Name: novel rna-binding proteins isolation by the rapid methodology
Uploaded: 2016-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology at JoVE.com

Biz hızlı protokol kurma ve gerekli plazmitleri sağlayarak onların yararlı tavsiyeler Prof. Jeff Gerst ve Boris Slobodin teşekkür ederiz. Biz de LC-MS / MS analizi ile ona yardım için Smoler Proteomiks Merkezi&#39;nden bu protokolü Dr. Tamar Ziv kurulması ona yardım için Dr. Avigail Atir-Lande teşekkür ederim. Biz YEF3 antikor Prof. TG Kinzy (Rutgers) teşekkür ederim. Bu çalışma Binational Bilim Vakfı hibe 2011013 tarafından desteklenmiştir.

Not: 12 MS2 bağlayıcı siteleri kapsayan bir dizi takın (MS2 döngüler; MS2L) istenen genomik içine, genellikle, açık okuma çerçevesinin (ORF) 3 &#39;UTR arasındadır. Bu entegrasyon için ayrıntılı bir protokol yerde 22 sağlanır. PCR, kuzey analizi veya RT-PCR 20,23 tarafından uygun ekleme ve ifade doğrulayın. Entegrasyon 3&#39;UTR&#39;sinden sentezi ile müdahale etmedi doğrulamak için önemlidir. Buna ek olarak, indüklenebilir bir promotör (metiyonin tükenmesi) ekspresyonu altında SKB kaynaşmış bir plazmid ifade MS2-CP da hücreler 24 içine alınmalıdır. kişiye MS12 halkalar hariç özdeş soyu, spesifik olmayan sinyallerin tespiti için bir kontrol olarak kullanılır. 1. Hızlı Arıtma <ol><li> Maya hücreleri, 500 ml (söz konusu genin ifade seviyesi ile ilgili olarak, maya hücreleri 250-1,000 ml kullanın) mRNA&#39;nın 20 ve MS2-etiketli eksprese büyütünUygun büyüme ortamına (örneğin, Sentetik Dekstroz (SD) seçici orta) 30 o C&#39;de 1.0 - MS2-CP-GFP-SBP füzyon proteini 24 600 0.8 OD. </li><li> Santrifüj hücreleri oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 3.000 xg&#39;de ve süpernatant atın. </li><li> Metiyonin olmayan SD, eşit hacimde (adım 1.1) de (adım 1.2), daha önce olduğu gibi tekrar süspansiyon 1X fosfat tamponlu salin hücreleri (PBS), santrifüj yıkayın ve 45 boyunca inkübe - MS2 ekspresyonunu indüklemek için 60 dakika 30 ° C&#39;nin -CP-GFP SBP füzyon proteini. Not: Daha uzun indüksiyon süresi GFP toplanmalarına neden olabilir. </li><li> Hücrelerin bir kenara 10 ml Set ve basit &quot;sıcak fenol&quot; yöntemini 25 kullanılarak bu örnekten RNA ayıklayın. Dikkat: Fenol son derece zehirli ve emniyet talimatlarına göre ele alınmalıdır. Not: Bu RNA izole RNA (Şekil 1A) kalitesi için iyi bir referanstır. </li><li> 500 ml hücre için, bir son c 1.35 ml% 37 formaldehid ilave% 0.1 bağlı yoğunlaşma RNA-protein kompleksleri çapraz bağlanması için. 10 dakika boyunca 30 ° C de kuluçka devam edin. Dikkat: Formaldehit çok zehirlidir ve güvenlik talimatlarına göre ele alınmalıdır. </li><li> 0.125 M bir son konsantrasyona kadar 2.5 M glisin 26.5 ml ilave edilir ve çapraz bağlanmasının durdurmak için 3 dakika boyunca inkübe edin. Bu adımdan, RNA bozulmasını en aza indirmek için buz üzerinde her şeyi koymak. </li><li> 4 o C&#39;de 4 dakika süreyle 3,000 xg&#39;de Santrifüj hücreleri ve 45 ml soğuk 1x PBS ile yıkayın. </li><li> Başlangıç ​​hücre kültürü 100 ml başına 1 mi Rapid liziz tamponunda yeniden süspanse hücreleri. </li><li> vidalı kapaklı mikrofuge&#39;ye tüplerde 500 ul hacme bölünmüş ve her kısım (kabaca tam 0.2 ml PCR tüp) için ~ soğutulmuş cam boncuklar 400 mg ekleyin. </li><li> Bir çemberde Hücreleri, 3 dakika boyunca çırpıcı. Hemen buz üzerinde lizat koydu. Not: Hücre parçalama serbest bırakır RNA bozulması başlıca nedenidir hücresel RNases. Rapid liziz tamponu RNaz inhi yüksek konsantrasyonda içerirBu tür spesifik olmayan RNaz inhibitörü özellikle heparin ve spesifik inhibitörleri olarak bitors. hızla çalışan ve soğuk her şeyi tutmak da tavsiye edilir. </li><li> Yeni tüplere lizat aktarın. Pierce sıcak iğne (0.8 mm x 40 mm) ile her bir mikrofüj tüpün alt küçük bir delik ve 15 ml tüpler üzerine mikrofüj tüpleri. mikrofüj tüpleri ve 15 ml tüpler arasında bir adaptör olarak 5 ml&#39;lik bir şırınga baş kullanın. 4 O ° C&#39;de 1 dakika için 3000 x g&#39;de borular düzeneği santrifüj </li><li> Hücre artıkları temizlemek için 4 o C&#39;de 10 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de yeni bir 1.5 ml tüp ve santrifüj akış oranı 15 ml tüp transfer. </li><li> Havuz tek 15 ml tüp içine tüm 1.5 ml tüpler süpernatantlar ve 1/50 kenara sırasıyla RNA ve protein izolasyonu için lizat 1/100 hacim. Not: Bu sonraki analiz (Şekil 1) için &quot;Giriş&quot; örnekleri olarak görev yapacak. </li><li> i 500 ml başına avidin 300 ug eklemenitial maya kültürü ve sürekli haddeleme (10 rpm) 4 O ° C&#39;de (bu, 10 dakika indirgenebilir), 30 dakika boyunca inkübe edin. Not: streptavidin boncuk bağlanmasını Avidin blok biotin ve biyotinile edilmiş proteinler. </li><li> hücreleriyle inkübasyon