Hücre membran geçirgenliği boya. Hücre membran bütünlüğünün Boya bazlı tespiti. Reaktif hücre membranına özünde geçirimsizdir. nekroz Membran, geçirgen hale gelir ve boya hücre girer ve güçlü bir floresan s üretiminde DNA&#39;ya bağlanan. ignal c) apoptozun - Sitokrom C: sitokrom C salınımı erken apoptoz iyi bilinen bir ayar damgası antikor bazlı tespiti. Apoptoz indüksiyonu üzerine, sitokrom C mitokondri salınır ve çekirdeği D) DNA hasarına difüze - pH2AX.:. Histon H2AX fosforilasyon antikor bazlı tespiti, çift sarmal DNA kırılmalarının iyi bilinen bir özelliğidir, e) Gerilme Kinaz - cJun. Ser-73, cJun bölgesinin hücre stres iyi bilinen bir ayar damgası de fosforilasyonu antikor bazlı algılama f) Oksidatif stres - DHE: süperoksit radikallerinin Boya bazlı tespiti. . Ücretsiz GSH moleküllerinin Boya bazlı algılama: mBcl - okside formu etidyum DNA ardalanması g üzerine kırmızı fluoresces ise Dihydroethidium kendisi GSH) sitoplazmada mavi fluoresces. mBcl için GSH ile reaksiyona giren. kaspaz 3/7 aktivitesinin Boya bazlı algılama: Kaspaz 3/7 aktivasyon - yüksek floresan ürünü h) Apoptoz üretir. Reaktif DNA bağlama inhibe eden bir dört amino asit peptidi olmayan floresan. kaspaz-3/7 aktivasyonu üzerine, peptid DNA&#39;ya bağlanan ve aydınlık, florojenik tepkisi üretmek için boya sağlayan bölünmektedir. Paneller pozitif kontrol ile tedavi edilen hücreler gösterir BH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/53987/53987fig7.jpg" /> Şekil 7. Temsilcisi HCS Sonuçları. 1-aminonaphtalene (ae), Arsenik (V) (f ve g), Krom (VI) (HK), Crotonaldehyde (ln) ve Fenol (oq). 4 saat (mavi çizgi) ve24 saat (turuncu çizgi) sinyaller her bir doz için hesaplanmış ve araç aktivitesi (% 0) normalize edilmiştir. eğri uydurma hesaplamaları dahil değildir Değerler gri renkle gösterilir. Konsantrasyonları bir günlük ölçeğinde (x-ekseni) ifade edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> tahlil </td><td> Endpoint # </td><td> biyolojik son nokta </td><td> Hücresel bölmesi </td><td> çıkış özelliği </td></tr><tr><td rowspan="4"> sitotoksisite </td><td> 1 </td><td> Mitokondriyal kütle 6 </td><td> sitoplazma </td><td> Nokta ortalama alan </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Mitokondrial membran potansiyeli 6 </td><td> sitoplazma </td><td> Nokta ortalama yoğunluk </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Sitokrom C bırakma <sup&gt; 7 </td><td> çekirdek </td><td> Ortalama yoğunluk </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Hücre zarı geçirgenliği 8 </td><td> çekirdek </td><td> Ortalama yoğunluk </td></tr><tr><td> DNA Hasarı </td><td> 5 </td><td> fosfo-H2AX 9 </td><td> çekirdek </td><td> Ortalama yoğunluk </td></tr><tr><td> stres Kinaz </td><td> 6 </td><td> fosfo-cJun 10 </td><td> çekirdek </td><td> Ortalama yoğunluk </td></tr><tr><td> ROS </td><td> 7 </td><td> ROS 11 </td><td> çekirdek </td><td> Ortalama yoğunluk </td></tr><tr><td> GSH içeriği </td><td> 8 </td><td> GSH 12 </td><td> sitoplazma </td><td> Nokta ortalama yoğunluk </td></tr><tr><td> apoptoz </td><td> 9 </td><td> Kaspaz 3 13 </td><td> sitoplazma </td><td> Nokta ortalama yoğunluk </td></tr></tbody></table> HCS a Tablo 1. listesissays ve bitiş noktaları. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"></td><td rowspan="2"> araç </td><td colspan="6" rowspan="2"> RTCA dozlar (uM) </td><td rowspan="2"> LD 50 </td><td colspan="5"> HCS dozları </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td colspan="4"> Hücre canlılığı, seçilen (uM) </td><td> 3R4F (nM) </td></tr><tr><td colspan="2"> 1-Aminonaphtalene </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 280 uM </td><td> 2.000 </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 150 </td><td> 0.27 </td></tr><tr><td colspan="2"> 2-nitro- </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> acetamide </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> aseton </td><td> Su </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> akrilamid </td><td> Su </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Arsenik (V) </td><td> Su </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 160 uM </td><td> 200 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 25 </td> &lt;td&gt; 0.17 </td></tr><tr><td colspan="2"> Benzen </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Krom (VI) </td><td> Su </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 20 uM </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> 10 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td colspan="2"> krotonaldehit </td><td> Su </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 200 uM </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2.000 </td></tr><tr><td colspan="2"> Metil etil keton </td><td> Su </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt;20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Nikel </td><td> Su </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> nitrobenzen </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Fenol </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> 2.300 uM </td><td> 5000 </td><td> 2.000 </td><td> 1000 </td><td> 500 </td><td> 240 </td></tr><tr><td colspan="2"> kinolin </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td&gt; <td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> tolüen </td><td> Su </td><td> 20.000 </td><td> 2.000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0.2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 2. Tedavi 24 saat sonra Bağıl LD 50 ile test edilmiştir HPHC Bileşiklerin listesi. HCS analizi için seçilen bileşikler turuncu vurgulanır ve test dozları da verilmiştir. 3R4F doz referans sigara 3R4F itibaren bir sopa duman oluşturucu miktarına eşdeğerdir. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> tahlil </td><td> bileşik </td><td> Ana çözelti </td><td> çözücü </td&gt; <td colspan="3"> Doz (ler) (uM) </td></tr><tr><td> Hücre canlılığı </td><td> staurosporin </td><td> 10 mM </td><td> DMSO </td><td colspan="3"> 50 </td></tr><tr><td> sitotoksisite </td><td> Valinomycin </td><td> 10 mM </td><td> DMSO </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> DNA Hasarı </td><td> parakuat </td><td> 100 mM </td><td> DMSO </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> stres Kinaz </td><td> Anisomycin </td><td> 2 mM </td><td> DMSO </td><td> 10 </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ROS </td><td> rotenone </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> GSH içeriği </td><td> etakrinik asit </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> apoptoz </td><td> staurosporin </td><td> 40 mM </td><td> DMSO </td><td> 200 &lt;/ Td&gt; <td> 50 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table> Her Testi için kullanılır Olumlu Kontroller ve Konsantrasyonlarına Tablo 3. listesi.

