We are grateful to Dr. Sachiko Sato and Julie-Christine L&#233;vesque at the Bioimaging Platform of the Centre de recherche du CHU de Qu&#233;bec for their technical assistance. Grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) RGPIN-2014-05308, The Banting Research Foundation, and The Scottish Rite Charitable Foundation of Canada to M.E.T supported this work.
H.E.H. is recipient of a scholarship from the Lebanese Ministry of Education and Higher Education, and K.B. from the Facult&#233; de m&#233;decine of Universit&#233; Laval.

Not: Université Laval Hayvan Bakım Komitesi tarafından yönetilen gibi tüm deneyler onaylanmış ve Hayvan Bakımı yönergelere Kanada Konseyi ile uyumlu, Kurumsal hayvan etik komitenin kurallarına altında yapıldı. yaş 4 ile 21 ay arasında, APP-PS1 erkek fareler kullanılmıştır. yiyecek ve suya serbest erişim ile 25 ° C - Bu hayvanlar, 22, 12 saat ışık-karanlık çevrimi altında muhafaza edilmiştir. 1. Metoksi-x04 Çözeltisinin Hazırlanması <ol><li> % 10 dimetil sülfoksit (DMSO),% 45 propilen glikol ve% 45 sodyum fosfat tamponlu tuzlu su (100 mM fosfat tampon maddesi içinde% 0.9 NaCl ihtiva eden bir çözelti içine metoksi-x04 çözülmesiyle metoksi-x04 9 bir 5 mg / mL çözelti , pH 7.4). <ol><li> bir mikro kullanarak, metoksi-x04 bileşikten 5 mg ağırlığında. davlumbaz altında DMSO içinde metoksi-x04 çözülür ve berrak yeşil bir çözelti elde edilene kadar karıştırılır. Arda propilen glikol ve ph ekleyinHer bir ek ile birlikte karıştırılarak bir solüsyon üzerine durdurulmuştur osphate. </li><li> çevirici O / N 4 ° C&#39;da, çözelti karıştırılır. sarımsı yeşil emülsiyon elde. Çözelti bir bozulma olmadan en fazla iki ay boyunca 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol></li></ol> 2. Metoksi-x04 Çözelti Enjeksiyon <ol><li> önceden perfüzyon 24 saat, fareler tartılır ve 27 ½ G iğne kullanılarak vücut ağırlığı için 10 mg / kg&#39;lık bir dozda, her bir fare metoksi-x04 intraperitoneal verir. </li></ol> Enjekte edilen farelerin 3. transcardial perfüzyon <ol><li> Perfüzyon bir gün önce, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS),% 3.5 akrolein ve% 4 paraformaldehid (PFA) Çözeltilerin 13 uygun hacimleri hazırlamak ve 4 ° CO / N saklayın. Not: Bu çözeltiler perfüzyon ve her iki immünohistokimya önceden yerleştirilmesi için kullanılacaktır. akrolein çalışırken hem aşındırıcı ve toksik olduğu gibi özel dikkatAraştırmacılar ve çevre. akrolein plastik aşındırıcı Ek olarak, her zaman akrolein çözeltilerin hazırlanması için uygun bir cam kullanın. </li><li> perfüzyon gününde, 25 um partikül tutma kaba filtre kağıdı kullanılarak, PFA ve akrolein filtre. </li><li> perfüzyon sırasında 25 ml / dakika bir akış hızında, 15 ml PBS, akrolein 75 mi, ve sırasıyla fare dolaşıma PFA 150 ml sunmak için bir peristaltik pompa gibi çalışır. Dikkatli kullanın. PFA ve akrolein zararlı dumanlar önlemek için bir davlumbaz içine kesinlikle perfüzyon gerçekleştirin. <ol><li> Pompayı kurmak PBS çözeltisi içine bir ucunu, PBS (yaklaşık 15 ml tutarak) boru doldurun ve diğer ucunu bir 25 G kanatlı kan toplama iğne düzeltmek için. Her zaman, tüp sıkışmış hava kabarcıkları serbest olduğundan emin olun. </li><li> PBS ile doldurulmuş boru ile perfüzyon pompası ayarlandıktan sonra akrolein şişesi doğrudan tüp yerleştirin. </li></ol></li><li> birintraperitonal 27 ½ G iğne ile, sodyum pentobarbital vücut ağırlığı doz 90 mg / kg olan bir seferde bir fare aesthetize. Kuyruk / ayak tutam yanıtları değerlendirin. Fare gibi caydırıcı, ağrılı uyaranlara tepkisiz olması durumunda devam edin. </li><li> çalışma yüzeyine forepaws ve pençelerin bantla tarafından (yukarı yüz sırt üstü yatarken) yatar pozisyonda fare sabitleyin ve dikkatle diğer organlara zarar vermeden kalp maruz. diyaframı delen sonra hızlı çalışması için emin olun. <ol><li> göğüs kafesi ile kaudal başlayan göğüs orta hat boyunca cerrahi makas ile deri yoluyla bir kesi gerçekleştirmek ve klavikula rostral geçin. </li><li> ventral göğüs kafesi tabanı boyunca iki ek yanal kesiler olun. Yavaşça hareket ve tüm göğüs boşluğu maruz emin olun, cildin iki flep pin. </li><li> göğüs boşluğu maruz künt forseps ile kılıç şeklinde sürecini tutun ve sivri makas sakinleştirmeyes. , Diyafram ve göğüs kafesi kesti akciğerleri delinmesiyle önlemek için dikkatli olmak ve clavicles için kesi rostral devam ediyor. diyaframı delen sonra hızlı çalışması için emin olun. </li></ol></li><li> Yavaşça künt forseps ile perikard kesesi gözyaşı. Künt forseps ile sabit kalbi tutun sağ atrium kesti ve PBS infüzyon başlar. Hemen sol ventrikül içine kan toplama iğne takın. </li><li> Daha sonra, (150 ml karşılık gelen) 6 dakika boyunca PFA geçiş (75 mi tekabül eden) 3 dakika boyunca akrolein, ardından PBS ile fare (hortumda) serpmek. tüp girmesini kabarcıklarını engellemek için çözüm geçmeden önce, pompa akışını duraklatmak emin olun. </li><li> Fare başını kesmek ve tespit edilmiş olan beyin özü ve 4 ° C&#39;de en az 2 saat boyunca% 4 PFA ihtiva eden bir cam şişeye doğrudan yerleştirin. <ol><li> beyin ayıklamak için, kafatası