önce streptavidin boncuk ön yıkayın. <ol><li> boncuklar 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne çamur streptavidin yaklaşık 300 ul aktarın ve üst süpernatant kaldırmak. Bu boncuk 250 ul neden olur. HIZLI liziz tamponu için 1 ml ile iki kez boncuk yıkayın. Her adım arasında 4 o C&#39;de 2 dakika süreyle 660 xg&#39;de streptavidin boncuk santrifüj. </li><li> 0.5 hızlı bir liziz tamponu mL içinde 10 mg, 0.5 ml / ml BSA ve 10 mg / ml maya tRNA, 10 ul 1 saat boyunca inkübe edilerek boncuk bloke eder. Boncuk O / N gerekirse rotasyon ile 4 o C&#39;de çözüm engelleme bırakılabilir. </li><li> Rapid lizis tamponu 1 ml ile iki kez yıkanır. Manyetik boncuklar da zaman ve Backgr azaltmak için kullanılabilir: Notound. Ancak bunlar, sefaroz boncuklar daha düşük kapasiteye sahiptir. </li></ol></li><li> (Adım 1.14 arasında) avidin ihtiva eden lizat önceden yıkanmış streptavidin boncuk 250 ul ilave edin ve sabit dönme (10 rpm) ile, 4 ° C &#39;de 1 saat inkübe edilir. Not: Bu inkübasyon süresi yeterli bağlanma süresi sağlayan ve RNA bozulması şansını en aza indirmek arasında bir uzlaşmadır. </li><li> 4 o C&#39;de 2 dakika süreyle 660 xg&#39;de santrifüj streptavidin boncuk temizlemek ve yeni bir 15 ml tüp süpernatant aktarmak için. sırasıyla kenara 1/50 ve RNA ve protein izolasyonu için lizat 1/100 hacim, ayarlayın. Not: Bu &quot;Sınırsız&quot; örnekleri olacaktır. </li><li> Adım 1.17 gibi hafifçe sallayın, Rapid Lizis tamponu 1 ml boncuk yıkayın yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne transfer ve santrifüj. Bu adımı üç kez tekrarlayın. </li><li> 1 Hızlı yıkama tampon maddesinin ml&#39;si, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca bu zaman döndürmek (10 rpm) ile boncuk yıkayın. İki kez bu adımı yineleyin. </li&gt; <li> Yukarıdaki 1 1x PBS ilave edildi ve santrifüj ile boncuk yıkayın. </li><li> 1x PBS 120 ul tekrar boncuk yıkayın. Santrifüj yukarıdaki gibi ve &quot;Yıkama&quot; örnek olarak RNA ve protein ekstraksiyonu için tüm süpernatant alır. Not: Bu son yıkama Örnek yıkama katılığını gösterir ve elüsyon örnek olarak, aynı hacimde olmalıdır. Bu daha sonraki analizlerde işleme ve yükleme basitleştirecek. </li><li> Kolondan RNA ve RNA-ilişkili proteinler elüt 1x PBS içinde 6 mM biyotin 120 ul ilave edin ve sabit dönme (10 rpm) ile, 4 ° C&#39;de 45 dakika boyunca inkübasyona. </li><li> Santrifüj boncuklar yukarıda ve yeni bir 1.5 ml&#39;lik tübe elüt malzemeyi aktarırlar. Tekrar edilen örnek Spin ve boncuk Resim taşınmasını sağlamak için yeni bir 1.5 ml&#39;lik tübe Üst faz transfer. </li><li> RNA ya da protein çıkarımı için örnekler alın. Not: Alınan ses RNA veya protein, aşağıdaki deney ve ifade seviyesine bağlı olmalıdır. Kuzey analizi 26 için bir kılavuz olarak, Western Blot 23,27 veya RT-PCR 28 için, numunenin% 80 almak% 20 almak ve kütle spektrometresi 29 için, yeni proteinler keşfetmek tüm örnek almak için. </li></ol> 2. RNA Ekstraksiyon <ol><li> 2x Çapraz bağlama Ters tampon maddesinin eşit hacmi ekleyin ve 65 ° C&#39;de 45 dakika inkübe edilir. RNA ekstraksiyonu için doğrudan devam edin. Not: Çapraz bağlama Ters Tampon anlamlı RNA ekstraksiyonu 20 arttırır etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ihtiva etmektedir. </li><li> Standart fenol kullanın: kloroform yöntemi 26 &quot;giriş&quot; ve &quot;ilişkisiz&quot; örneklerinde (1.13 ve 1.17 adımlar) RNA ayıklayın. Not: Bu örnekler (ör RT-PCR), bu nedenle, LiCİ çöktürme 30 çıkarmak için tavsiye edilir daha sonra reverse transcriptase (RT) kullanılarak tahlilleri önleyebilen RNaz inhibitör heparin büyük miktarda içerir. &quot;wash &quot;ve&quot; elüsyon &quot;örnekleri (1.21 ve 1.24 adımlar) RNA düşük miktarda içeren ve aşağıdaki adımlarda çöktürülür. </li><li> &quot;Yıkama&quot; ve &quot;yıkama&quot; örnekleri 8 M Guanidinyum-HCI (GuHCl) ve% 100 etanolden iki hacmin eşit hacim. En az 2 saat boyunca -80 ° C&#39;de inkübe edin. Not: Guanidinium verimli proteinler denatüre ve böylece numunedeki RNases ve proteazlar engelleyecektir. </li><li> 20.000 x g&#39;de, 30 dakika süre ile 4 ° C&#39;de santrifüj ve süpernatant atılır. 20.000 x g&#39;de 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de tekrar soğuk% 80 etanol ve santrifüj ile pelet yıkayın. </li><li> RNazsız su 400 ul RNA pelet çözülür ve herhangi bir artık GuHCl ya da diğer kirletici maddeleri uzaklaştırmak için yeniden çökeltilmesi. 