Watch this Scientific Journal Video about High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC at JoVE.com

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.

Zararlı ve Potansiyel Zararlı Bileşenlerinin Toksikolojik etkilerinin değerlendirilmesi için yüksek İçerik Tarama Analizi (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

high-content-screening-analysis-to-evaluate-toxicological-effects

Research

JoVE Journal

Biology

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

12.1K Görüntüleme.  Philip Morris International R&D. The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds. 

Video: High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

Kimyasal Güvenlik Tarama ve Sistem Biyolojisi Veri Üretimi Gelişim Toksisite Tahliller Tabanlı İnsan Pluripotent Kök Hücre

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Gelişim Biyolojisi

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been hindered partly due to a lack of standardized methods and availability of robust, user-friendly technology. In this study, commercially available, division-arrested cell lines were employed to quantitatively screen for endocrine activity of chemicals present in water samples of interest to environmental quality professionals. A single, standardized protocol that included comprehensive quality assurance/quality control (QA/QC) checks was developed for Estrogen and Glucocorticoid Receptor activity (ER and GR, respectively) using a cell-based Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) assay. Samples of treated municipal wastewater effluent and surface water from freshwater systems in California (USA), were extracted using solid phase extraction and analyzed for endocrine activity using the standardized protocol. Background and dose-response for endpoint-specific reference chemicals met QA/QC guidelines deemed necessary for reliable measurement. The bioassay screening response for surface water samples was largely not detectable. In contrast, effluent samples from secondary treatment plants had the highest measurable activity, with estimated bioassay equivalent concentrations (BEQs) up to 392 ng dexamethasone/L for GR and 17 ng 17&#946;-estradiol/L for ER. The bioassay response for a tertiary effluent sample was lower than that measured for secondary effluents, indicating a lower residual of endocrine active chemicals after advanced treatment. This protocol showed that in vitro transactivation bioassays that utilize commercially available, division-arrested cell &#34;kits&#34;, can be adapted to screen for endocrine activity in water.