maruz deri yoluyla kesmek için makas ve cımbız kullanın. Dikkatle kafatası op kırmakgözlerinin arasındaki en, ve bunun küçük parçalar halinde kapalı çip yatan beyin ortaya çıkarmak. </li><li> Dikkatle vibratome kesit için devam etmeden önce ek 2 saat süreyle% 4 PFA ile maruz beyin ve yazı Fix çıkarın. </li></ol></li></ol> Bir vibratome kullanarak 4. Beyin Kesit <ol><li> soğutulmuş PBS ile sabit beynini 3 kere yıkayın. Keskin bir jilet kullanarak, (bu bölge soruşturma altında olmadığı sürece) koku Ampulü çıkarmak ve 2 içine enine beyin kesti - prosedürünü hızlandırmak amacıyla eş zamanlı olarak kesitli olabilir bütün bunlar yaklaşık olarak eşit yükseklikte 3 adet. </li><li> dikey tepsiye güvenli numune plakası üzerine beyin dokusu parçaları Tutkal. Düzgün kesme yüzeyi numune plakasına sıkıca yapışır ve kesit işlemi sırasında yerinden almaz emin olun. tüm beyin yüzeyi tamamen batık dek tepsinin içine yeterli PBS çözüm ekleyin. Inci tutmak önemlidirE beyin parçaları ve sonraki bölümlerde tam bu aşamada boyunca PBS dalmış. </li><li> , Vibratome tepsiyi yerleştirin 0.5 mm / sn, 90 Hz kesit frekans ve 50 um kalınlığında kesitler elde etmek amacıyla 50 um besleme kalınlığına kesit hızını ayarlar. Sonra ince bir fırça kullanılarak, dondurarak saklama çözeltisi (% 40 PBS,% 30 etilen glikol ve% 30 gliserol) ihtiva eden 20 ml&#39;lik bir cam şişe içine bölümleri aktarın. sonraki kullanıma kadar -20 ° C &#39;de şişeleri saklayın. aşağıdaki adımlarda tarif edildiği gibi alternatif olarak, yakın taranması için PBS bölümleri tutun. </li></ol> Metoksi-x04-lekeli Plaketlerinin Varlığının 5. Bölüm Taraması <ol><li> Stereotaksik fare beyninin yardımı örneği için ilgili bölgeyi ihtiva eden 14 seçeneğini beyin bölümleri, bu örnekte kullanılan hipokampüs CA1 Atlas. Yeterince, dondurarak saklama çözeltisi ihtiva eden 24 oyuklu bir kültür plakasına olan bir kuyuya her bir bölümü yerleştirinböylece kurumasını bölümleri önlemek için. </li><li> , Bölümleri kuruma aşağıdaki prosedürü kullanarak önlemek için, arka arkaya her bir bölümü inceleyin: <ol><li> tek kullanımlık bir pipet ile bir mikroskop lamı PBS bir damlacık ekleyin ve damlacık bölümü yerleştirin. </li><li> metoksi-x04 etiketli Aβ plaklar içeren bölgelerinin belirlenmesi için bir floresan mikroskobu altında bölümü inceleyiniz. Not: metoksi-x04 kolayca flüoresans ultraviyole (UV) filtre (eksitasyon 340-380 nm) kullanılarak görüntülenebilir. </li></ol></li><li> yapısal bölgeye doğrudan plakların varlığını ilişkilendirmek için her görüntü her iki alanda da aynı bölgeyi göstermek gerekir, çünkü mikroskop sahne hareket ettirmeden parlak alanda ilgi alanları (ROI) bölgelerinin görüntülerin yanı sıra floresan modunda Yakalama doku kesiti. </li><li> Kaydet ve hayvan sayısına göre çekilen görüntüleri adlandırın. Ayrıca plaka iyi numarası ve resim alanını ta kayıtken. Örneğin, Örn: 9978A1B; Hayvan sayısı: 9978; Peki sayısı: A1; Alan: Parlak. Görüntüleme tamamlandıktan sonra geri onun iyi belirlenmiş bölümüne yerleştirin. Not: Sonunda, incelenen her bir bölüm için, iki resim, parlak alanda bir ve UV alanında başka elde edilir. </li><li> kuyu sayısına göre Görüntü J aynı ROI iki görüntü (parlak alanında tek ve UV alanında diğer) açın ve MosaicJ eklentisi kullanarak, iki görüntü kenarlarını hizalayın ve hizalanmış ve kombine görüntüyü kaydetmek o geldi. </li><li> Özellikle hayvan sayısı ile ayrı bir klasörde resmi kaydedin. belirlemek ve doku bölümünde plaklar lokalize ve iki farklı alanda (parlak ve UV) bütün bölümün tam bir görünümü var görüntüleri birleştirin. </li><li> Tarama işlemi tamamlandıktan sonra immün ya da daha fazla işlemci, CA kadar, kriyoprotektan ihtiva eden bir 24-çukurlu kültür plakasına -20 ° C&#39;de incelendi bölümleri depolamakdışarı rried. </li></ol> 6. IBA1 için immün Ön gömme Not: oda sıcaklığında yavaş hareket eden rocker plaka koyarak seçilmiş serbestçe yüzen bölümlerde IBA1 için immün gerçekleştirin. <ol><li> İyice yaklaşık 1 ml PBS, 10 dakika boyunca sürekli olarak, her bir yıkama ile bölümleri 3 kez yıkayın. </li><li> 10 dakika boyunca PBS çözeltisi içinde% 0.3 hidrojen peroksit ile endojen peroksidazlar söndürün. Bu adım, bir arka plan boyama önlemek için önemlidir spesifik olmayan peroksidaz aktivitesi, önler. </li><li> 10 dakika her biri için PBS içinde 3 kez doku yıkayın. </li><li> 30 dakika boyunca PBS çözeltisi içinde% 0.1 sodyum borohidrid bölümleri inkübe edin. Bu adım, sabitleme adımından kalan aldehitleri azaltmak için çok önemlidir, ve akrolein doku fiksasyon kullanıldığında özellikle önemlidir. </li><li> 10 dakika her zaman için PBS 3 kez doku yıkayın ve tüm kabarcıklarını çıkarmak için emin olun. </li><li> 1 saat bölümleri engelleyin.Farklı antikorlar farklı engelleme süreleri ve çözümler gerekebilir. (PH 7.4 TBS) IBA1 için,% 10 cenin sığır serumu,% 3 sığır serum albümini ve% 0.01 Triton X-100, 50 mM Tris-tamponlu tuzlu su içinde ihtiva eden bloklama tamponu hazırlayın. Not: bloke etme adımı, birincil antikorun özel olmayan bağlanmasını önlemek içindir. Triton X-100 