3 M sodyum asetat, pH 5.2 ve% 100 etanol içinde 800 | il 40 ul ekle, en az 1 saat boyunca -20 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Santrifüj adım 2.4 gibi yıkayın ve bir 10 ul ucu ile tüm etanol çıkarın ve. RNA pell yeniden süspanse10 ul RNazsız su içinde ve çal. RNA pelet genellikle görünmüyorsa gibi ekstra özen gösterin. Not: 23 (Şekil 1) &#39;de tarif edildiği gibi numuneler, kuzey analizi için kullanılabilir. </li></ol> 3. Protein Western Blot veya Kütle Spektrometre Analiz Hazırlık <ol><li> Protein örnekleri 4x Laemmli numune tamponu (LSB) 1/3 hacim ekleyin ve RNA ve protein çapraz bağlantıyı ters döndürecek 65 ° C&#39;de 45 dakika inkübe edilir. Not: Örnekler, -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Bir SDS poliakrilamid jeli (SDS-PAGE) 31 çalıştırmak proteinler. Analiz edilecek protein ölçülerine uygun jel yüzdesini ayarlamak. Not:% 10 akrilamid jel ayırması geniş verir ve bir birinci yaklaşım olarak iyidir. </li><li> Izolasyon verimi (Şekil 1C) kontrolü için, standart bağışıklık benekleme analizi 27 gibi membran proteinleri aktarın. Coomassie Blue R ile ya Lekekütle spektrometresi analizden önce 250 veya gümüş leke. Not: daha duyarlı ve daha iyi algılama (Şekil 1B) sağlar çünkü Gümüş leke tercih edilen bir seçimdir. Boyama elle hazırlanmış solüsyonlar ya da ticari kitler biriyle yapılabilir. Nihai boya çözeltisi içinde jel inkübasyon süresi deneysel olarak tespit edilmelidir. Uzun inkübasyon düşük bol protein açığa çıkarabilir, ancak böyle MS2-CP-SBP-GFP olarak yüksek ifade proteinler üzerinde lekeli olması neden olabilir ve onların çevresinde çevreleyen proteinleri maskeleyebilir. Buna ek olarak, yüksek bir arka plan oluşabilir. dikkatle reaksiyonu izleyin ve uygun zamanda Dur Çözüm ekleyin. </li><li> jelden bantları kesip 1.5 ml tüpler aktarabilirsiniz. -20 ° C&#39;de saklayın örnekleri ya da LC-MS / MS analizi 32, ardından protein ekstraksiyonu ve tripsin sindirim için örneklendi. </li><li> Eğer jel ayrılması aşamasını hariç tutmak için alternatif bir yaklaşım olarak proteomik, bu adım 1.24 elüt edilen malzeme, özetLC-MS / MS analizi 33 tripsin ve konuyu kullanarak dökülmesinden. Not: SDS-PAGE ayrılması atlama protokolü kolaylaştırır ve verim artar. Bununla birlikte, örnekler, kütle spektrometri analizi önleyen deterjan NP-40, izlerini içerebilir. Bu sorunu aşmak için, aşağıdaki adımları gerçekleştirin: <ol><li> 15 dakika - 10 SDS-PAGE 31 protein çalıştırın. </li><li> (Proteinler bulunduğu, yani) sokağın tüm kısmını kesip. Not: Protein numunesi düşük bolluk protein sinyalleri gizleyebilir MS2-CP- SBP, proteinin önemli bir miktarda içerebilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+RNA-binding+proteins+interact+with+functionally+related+sets+of+RNAs,+suggesting+an+extensive+regulatory+system.">Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system.</a> PLoS Biol. 6, e255 (2008).</li><li>Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+search+reveals+unexpected+RNA-binding+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Proteome-wide search reveals unexpected RNA-binding proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> PloS One. 5, (2010).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins.">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149, 1393-1406 (2012).</li><li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+RNA-binding+proteins.">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nat Rev Genet. 15, 829-845 (2014).</li><li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts.">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46, 674-690 (2012).</li><li>Mitchell, S. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+properties+of+eukaryotic+mRNPs.">Principles and properties of eukaryotic mRNPs.</a> Mol Cell. 54, 547-558 (2014).</li><li>Licatalosi, D. D., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+processing+and+its+regulation:+global+insights+into+biological+networks.">RNA processing and its regulation: global insights into biological networks.</a> Nat Rev Genet. 11, 75-87 (2010).</li><li>Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+chaperone+Ssa1+affects+mRNA+localization+to+the+mitochondria.">The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria.</a> FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).</li><li>Ascano, M., Gerstberger, S., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-disciplinary+methods+to+define+RNA-protein+interactions+and+regulatory+networks.">Multi-disciplinary methods to define RNA-protein interactions and regulatory networks.</a> Curr Opin Genet Dev. 23, 20-28 (2013).</li><li>Denman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNPs+take+shape+by+CLIPPING+and+PAIRING.">mRNPs take shape by CLIPPING and PAIRING.</a> BioEssays. 28, 1132-1143 (2006).</li><li>McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+comprehensive+experimental+identification+of+RNA-protein+interactions.">Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions.</a> Genome Biol. 15, 203 (2014).</li><li>Bernstein, D. S., Buter, N., Stumpf, C., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+mRNA-protein+complexes+using+a+yeast+three-hybrid+system.">Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system.</a> Methods. 26, 123-141 (2002).</li><li>SenGupta, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-hybrid+system+to+detect+RNA-protein+interactions+in+vivo.">A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 8496-8501 (1996).</li><li>Yosefzon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+RNA+binding+specificity+of+yeast+Puf2p.">Divergent RNA binding specificity of yeast Puf2p.</a> RNA. 17, 1479-1488 (2011).</li><li>Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+yeast+mRNPs.">Global analysis of yeast mRNPs.</a> Nat Struct Mol Biol. 20, 127-133 (2013).</li><li>Zielinski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+of+ribonucleoprotein-RNA+interactions.">In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1557-1562 (2006).</li><li>Bell, T. J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Genomics:+RNA+Exon-Specific+RNA-Binding+Protein+Isolation.">Live Cell Genomics: RNA Exon-Specific RNA-Binding Protein Isolation.</a> Methods Mol Biol. 1324, 457-468 (2015).</li><li>Leppek, K., Stoecklin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+streptavidin-binding+RNA+aptamer+for+purification+of+ribonucleoprotein+complexes+identifies+novel+ARE-binding+proteins.">An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins.</a> Nucleic Acids Res. 42, e13 (2014).</li><li>Slobodin, B., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mRNA+affinity+purification+technique+for+the+identification+of+interacting+proteins+and+transcripts+in+ribonucleoprotein+complexes.">A novel mRNA affinity purification technique for the identification of interacting proteins and transcripts in ribonucleoprotein complexes.</a> RNA. 16, 2277-2290 (2010).</li><li>Samra, N., Atir-Lande, A., Pnueli, L., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elongation+factor+eEF3+(Yef3)+interacts+with+mRNA+in+a+translation+independent+manner.">The elongation factor eEF3 (Yef3) interacts with mRNA in a translation independent manner.</a> BMC Mol Biol. 16, 17 (2015).</li><li>Loya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3'-UTR+mediates+the+cellular+localization+of+an+mRNA+encoding+a+short+plasma+membrane+protein.">The 3'-UTR mediates the cellular localization of an mRNA encoding a short plasma membrane protein.</a> RNA. 14, 1352-1365 (2008).</li><li>Haim-Vilmovsky, L., Gadir, N., Herbst, R. H., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+integration+method+for+the+simultaneous+visualization+of+endogenous+mRNAs+and+their+translation+products+in+living+yeast.">A genomic integration method for the simultaneous visualization of endogenous mRNAs and their translation products in living yeast.</a> RNA. 17, 2249-2255 (2011).</li><li>Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+extensive+intra-molecular+associations+between+3'-UTRs+and+their+ORFs.">Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs.</a> Nucleic Acids Res. 36, 6728-6738 (2008).</li><li>Slobodin, B., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RaPID:+an+aptamer-based+mRNA+affinity+purification+technique+for+the+identification+of+RNA+and+protein+factors+present+in+ribonucleoprotein+complexes.">RaPID: an aptamer-based mRNA affinity purification technique for the identification of RNA and protein factors present in ribonucleoprotein complexes.</a> Methods Mol Biol. 714, 387-406 (2011).</li><li>Schmitt, M. E., Brown, T. A., Trumpower, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+preparation+of+RNA+from+Saccharomyces+cerevisiae.">A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 18, 3091-3092 (1990).</li><li>Eldad, N., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ribosomal+density-mapping+procedure+to+explore+ribosome+positions+along+translating+mRNAs.">A ribosomal density-mapping procedure to explore ribosome positions along translating mRNAs.</a> Methods Mol Biol. 419, 231-242 (2008).</li><li>Arava, Y., Seger, R., Fbeta Walker, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GRFbeta,+a+novel+regulator+of+calcium+signaling,+is+expressed+in+pancreatic+beta+cells+and+brain.">GRFbeta, a novel regulator of calcium signaling, is expressed in pancreatic beta cells and brain.</a> J Biol Chem. 274, 24449-24452 (1999).