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested ("freeze and thaw") in vitro transactivation bioassays.

Su Kullanımı Endokrin Aktivitesi Tarama Piyasada satılan<em&gt; İn Vitro</em&gt; Transaktivasyon biyolojik tayinler

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

Çevre

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the local to federal levels. The continuing evolution of PFAS chemistries presents a challenge to the environmental monitoring, where ongoing development of targeted methods necessarily lags the discovery of new chemical compounds. There is a need, therefore, to have forward-looking methodologies that can detect emerging and unexpected compounds, monitor these species over time, and resolve details of their chemical structure to enable future work in human health. To this end, non-targeted analysis by high-resolution mass spectrometry offers a broad base detection approach that can be combined with almost any sample preparation scheme and provides significant capabilities for compound identification after detection. Herein, we describe a solid-phase extraction (SPE) based sample concentration method tuned for shorter chain and more hydrophilic PFAS chemistries, such as per fluorinated ether acids and sulfonates, and describe analysis of samples prepared in this fashion in both targeted and non-targeted modes. Targeted methods provide superior quantification when reference standards are available but are intrinsically limited to expected compounds when performing analysis. In contrast, a non-targeted approach can identify the presence of unexpected compounds and provide some information about their chemical structure. Information about chemical features can be used to correlate compounds across sample locations and track abundance and occurrence over time.

Here, we present a protocol for the sequential targeted quantification and non-targeted analysis of fluorinated compounds in water by mass spectrometry. This methodology provides quantitative levels of known fluorochemical compounds and identifies unknown chemicals in related samples with semi-quantitative estimates of their abundance.

Ücret belirlenmesi- ve Polyfluorinated kimyasal türler ile kombine hedef ve hedef tarama olmayan yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi iş akışı

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Multisegment enjeksiyon-kılcal Elektroforez kütle spektrometresi kullanılarak yüksek üretilen iş ve kapsamlı uyuşturucu gözetim

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Kimya

A High-Throughput Screening Approach for Evaluating the Binding Affinity of Environmental Pollutants to Nuclear Receptors

Increasing levels of compounds have been detected in the environment, causing widespread pollution and posing risks to human health. However, despite their high environmental occurrence, there is very limited information regarding their toxicological effects. It is urgent to develop high-throughput screening (HTS) methods to guide toxicological studies. In this study, a receptor-ligand binding assay using an HTS system was developed to determine the binding potency of environmental pollutants on nuclear receptors. The test is conducted using a microplate reader (i.e., a 96-well plate containing various chemicals) by measuring the fluorescence polarization (FP) of a specific fluorescent probe. This assay consists of four parts: the construction and transformation of recombinant vectors, the expression and purification of the receptor protein (ligand-binding domain), receptor-probe binding, and competitive binding of chemicals with the receptor. The binding potency of two environmental pollutants, perfluorooctanesulfonic acid (PFOS) and triphenyl phosphate (TPHP), with peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR&#947;) was determined to illustrate the assay procedure. Finally, the advantages and disadvantages of this method and its potential applications were also discussed.

This protocol describes a high-throughput screening system that uses fluorescence polarization of a specific fluorescent probe binding to a nuclear receptor as a readout for screening environmental pollutants.

Increasing levels of compounds have been detected in the environment, causing widespread pollution and posing risks to human health. However, despite ...