ve düşük konsantrasyonda daha iyi bir boyama için membran az geçirgenliği sağlar ve EM altındaki dokuların en ultrastrüktürel özellikleri korumak için yeterince düşüktür. </li><li> 4 ° CO / N olarak: dokusundan Bloklama tamponunu çıkarın ve birincil antikor çözeltisi içinde inkübe (bloke tamponu içinde [1000 1] seyreltilmiş tavşan anti-IBA1). </li><li> 10 dakika her zaman için TBS içinde 3 kere yıkayın. </li><li> 90 dakika 0.05 M TBS: ikincil antikor (biyotin konjuge edilmiş keçi anti-tavşan) [200 1] inkübe edin. </li><li> 5 dakika her zaman için TBS içinde 5 kez yıkayın. </li><li> TBS içinde avidin-biotin kompleksi çözeltisi (: [100 1], Biyotin, avidine [100: 1]) inkübe1 saat süre ile çözelti. </li><li> 5 dakika her zaman için TBS içinde 5 kez yıkayın. </li><li> % 0.05 diaminobenzidin (DAB) ve 8 dakika için TBS içinde% 0.015 hidrojen peroksit ile IBA1 boyama Ortaya. Not: DAB gelişme zamanlama protokolü protokolü değişebilir ve hızlı bir şekilde ışık mikroskobu altında lekeli bölümleri incelenerek tespit edilmelidir. Not: IBA1, bir (temsilci örneğin Şekil 2) açıkça 20X de IBA1 lekeli mikroglia hücre gövdeleri ve süreçleri görselleştirmek mümkün olmalıdır. bilinen bir kanserojen olarak, DAB kullanılarak dikkatli olun. </li><li> (Yukarıda anlatıldığı gibi) dikkatli bir şekilde, bu aşama sırasında bölümler izleyerek aşırı geliştirilmesi kaçının. 5 dakika, her seferinde soğutulmuş PB 5 kez bölümleri yıkayarak reaksiyonu durdurun. </li></ol> Elektron Mikroskopi 7. İşleme <ol><li> bir cam şişede PBS içinde% 1 ozmiyum tetroksit çözeltisi hazırlayın. Osmiyum tetroksit ışığa olduğu; g kapağıAlüminyum folyo ile lass şişe ışıktan çözelti korumak için. çok tehlikeli kimyasal olarak, osmiyum tetroksit kullanılarak dikkatli olun. Bu ve bir davlumbaz içine aşağıdaki adımları uygulayın. </li><li> bölümler PBS çıkarın ve düz ince bir fırça kullanarak onları yayıldı. kurumasını bölümleri tutmak için bir defada bu adımı bir kuyu gerçekleştirin. derhal bölümlerde herhangi kıvrımlar kalıcı hale gelecektir olarak, osmiyum tetroksit ekleme ve sadece bölümleri kıracak doku sonrası osmiyum tespit düzleştirmek için denemeden önce bölümleri düzleştirmek için emin olun. </li><li> katlama bölümleri önlemek için, bir transfer pipeti ile bir seferde ozmiyum tetroksit bir damla ekleme, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ozmiyum tetroksit bölümleri bırakın. ışıktan bölümleri korumak için alüminyum folyo ile kuyu örtün. Not: Bu adım bölümlerinde lipidler giderir. Doku osmiyum sonrası tespit sonrasında çok koyu görünür. </li><li> Bölümler ozmiyum tetro içinde ikenXide, 20 g komponent A karıştırılarak bir tek beher içinde plastik reçine hazırlanması 20 gr bileşen B, 0.6 g bileşen C, ve 0.4 gr bileşen D üzerinde sırayla bileşenlerin birlikte birleştirin ve de 10 mi serolojik bir pipet kullanarak karıştırın kadar homojen bir renk elde edilir. </li><li> alüminyum tartı yemekleri hazırlanan karışımı aktarın. onlar susuz edildikten sonra onlar doku kesitlerinde alacaksınız. </li><li> % 35,% 35,% 50,% 70,% 80,% 90,% 100,% 100,% 100: aşağıdaki sırayla 2 dakika süreyle etanol artan konsantrasyonlarda bölümleri kurutmak. </li><li> 2 dakika her zaman için 3 kez, kalan etanol kaldırmak propilen oksit bölümleri batırmak için. 20 ml&#39;lik bir cam şişe içine 24 oyuklu bir kültür plakasına gelen susuz kesitleri çıkarın. Her zaman plastik erir propilen oksit ile çalışırken cam şişeleri kullanın ve tehlikeli olduğu gibi, dikkatli korumak. </li><li> propilen oksit soluti bölümler aktarmak için bir bombeli cam pipet veya ince bir fırça kullanınreçine içine ve üzerine oda sıcaklığında infiltrasyon için O / N bırakın. propilen oksit ile reçine sulandırmak için dikkatli olun. </li><li> poli-kloro-tri-floro-etilen (PCTFE) filmsheets üzerine reçine ile bölümü yerleştirme: <ol><li> PCTFE filmsheets ilgili bölümler gömme önce 15 dakika - 10 60 ° C fırında - 50 içine örnekleri içeren alüminyum tartı yemekleri yerleştirin. </li><li> bölümleri gömerken, bir alüminyum bir defada çanak tartı ile çalışır. ince bir fırça kullanılarak, tek bir PCTFE film tabakasının üzerine reçinenin ince bir tabaka boya. </li><li> PCTFE film tabakasının çanak ağırlığında alüminyumdan bir defada dokusunun bir bölümünü hareket ettirin. onu rahatsız etmemek için dikkatli olmak, doku etrafında aşırı reçine çıkarmak. </li><li> PCTFE film tabakasının çanak ağırlığında birinden tüm bölümleri taşıdıktan sonra, doku sandviç yaratarak, birinci üzerinden ikinci PCTFE yaprak yerleştirin ve 2 yaprak arasında reçine. </li></ol></li><li> 5 ° C&#39;de 3 gün boyunca bir kuluçka makinesi içinde reçine polimerize5-60 ° C. </li><li> malzeme artık ultra ince kesit ve ultrastrüktürel inceleme, genellikle EM çekirdek tesisleri tarafından gerçekleştirilen özel teknikler için hazırdır. ultrastrüktürel bozulma olmadan oda sıcaklığında güvenle PCTFE ince levhalar arasındaki örnekleri saklamak. Not: Kesit çok ince ve transmisyon elektron mikroskobu incelemesi için sonraki adımlar ayrı bir protokole 13 açıklanmıştır. </li></ol>