</li><li>Arava, Y., Adamsky, K., Ezerzer, C., Ablamunits, V., Walker, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+gene+expression+in+pancreatic+beta-cells:+cloning+and+characterization+of+differentially+expressed+genes.">Specific gene expression in pancreatic beta-cells: cloning and characterization of differentially expressed genes.</a> Diabetes. 48, 552-556 (1999).</li><li>Bavli-Kertselli, I., Melamed, D., Bar-Ziv, L., Volf, H., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+eukaryotic+initiation+factor+5+rescues+the+translational+defect+of+tpk1w+in+a+manner+that+necessitates+a+novel+phosphorylation+site.">Overexpression of eukaryotic initiation factor 5 rescues the translational defect of tpk1w in a manner that necessitates a novel phosphorylation site.</a> FEBS J. 282, 504-520 (2015).</li><li>Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+RNA+extracted+from+isolated+mitochondria.">Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria.</a> Methods Mol Biol. 714, 287-299 (2011).</li><li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+(1D+SDS-PAGE).">One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE).</a> Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).</li><li>Gundry, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+proteins+and+peptides+for+mass+spectrometry+analysis+in+a+bottom-up+proteomics+workflow.">Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25 (2009).</li><li>Medzihradszky, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-solution+digestion+of+proteins+for+mass+spectrometry.">In-solution digestion of proteins for mass spectrometry.</a> Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).</li><li>Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=StreptoTag:+a+novel+method+for+the+isolation+of+RNA-binding+proteins.">StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins.</a> RNA. 5, 1509-1516 (1999).</li><li>Oeffinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+steps+forward--one+step+back:+advances+in+affinity+purification+mass+spectrometry+of+macromolecular+complexes.">Two steps forward--one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes.</a> Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).</li><li>Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+beta-actin+mRNA+zipcode-binding+protein.">Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein.</a> Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).</li><li>Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Xenopus+Vg1+mRNA+by+Vera+protein+and+the+endoplasmic+reticulum.">Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum.</a> Science. 276, 1128-1131 (1997).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2, 437-445 (1998).</li><li>Aizer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+mRNA+targeting+to+P-bodies+in+living+human+cells+reveals+their+dual+role+in+mRNA+decay+and+storage.">Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage.</a> J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).</li><li>Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+mRNAs+coding+for+mitochondrial+proteins+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 17, 1551-1565 (2011).</li><li>Lopez de Heredia, ., M, R. P., Jansen, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+integrity+as+a+quality+indicator+during+the+first+steps+of+RNP+purifications+:+a+comparison+of+yeast+lysis+methods.">RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods.</a> BMC Biochem. 5, 14 (2004).</li><li>Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integration+in+CHO+cells+mediated+by+CRISPR/Cas9+and+homology-directed+DNA+repair+pathway.">Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway.</a> Sci Rep. 5, 8572 (2015).</li><li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair.">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Res. 24, 142-153 (2014).</li><li>Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantitation+of+protein+expression+and+site-specific+phosphorylation.">Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).</li><li>de Godoy, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SILAC+yeast:+from+labeling+to+comprehensive+proteome+quantification.">SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification.</a> Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Çeşitli yöntemler ilişkili proteinleri 11,34 35 tanımlamak için belirli bir mRNA izolasyonunu kullanımı. Bu yöntemler, bir RNA-protein etkileşimlerini incelemek için in vitro ve in vivo stratejileri geçerlidir. In vitro yöntemler, dışsal RBPS yakalamak ve RNP kompleksleri 36,37 izole etmek için hücre lizatı ile RNA transkripsiyonu inkübe edin. Bu tip bir etkili bir yaklaşım, bir düzenleyici RNA motifi 18 bağlanan yeni ...