High-Content Screening Assay for the Identification of Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Modifying Compounds

Immunotherapy with antigen-specific antibodies or immune checkpoint inhibitors has revolutionized the therapy of breast cancer. Breast cancer cells expressing the epidermal growth factor receptor HER2 can be targeted by the anti-HER-2 antibody trastuzumab. Antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) is an important mechanism implicated in the antitumor action of HER-2. Trastuzumab bound to cancer cells can be recognized by the Fc receptors of ADCC effector cells (e.g., natural killer (NK) cells, macrophages, and granulocytes), triggering the cytotoxic activity of these immune cells leading to cancer cell death. We set out to develop an image-based assay for the quantification of ADCC to identify novel ADCC modulator compounds by high-content screening. In the assay, HER2 overexpressing JIMT-1 breast cancer cells are co-cultured with NK-92 cells in the presence of trastuzumab, and target cell death is quantified by automated microscopy and quantitative image analysis. Target cells are distinguished from effector cells based on their EGFP fluorescence. We show how compound libraries can be tested in the assay to identify ADCC modulator drugs. For this purpose, a compound library test plate was set up using randomly selected fine chemicals off the lab shelf. Three microtubule destabilizing compounds (colchicine, vincristine, podophyllotoxin) expected to interfere with NK cell migration and degranulation were also included in the test library. The test screen identified all three positive control compounds as hits proving the suitability of the method to identify ADCC-modifying drugs in a chemical library. With this assay, compound library screens can be performed to identify ADCC-enhancing compounds that could be used as adjuvant therapeutic agents for the treatment of patients receiving anticancer immunotherapies. In addition, the method can also be used to identify any undesirable ADCC-inhibiting side effects of therapeutic drugs taken by cancer patients for different indications.

This protocol presents an automated, image-based high-throughput technique to identify compounds modulating natural killer cell-mediated breast cancer cell killing in the presence of a therapeutic anti-HER-2 antibody.

Antikor Bağımlı Hücresel Sitotoksisiteyi Modifiye Eden Bileşiklerin Tanımlanması için Yüksek İçerikli Tarama Testi

Immunotherapy with antigen-specific antibodies or immune checkpoint inhibitors has revolutionized the therapy of breast cancer. Breast cancer cells ...

Kanser Araştırmaları

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Sitotoksik değerlendirilmesi ve insan hassas kesim akciğer dilimleri maddelerin etkileri Immunomodulatory

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

MOF ile İndüklenen Hücre Davranış Değişikliklerinin Elektrik Hücre-Substrat Algılama ile Değerlendirilmesi

Electric Cell-Substrate Sensing for Real-Time Evaluation of Metal-Organic Framework Toxicological Profiles

Metal-organic frameworks (MOFs) are hybrids formed through the coordination of metal ions and organic linkers in organic solvents. The implementation of MOFs in biomedical and industrial applications has led to concerns regarding their safety. Herein, the profile of a selected MOF, a zeolitic imidazole framework, was evaluated upon exposure to human lung epithelial cells. The platform for evaluation was a real-time technique (i.e., electric cell-substrate impedance sensing [ECIS]). This study identifies and discusses some of the deleterious effects of the selected MOF on the exposed cells. Furthermore, this study demonstrates the benefits of using the real-time method versus other biochemical assays for comprehensive cell evaluations. The study concludes that observed changes in cell behavior could hint at possible toxicity induced upon exposure&#160;to MOFs of different physicochemical characteristics and the dosage of those frameworks being used. By understanding changes in cell behavior, one foresees the ability to improve safe-by-design strategies of MOFs to be used for biomedical applications by specifically tailoring their physicochemical characteristics.

Yazar Spotlight: İnsan Akciğer Epitel Hücrelerinin Metal-Organik Çerçevelere Tepkisini Değerlendirmedeki Gelişmeler 

The following study evaluates the toxicological profile of a selected metal-organic framework utilizing electric cell-substrate impedance sensing (ECIS), a real-time, high-throughput screening technique.

Metal-Organik Çerçeve Toksikolojik Profillerinin Gerçek Zamanlı Değerlendirilmesi için Elektrik Hücresi-Substrat Algılama

Metal-organic frameworks (MOFs) are hybrids formed through the coordination of metal ions and organic linkers in organic solvents. The implementation of ...

Zararlı ve Potansiyel Zararlı Bileşenlerinin Toksikolojik etkilerinin değerlendirilmesi için yüksek İçerik Tarama Analizi (HPHC)

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

PLAYLIST