<ol>
	<li>Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+in+Alzheimer's+disease.">Neuroinflammation in Alzheimer's disease.</a> The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).</li><li>Herrup, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+case+for+rejecting+the+amyloid+cascade+hypothesis.">The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis.</a> Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).</li><li>Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+attack:+the+role+of+inflammation+in+Alzheimer+disease.">Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).</li><li>Klunk, W. E., Bacskai, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Abeta+plaques+in+living+transgenic+mice+with+multiphoton+microscopy+and+methoxy-X04,+a+systemically+administered+Congo+red+derivative.">Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).</li><li>Liebscher, S., Meyer-Luehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peephole+into+the+brain:+Neuropathological+features+of+Alzheimer's+disease+revealed+by+in+vivo+two-photon+imaging.">A peephole into the brain: Neuropathological features of Alzheimer's disease revealed by in vivo two-photon imaging.</a> Front Psychiatry. 3, 26 (2012).</li><li>Fuhrmann, M., Bittner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Cx3cr1+knockout+prevents+neuron+loss+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).</li><li>Borchelt, D. R., Ratovitski, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+amyloid+deposition+in+the+brains+of+transgenic+mice+coexpressing+mutant+presenilin+1+and+amyloid+precursor+proteins.">Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins.</a> Neuron. 19 (4), 939-945 (1997).</li><li>Ly, P. T. T., Cai, F., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+neuritic+plaques+in+Alzheimer's+disease+mouse+model.">Detection of neuritic plaques in Alzheimer's disease mouse model.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li><li>Sadowski, M., Pankiewicz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+prion+amyloid+deposits+in+vivo.">Targeting prion amyloid deposits in vivo.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).</li><li>Bussi&#232;re, T., Bard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+characterization+of+Thioflavin-S-positive+amyloid+plaques+in+transgenic+Alzheimer+mice+and+effect+of+passive+Abeta+immunotherapy+on+their+clearance.">Morphological characterization of Thioflavin-S-positive amyloid plaques in transgenic Alzheimer mice and effect of passive Abeta immunotherapy on their clearance.</a> Am. J. Pathol. 165 (3), 987-995 (2004).</li><li>Rajamohamedsait, H. B., Sigurdsson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+staining+of+amyloid+and+pre-amyloid+peptides+and+proteins+in+mouse+tissue.">Histological staining of amyloid and pre-amyloid peptides and proteins in mouse tissue.</a> Methods Mol. Biol. 849, 411-424 (2012).</li><li>Afkhami, A., Moosavi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorptive+removal+of+Congo+red,+a+carcinogenic+textile+dye,+from+aqueous+solutions+by+maghemite+nanoparticles.">Adsorptive removal of Congo red, a carcinogenic textile dye, from aqueous solutions by maghemite nanoparticles.</a> J. Hazard. Mater. (1-3), 398-403 (2010).</li><li>Tremblay, M. -. E., Riad, M., Majewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mouse+brain+tissue+for+immunoelectron+microscopy.">Preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li><li>Konsman, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates.">The mouse brain in stereotaxic coordinates.</a> Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).</li><li>Norden, D. M., Muccigrosso, M. M., Godbout, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+priming+and+enhanced+reactivity+to+secondary+insult+in+aging,+and+traumatic+CNS+injury,+and+neurodegenerative+disease.">Microglial priming and enhanced reactivity to secondary insult in aging, and traumatic CNS injury, and neurodegenerative disease.</a> Neuropharmacology. 96 ((Pt A)), 29-41 (2014).</li><li>Tremblay, M. -. E., Stevens, B., Sierra, A., Wake, H., Bessis, A., Nimmerjahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microglia+in+the+healthy+brain.">The role of microglia in the healthy brain.</a> J. Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).</li><li>&#352;i&#353;kov&#225;, Z., Tremblay, M. &. #. 2. 3. 2. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+synapse:+Interactions+in+health+and+neurodegeneration.">Microglia and synapse: Interactions in health and neurodegeneration.</a> Neural Plast. 2013, 425845 (2013).</li><li>DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+correlates+of+cognition+in+dementia:+quantification+and+assessment+of+synapse+change.">Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change.</a> Neurodegeneration. 5 (4), 417-421 (1996).</li><li>Terry, R. D., Masliah, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+basis+of+cognitive+alterations+in+Alzheimer's+disease:+Synapse+loss+is+the+major+correlate+of+cognitive+impairment.">Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer's disease: Synapse loss is the major correlate of cognitive impairment.</a> Ann. Neurol. 30 (4), 572-580 (1991).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu protokol EM ile yoğun çekirdek Aβ plaklar hedefleyen bir bağlaşık bir yaklaşım açıklar. In vivo enjeksiyon metoksi-x04 Örneğin, hipokampus CA1, tabakalar radiatum ve lacunosum-moleculare Aβ belirli bölgeler içinde plaket ve ilgi katmanları ihtiva beyin bölümlerinin hızlı seçilmesini sağlar. Bu örnekte, metoksi-x04 Ön görüntüleme mikroglial fenotipleri yoğun ana Aβ plaklar mevcudiyetinde ultra-yapı seviyesinde sinaps etkileşime kadar farklı çalışma IBA1 için immün öncesi ...