RNA bağlayıcı proteinler (RBPS) S. yaklaşık% 10&#39;unu temsil cerevisiae proteinleri 1,2 ve memeli proteinlerinin 3-5 arasında yaklaşık% 15. Bunlar mRNA transkripsiyon sonrası işleme ve düzenleme, çeviri, ribozom biogenezinin, tRNA Aminoacylation ve modifikasyon, kromatin yeniden ve daha fazlası gibi birçok hücresel süreçlere de karışırlar. RBPS önemli bir alt grubu, mRNA bağlayıcı proteinler (mRNPs) 6,7 olan. MRNA olgunlaşma sürecinde, farklı RBPS transkript bağlamak ve nükleus, hücresel lokalizasyonu, çeviri ve bozulma 6-8 dışarı nükleer işleme, ihracat aracılık eder. Böylece, herhangi bir zaman noktasında belirli bir transkript bağlı RBPS ayrı set onun işleme ve sonuçta onun kaderi belirler. Bir mRNA ile ilişkili RBPS belirlenmesi önemli ölçüde transkripsiyon sonrası düzenleme altında yatan süreçlerin anlayışımızı artırabilir. genetik çeşitlilikMikroskobik, biyokimyasal ve biyoinformatik yöntemleri (9-11 gözden) mRNA düzenlenmesinde rol proteinleri tespit etmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yöntem sadece birkaç özel bir hedef mRNA ile ilişkili proteinlerin belirlenmesini mümkün kılmaktadır. Dikkat çekici bir şekilde, maya hücreleri bir ekspresyon kolleksiyonunu taramak için yem olarak ilgili mRNA&#39;nın kullanır maya üç hibrid sistemi (Y3H) &#39;dir. Pozitif klonlar genellikle büyüme seçimi ya da muhabir ifade 12-14 ile gözlenir. Bu yöntemin en önemli avantajı, hücre ortamında ve RNA-protein etkileşiminin gücünü ölçmek için yeteneği taranabilir proteinlerin büyük bir sayıdır. Dezavantajları nedeniyle spesifik olmayan yanlış pozitif sonuç, görece olarak yüksek ve füzyon proteini, av veya yem RNA yanlış katlanma kısmen hatalı negatif sonuçlar, yüksek bir potansiyel bulunmaktadır. Genetik yaklaşım alternatif afinite purifi olanilişkili proteinler RNA katyonudur. Poli A ihtiva eden mRNA oligo dT sütun kullanılarak izole edilebilir, ve bunların ilişkili proteinler kütle spektrometrisi ile tespit edilir. RNA-protein etkileşimi, kısa menzilli kovalent bağlar yapan çapraz bağlama suretiyle, hücresel bir çerçevede, muhafaza edilir. Oligo dT sütunun kullanılması mRNA 3,5,15 A-içeren herhangi bir poli ile ilişkili tüm proteom küresel bir görünüm verir. Bununla birlikte, belirli bir mRNA ile ilişkili proteinlerin bir listesi sağlamaz. Çok az metotlar, bir kimlik gerçekleştirmek için kullanılabilir. ÇİFT yöntemi hedefe mRNA 16,17 ile tamamlayıcılık ile nükleik asidin transfeksiyon gerektirir. nükleik asit, aynı zamanda etkileşim bölgesi yakın çevresinde RBPS için çapraz bağlama sağlayan bir peptit eklenir. çapraz bağlama sonrasında RBP-peptid-nükleik asit izole edilebilir ve proteomik analizine tabi tutulmuştur. Son zamanlarda, bir aptamer tabanlı metodoloji oldubaşarılı bir şekilde, memeli hücre hatları 18 alıntılar uygulanır. streptavidin geliştirilmiş afiniteye sahip bir RNA aptamer geliştirilmiş ve (bu durumda AU zengin elemanı (ARE)) ilgi konusu bir sekansına kaynaştırılır. Aptamer RNA streptavidin boncuk bağlanmış ve hücre lizatı ile karıştırıldı. Sırasına ilişkili proteinler arıtıldı ve kütle spektrometrisi (MS) ile tespit edilmiştir. Bu yöntem hücresel ayarları (örneğin, in vitro) dışında meydana dernekler bulgulamışsak da, mRNA ile ilişkili proteinlerin izolasyonu genomuna aptamers vermek ve bu şekilde mümkün kılacak şekilde, gelecekte değişecektir olduğu süre hücresel ortam (yani, in vivo). Genetik manipülasyonlar iyi kurulmuş maya, olarak, (Prof. Dr. Jeff Gerst laboratuarında geliştirilen) hızlı yöntem, in vivo dernekler 19 bir görünüm sağlar. Rapid (özel ve MS2 kat proteinin bağlanma güçlü MS2- birleştirirVe) streptavidin bağlama alanı (SBP MS2 RNA dizisine CP) konjuge boncuk streptavidin. Bu streptavidin boncuk ile MS2 etiketli mRNA&#39;ların etkili arınma sağlar. Ayrıca, MS2 döngüler 12 kopya sentezleme RNA eş zamanlı olarak bağlanan ve izolasyon verimini geliştirmek için, altı MS2-CP izin verir. Bu protokol, bu nedenle elüt örnekler kütle spektrometrisi ile proteomik analizine tabi kez yeni mRNA ilişkili proteinlerin belirlenmesini sağlamak için önerilmiştir. Son zamanlarda, maya PMP1 mRNA 20 ile bağlantılı yeni proteinleri belirlemek için hızlı kullanmıştır. PMP1 mRNA daha önce ER membran ile ilişkili olduğu ve 3 &#39;çevrilmemiş bölgesi (UTR) Bu ilişki 21 önemli bir belirleyici olduğu bulunmuştur gördü. Bu nedenle, PMP1 3 &#39;UTR bağlanan RBPS lokalizasyonu önemli bir rol oynaması olasıdır. HIZLI sıvı kromatografı ve ardındany-kütle spektrometrisi / kütle spektrometrisi (LC-MS / MS) PMP1 20 ile etkileşim çok sayıda yeni protein da tespit ettik. Bu yazıda, Rapid metodoloji ayrıntılı bir protokol sağlar, gerek önemli kontroller yapılır ve verim ve özgüllüğünü artırabilir teknik ipuçları edilecek.