Amiloid Aβ plak oluşumu, Alzheimer hastalığı (AD), ana nöropatolojik özelliğidir. Ancak artan kanıtlar hastalığın ilerlemesi 1,2 bağışıklık sisteminin önemli roller önerir. Özellikle, klinik öncesi ve klinik çalışmalardan elde edilen yeni veriler AD patolojiye ana sürücü ve katılımcı olarak bağışıklık disfonksiyonu kurdu. Bu bulgularla, santral ve periferik bağışıklık hücreleri AD 3 olarak umut verici terapötik hedefler ortaya çıkmıştır. Aşağıdaki protokol Aβ plak birikimi ve AD mikroglial fenotipik değişiklikler arasındaki ilişki yeni bir bakış açısı oluşturmak için ışık ve elektron mikroskobu (EM) birleştirir. Bu protokol, floresan boya metoksi-x04 in vivo enjeksiyonu kullanılan AD fare modellerinde Aβ plakların etiketleme sağlar. Metoksi-x04 kolayca beyin dokusundan girmek için kan-beyin bariyerini ve yüksek a ile β-kıvrımlı yaprak bağlanabilen bir Kongo Kırmızı türeviffinity. Boya flüoresan olduğu için, iki foton mikroskopi 4 Aβ Leke birikmesinin, in vivo tespiti için de kullanılabilir. Bir kez Aβ bağlı metoksi-x04 ayırmak veya plaklar uzak yeniden dağıtma ve flüoresanını fazla muhafaza etmez. Genellikle beyin dinamiği 5 non-invaziv görüntüleme için izin periferik uygulanır. Floresan da karşılıklı otopsi Aβ plaklar 6 civarında nöron ölümünün araştırılması dahil olmak üzere, analiz için izin, aldehit tespit sonucu kalır. Aβ gösteren 7 (APP genindeki Lys670Asn / Met671Leu bir çift mutasyonunu coexpressing ve insan presenilin PS1-A264E varyantı APP-PS1) Bu protokol, APPswe / PS1A 246E farelerinin beyin bölümleri seçmek metoksi-x04 özelliklerinin avantajını özel ilgi bölgelerinde (hipokampus CA1, tabakalar radiatum ve lacunosum-moleculare plaklar) Mikroglial hücre gövdeleri ve EM ile süreçlerini görselleştirmek için) mikroglial işaretleyici iyonize kalsiyum-bağlayıcı adaptörü molekülü 1 (IBA1 karşı immün gömme öncesi önce. fareler transcardial perfüzyon yoluyla 24 saat önce beyin fiksasyon metoksi-x04 çözümü intraperitoneal verilir. Koronal beyin kesitleri bir vibratome kullanılarak elde edilir. hipokampus CA1 içeren bölümler tabakalar radiatum ve lacunosum-moleculare bölgesindeki Aβ plaklarının varlığı için bir flüoresan mikroskobu altında elenir. IBA1 için immün ozmiyum tetroksit sonrası sabitleme ve plastik reçine gömme seçilen beyin kesitleri üzerinde gerçekleştirilir. Bu protokolün sonunda bölümler ultra ince kesit ve ultrastrüktürel inceleme için hazır, daha fazla ultrastrüktürel bozulma olmadan arşivlenebilir. Önemlisi, plaklar hala mevcut protokolde olduğu gibi, örneğin IBA1 için, farklı antikorlarla immün sonra floresan edilir. Onlar koyu t halinehan osmiyum tetroksit sonrası fiksasyon takiben çevreleyen neuropil, bağımsız doğru, birkaç milimetre karelik genellikle aşağı, ilgi alanları belirlemeye yardımcı olur metoksi-x04 boyaması, transmisyon elektron mikroskobu ile incelenmesi gereken. Bu karşılıklı yaklaşım ultrastrüktürel düzeyde incelemek için spesifik beyin bölümlerini tanımlamak için etkili bir yol sunar. sadece doku bölümlerinin sadece küçük bir kısmını da mevcut birkaç Aβ plaklar içerebilir spesifik beyin bölgelerinde veya tabakaların içinde erken AD patolojisinden okuyan bu özellikle yararlıdır. Özellikle bu zamanlarda, sadece doğru yerde Aβ plaklar içeren küçük bir bölümünü elde etmek için çeşitli beyin kesitlerinde (örneğin IBA1 gibi diğer hücresel belirteçleri ve çift etiketleme) Aβ için immün kullanmak verimsiz olacaktır. metoksi-x04 canlı farelerin ek olarak, enjeksiyon feda ve doku işleme Compromis does not öncesindeultrastrüktürel korunması e. Böyle sabit doku kesitlerinde Kongo Kırmızısı, Thioflavin S, Thioflavin T veya metoksi-x04 ile postmortem boyanması gibi alternatif yöntemler etanol boyama farklılaşma, ozmotik strese neden olur ve ultrastrüktür bozan 8-11 gerektirir. Kongo Kırmızı da bilinen insan kanserojen 12&#39;dir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1006">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Methoxy-X04</td>
			<td style="width:197px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">4920</td>
			<td style="width:167px;">10 mg substrate per tablet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propylene glycol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W294004&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-1</td>
			<td>Caution: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Hydrochloride</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP153500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrolein&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>110221</td>
			<td>Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde Granular</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19210</td>
			<td>Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-790-14F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peristaltic Pump with Tubing</td>
			<td>ColeParmer</td>
			<td>cp.78023-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Excel Winged blood Collection Set Needles 25G&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extrafine Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11152-10</td>
			<td>Tip shape: curved</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>Tip shape: straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hartman Hemostats</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>13003-10</td>
			<td>Tip shape: curved</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14004-16</td>
			<td>Tip shape: straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>ROBOZ surgical store</td>
			<td>5818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>74515-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibrating Blade Michrotome Leica VT1000 S</td>
			<td>Leica Biosystems&#160;</td>
			<td>14047235612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome blades</td>
			<td>Electron microscopy Sciences</td>
			<td>71990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well Tissue Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylene Glycol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide, 30%</td>
			<td>J.T.BAKER</td>
			<td>cat: 2186-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>480886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP153-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin (BSA), fraction V</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C001H24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti IBA1, Rabbit&#160;</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>019-19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111066046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard)</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3.3&#39;-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5905-50TAB</td>
			<td>Caution: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Osmium tetroxide, 4% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19150</td>
			<td>Caution: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44611</td>
			<td>Resin Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44612</td>
			<td>Hardener Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44613</td>
			<td>Plasticizer Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component D</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44614</td>
			<td>Accelerator Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>LesAlcoolsdeComerce</td>
			<td>151-01-15N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propylene oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>110205</td>
			<td>Caution: corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminum weigh dishes</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70048-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACLAR&#174;&#8211;Fluoropolymer Films</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oven/Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative light and electron microscopy to study microglial interactions with &#946;-amyloid plaques

Ayrıntılı bir protokolünü Alzheimer hastalığı fare modellerinde beyin kesitlerinde amiloid Aβ plaklar tespit etmek için ön-işlemden geçirilmesi gömme immün ve doku işleme (özellikle iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 1 (IBA1), mikroglia tarafından ifade edilen bir kalsiyum bağlama proteini) elektron mikroskobu (EM). Metoksi-x04 yoğun çekirdekli Aβ plaklarda bulunan p-kıvrımh bir yaprak bağlanan seçici, kan-beyin bariyerini geçer ve bir flüoresan boya olan. metoksi-x04 hayvanların enjeksiyon öncesinde kurban ve beyin sabitleme öncesi tarama ve zaman alıcı manipülasyonlar ile daha fazla işlem için plaka ihtiva eden beyin bölümlerinin seçimi olanak sağlar. bölümlerin sadece küçük bir fraksiyonu mevcut çok az plaklar içerebilir spesifik beyin bölgelerinde veya tabakaların içinde erken AD patolojisinden okuyan bu özellikle yararlıdır. Kongo Kırmızısı, Tioflavin S ve Thiofl doku bölümleri ölüm sonrası işlemleravin T (hatta metoksi-x04) ile β-pilili yaprak etiket, ancak aşırı boya kaldırmak için etanol ile kapsamlı takas gerektirir ve bu işlemlerin ultrastrüktürel korunması ile uyumsuz olabilir. Aynı zamanda sadece doğru yerde Aβ plaklar içeren küçük bir bölümünü elde etmek için, Aβ (ve IBA1 gibi diğer hücresel belirteçleri) ilgi bölgelerinden tüm beyin kesitlerinde için etiketleme yapmak verimsiz olacaktır. Önemlisi, Aβ plaklar elektron mikroskobu ile incelenmesi alanlarında kesin kimlik (genellikle birkaç milimetre karelik kadar) sağlayan, EM için doku işlendikten sonra hala görebilir.