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>bio-lab</td><td>1981232300</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Acidic Phenol (pH 4.3)</td><td>sigma</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3)</td><td>sigma</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>bio-lab</td><td>3080521</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Frutarom</td><td>5551820</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Soybean Trypsin Inhibitor</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease&amp;nbsp; Inhibitor</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>Glass Beads</td><td>Sartorius</td><td>BBI-8541701</td><td>0.4-0.6mm diameter&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mini BeadBeater</td><td>BioSpec</td><td>Mini BeadBeater 16</td><td></td></tr><tr><td>Guanidinium</td><td>Sigma</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Sigma</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Beads</td><td>GE Healthcare&amp;nbsp;</td><td>17-5113-01</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA</td><td>Sigma</td><td>R8508</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Bacto</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>peptone</td><td>Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate-Buffered saline (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer (LSB)</td><td></td><td></td><td>0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue.</td></tr><tr><td>Hot phenol lysis buffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>3 M Sodium Acetate pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% and 70% Ethanol (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RaPID lysis buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 &amp;micro;g/ml Leupeptin, 10 &amp;micro;g/ml Aprotinin, 10 &amp;micro;g/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 &amp;micro;g/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease&amp;nbsp; Inhibitor.</td></tr><tr><td>2x Cross-linking reversal buffer</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.</td></tr><tr><td>RaPID wash buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris-HCl pH 7.5,&amp;nbsp; 300 mM NaCl, 0.5% NP-40</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>161-0449</td><td>For detecting proteins in polyacrylamide gels</td></tr><tr><td>SD selective medium&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine</td></tr><tr><td>Anti-eEF3 (EF3A,YEF3)</td><td>Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School)</td><td>1:5,000</td><td></td></tr><tr><td>Anti GFP antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8334</td><td>1:3,000</td></tr><tr><td>Anti rabbit IgG-HRP conjugated</td><td>SIGMA</td><td>A9169</td><td>1:10,000</td></tr></tbody></table>

novel rna-binding proteins isolation by the rapid methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

Rapid ilişkili proteinler ile spesifik bir hedef RNA&#39;nın izolasyonu sağlar. başarısı için kritik böylece proteinin yeterli miktarda elde edilmesi mümkün olduğu kadar sağlam RNA tutmak. RNA izolasyonu etkinliğini ve kalitesini saptamak için northern analizi (Şekil 1A) gerçekleştirilir. Kuzey analizi doğrudan Rapid verimliliğini ve kalitesini raporlama avantajına sahiptir. Bu nedenle, tam uzunluktaki ve bozunma ürünlerinin nispi miktarları tek bi...

Watch this Scientific Journal Video about Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology at JoVE.com

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

novel-rna-binding-proteins-isolation-by-the-rapid-methodology

Research

JoVE Journal

Genetics

8.9K Görüntüleme.  Technion - Israel Institute of Technology. RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell. 

Video: Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Biyokimya

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA structures and motifs. In this RNA-pulldown protocol, commercially synthesized RNA probes are labeled with a modified form of biotin, desthiobiotin, at the 3' terminus of the RNA strand, which reversibly binds to streptavidin and thus allows elution of proteins under more physiological conditions. The RNA-desthiobiotin is immobilized through interaction with streptavidin on magnetic beads, which are used to pull down proteins that specifically interact with the RNA of interest. Non-denatured and active proteins from the cytosolic fraction of mesothelioma cells are used as the source of proteins. The method described here can be applied to detect the interaction between known RNA binding proteins and a 25-nucleotide (nt) long RNA probe containing a sequence of interest. This is useful to complete the functional characterization of stabilizing or destabilizing elements present in RNA molecules achieved using a reporter vector assay.

Desthiobiotin labeling of a synthetic 25-nucleotide RNA oligo, which contains an adenine-rich element (ARE) motif, allows specific binding of cytosolic ARE-binding protein.

Desthiobiotin-Streptavidin-benzeşme arıtma mezotelyoma hücrelerdeki RNA etkileşim proteinlerin aracılı

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

Kanser Araştırmaları

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

Ökaryotik mRNA-Protein kompleksleri kurtarmak için bir Tandem oligonükleotid tabanlı RNA izolasyon yordamı

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Genetik

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Biyoloji

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

Kısa Biyotinile RNA Kullanan RNA Bağlayıcı Proteinlerin Optimize Edilmiş Kantitatif Aşağı Çekme Analizi

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

RIP-Chip kullanarak Hücre Ekstraktlarının gelen mRNA mikroRNA&#39;lar ve ribonükleoprotein Kompleksi Protein Bileşenlerinin İzolasyonu ve Tanımlama için Yöntemi

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

RNA-Protein Pull-Down Assay to Isolate RNA-Binding Proteins via Affinity Extraction

Source: Kresoja-Rakic, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57516">Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an in vitro RNA pull-down assay to identify RNA-binding proteins (RBPs), which interact with the adenylate-uridylate-rich element (ARE) sequences in mRNA. The target RBPs from a cell lysate are mixed with an RNA probe to form RNA-protein complexes. The complexes are isolated via affinity purification utilizing the affinity of the desthiobiotin label of the RNA probe to a streptavidin-labeled magnetic bead.

Afinite Ekstraksiyonu Yoluyla RNA Bağlayıcı Proteinleri İzole Etmek için RNA-Protein Pull-Down Testi

Source: Kresoja-Rakic, J., et al. Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells. J. Vis. ...