Bu bölüm, protokol farklı kritik aşamada elde edilebilir sonuçları göstermektedir. hipokampus CA1, tabakalar radiatum ve lacunosum-moleculare: Özellikle sonuçları beyin metoksi-x04 lekeli belirli bir bölgedeki plaklar ve ilgi katmanları içeren bölümlerinin örneklerini göstermektedir. Plaklar ve hipokampus lamelli / bölgesel örgüt gittikçe UV ve parlak bir alan filtreleri (Şekil 1) bir kombinasyonu kullanılarak görüntülenmiştir. Seçilen beyin b...

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with ÃŽÂ²-Amyloid Plaques at JoVE.com

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

Bu makalede, kan-beyin bariyerini geçer ve seçici olarak p-kıvrımh için yoğun bir çekirdek Aβ plaklarda bulunan yaprak bağlanan metoksi-x04 kullanarak Alzheimer hastalığı fare modellerinde amiloid Aβ plaklar görselleştirmek için bir protokol açıklamaktadır. Bu elektron mikroskobu için immün ve işleme öncesinde plak içeren doku kesitlerinde önceden tarama sağlar.

Bağıntılı Işık ve Elektron Mikroskobu β-amiloid plaklarının ile Mikroglial Etkileşimleri Eğitim için

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...

correlative-light-electron-microscopy-to-study-microglial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K Görüntüleme.  CHU de Québec Research Center.  Bu makalede, kan-beyin bariyerini geçer ve seçici olarak p-kıvrımh için yoğun bir çekirdek Aβ plaklarda bulunan yaprak bağlanan metoksi-x04 kullanarak Alzheimer hastalığı fare modellerinde amiloid Aβ plaklar görselleştirmek için bir protokol açıklamaktadır. Bu elektron mikroskobu için immün ve işleme öncesinde plak içeren doku kesitlerinde önceden tarama sağlar. 

Video: Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with β-Amyloid Plaques

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Odaklı İyon Işın Freze ve Beyin Dokusu Taramalı Elektron Mikroskobu

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Nörobilim

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

Içinde Doğuştan gelen ve sirkadiyen Ayarlı Photobehavior Eğitim ışık tercih Testi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Eşodaklı Işık Sac Mikroskobu ile Tüm Fare Brain mikron çaplı Çözünürlük Optik Tomografi

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Bir Model Olarak Koku Sistemi Akson Büyüme Modelleri ve Morfoloji Eğitim için<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the barrier and the brain parenchyma is still an unmet need. To fill this gap, we designed a 2D in cellulo model, the BBB-Minibrain, by combining a polyester porous membrane culture insert human BBB model with a Minibrain formed by a tri-culture of human brain cells (neurons, astrocytes and microglial cells). The BBB-Minibrain allowed us to test the transport of a neuroprotective drug candidate (e.g., Neurovita), through the BBB, to determine the specific targeting of this molecule to neurons and to show that the neuroprotective property of the drug was preserved after the drug had crossed the BBB. We have also demonstrated that BBB-Minibrain constitutes an interesting model to detect the passage of virus particles across the endothelial cells barrier and to monitor the infection of the Minibrain by neuroinvasive virus particles. The BBB-Minibrain is a reliable system, easy to handle for researcher trained in cell culture technology and predictive of the brain cells phenotypes after treatment or insult. The interest of such in cellulo testing would be twofold: introducing derisking steps early in the drug development on the one hand and reducing the use of animal testing on the other hand.

Here we present a protocol describing the setting of an in cellulo BBB (Blood brain barrier)-Minibrain polyester porous membrane culture insert system in order to evaluate the transport of biomolecules or infectious agents across a human BBB and their physiological impact on the neighboring brain cells.

Bariyer geçişleri patojenler veya ilaçlar ve onların etkileşim beyin ile çalışmak için bir insan kan-beyin arabirim modeli

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the cells themselves. Here, we present the method of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins (LIMAP) using the PRIMO system as a patterning technique to produce micro-patterned extracellular matrix (ECM) substrates using a single or combination of proteins. The method enables printing of ECM patterns in micron resolution with excellent reproducibility. We provide a step-by-step protocol and demonstrate how this can be applied to study the processes of neuronal pathfinding. LIMAP has significant advantages over existing micro-printing methods in terms of the ease of patterning more than one component and the ability to generate a pattern with any geometry or gradient. The protocol can easily be adapted to study the contribution of almost any chemical component towards cell fate and cell behavior. Finally, we discuss common issues that can arise and how these can be avoided.

Our overall aim is to understand how cells sense extracellular cues that lead to directed axonal growth. Here, we describe the methodology of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins, used to produce defined micro-patterns of extracellular matrix components in order to study specific events that govern axon outgrowth and pathfinding.

Hücre Dışı Matriks Proteinlerine Hücre Yanıtlarını İncelemek Için Mikro-Desenleme için PRIMO Sistemini Kullanan Proteinlerin Işık Kaynaklı Moleküler Adsorpsiyonu

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

Dendritik Dikenlerin Çalışması için Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBEM)

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to use these cells for the purpose of studying the pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) in the rat hSOD1G93A model. First, the protocol shows how to isolate and culture astrocytes and microglia from postnatal rat cortices, and then how to characterize and test these cultures for purity by immunocytochemistry using the glial fibrillary acidic protein (GFAP) marker of astrocytes and the ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1) microglial marker. In the next stage, methods are described for dye-loading (calcium-sensitive Fluo 4-AM) of cultured cells and the recordings of Ca2+ changes in video imaging experiments on live cells.
The examples of video recordings consist of: (1) cases of Ca2+ imaging of cultured astrocytes acutely exposed to immunoglobulin G (IgG) isolated from ALS patients, showing a characteristic and specific response compared to the response to ATP as demonstrated in the same experiment. Examples also show a more pronounced transient rise in intracellular calcium concentration evoked by ALS IgG in hSOD1G93A astrocytes compared to non-transgenic controls; (2) Ca2+ imaging of cultured astrocytes during a depletion of calcium stores by thapsigargin (Thg), a non-competitive inhibitor of the endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase, followed by store-operated calcium entry elicited by the addition of calcium in the recording solution, which demonstrates the difference between Ca2+ store operation in hSOD1G93A and in non-transgenic astrocytes; (3) Ca2+ imaging of the cultured microglia showing predominantly a lack of response to ALS IgG, whereas ATP application elicited a Ca2+ change. This paper also emphasizes possible caveats and cautions regarding critical cell density and purity of cultures, choosing the correct concentration of the Ca2+ dye and dye-loading techniques.

We present here a protocol on how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from rat cortices for time-lapse video imaging of intracellular Ca2+ for research on pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis in the hSOD1G93A rat model.

Sıçan Astrositleri ve Mikroglia'nın Birincil Kültürleri ve Amiyotrofik Lateral Skleroz Çalışmalarında Kullanımları

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature vibrations of molecules. However, these vibrational signatures are also characteristic of molecules within anatomical tissue such as the brain, making it increasingly useful and applicable for Neuroscience applications. For example, CARS can measure lipids by specifically exciting chemical bonds within these molecules, allowing for quantification of different aspects of tissue, such as myelin involved in neurotransmission. In addition, compared to other techniques typically used to quantify myelin, CARS can also be set up to be compatible with immunofluorescent techniques, allowing for co-labeling with other markers such as sodium channels or other components of synaptic transmission. Myelination changes are an inherently important mechanism in demyelinating diseases such as multiple sclerosis or other neurological conditions such as Fragile X Syndrome or autism spectrum disorders is an emerging area of research. In conclusion, CARS can be utilized in innovative ways to answer pressing questions in Neuroscience and provide evidence for underlying mechanisms related to many different neurological conditions.

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Visualizing myelination is an important goal for many researchers studying the nervous system. CARS is a technique that is compatible with immunofluorescence that can natively image lipids within tissue such as the brain illuminating specialized structures such as myelin.

Beyin Dilimlerinde Miyelinasyon Görüntüleme için Tutarlı Anti-Stokes Raman Spektroskopisi (CARS) Uygulaması

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

Bağıntılı Işık ve Elektron Mikroskobu β-amiloid plaklarının ile Mikroglial Etkileşimleri Eğitim için

PLAYLIST