Name: utilizing functional genomics screening to identify potentially novel drug targets in cancer cell spheroid cultures
Uploaded: 2016-12-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures at JoVE.com

The authors would like to thank Fredrik Walberg (FACS and imaging facility, ICR) for assistance with microscopy. This work was funded by Breast Cancer Now. RN is the recipient of a Breast Cancer Now Career Development Fellowship (2011MaySF01).

96-iyi siRNA Tabaklar 1. Hazırlık Not: 96 oyuklu bir plakanın dış kenarları, böylece 60 ve 96 oyuklu her plakaya siRNA&#39;lar miktarını sınırlamak, kuyu göre buharlaştırma daha yatkındır. Bu sınırlamak için düz orta veya PBS ile dış kuyularda doldurun. Buna ek olarak, isabet bir doğrulama ekranı plakası yanlılığı hafifletmek için tavsiye edilir. <ol><li> Ultra-düşük bağlanma plakasının uygun kuyulara 500 ng / (üreticinin önerilerine göre) azalmış serum ortamında uL ve Aliquotların 10 mcL - 250 siRNA&#39;lar sulandırmak. üç nüsha olarak tüm ekranları gerçekleştirin. NOT: transfeksiyon verimliliği değerlendirilebilir sağlamak için plaka tasarımı uygun olmayan hedefleme (negatif) ve (örneğin, UBB ve PLK1 olarak, pozitif) öldürme siRNA kontrolleri ekleyin. Hücreler transfeksiyon karışımı eklenir olarak siRNA çalışması için düşük bağlanma plakalarının kullanımı kritiktir. Biz ekarte edemez bazı üreticiler, ultra-düşük ekiPlakalar sfero büyüme üzerinde ince etkileri olabilir. Bu nedenle bu son kullanıcı tarafından test edilmelerini tavsiye ederiz. </li><li> -20 ° C&#39;de yapışkan mühürler ve mağaza ile kapak plakaları. </li></ol> Hücre Hattı 2. Ters Transfeksiyon <ol><li> Ekranın gün, oda sıcaklığında plakalar defrost bir tezgah üstü santrifüj kullanılarak 1000 x g&#39;de 5 dakika boyunca dönerler. her bir çok kanallı pipet kullanarak optimize transfeksiyon reaktifi ihtiva eden düşük serum ortamı 10 uL ekleyin. oluşturmak için siRNA ihtiva eden transfeksiyon komplekslerinden 15 dakika boyunca plakaları bırakın. Not: Bu çalışma, (% 10 fetal bovin serumu (FBS) ve antibiyotikler ile desteklenmiş yüksek glukoz DMEM içinde kültürlenir (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı)) fonksiyonel genomik tarama için göğüs kanseri hücre çizgisi, BT474 kullanılmaktadır. </li><li> taranabilir hücreleri (% 0.05 tripsin ve 0.53 mM EDTA) bu şişeden ayrılana kadar, hücre hattı Belir uygun hacmi kullanılarak nötralize tripsinizeBir tezgah üstü santrifüj ic orta ve 1.000 xg&#39;de 5 dakika boyunca sıkma tripsin kaldırmak için. ortamın uygun bir hacmi ile hücrelerin tekrar ve bir hücre sayacı kullanılarak, doğru hücre sayısını belirlemek. NOT: Tipik haliyle, oyuk başına 5000 hücre Test edilen bir çok hücre çizgileri boyunca küremsi oluşturulması için yeterlidir. Doğru doğru boyutlu karşılaştırmaları için tek bir hücre süspansiyonu olarak hücreleri saymak için önemlidir. </li><li> Soğuk ortam (4 ° C), 180 uL başına 5.000 hücre hücreleri seyreltilir. Not: tekrar oluşturulmuş temel membran matris bileşenlerinin eklenmesi negatif transfeksiyon verimini etkileyecek ve kullanılmadığı önerilir. Hücre hattı optimizasyonu küremsi oluşturulması kapasitesine teyit etmek ve yok etme yararı ekranına önce yapılmalıdır. </li><li> bir hazneye hücre süspansiyonu aktarın pipet karıştırın ve siRNA (2.1) önceden hazırlanmış ihtiva eden 96 oyuklu ultra düşük bağlanma plakanın her oyuğuna 180 uL ekleyin. </li><li> CentrifugE 10 dakika boyunca önceden soğutulmuş 4 ° C&#39;de santrifüj 1000 xg&#39;de levha ve daha sonra 37 ° C doku kültürü inkübatöründe geri dönün. </li><li> NOT: Hücreler kuyuların dibinde bir mozaik olarak görünecektir. Gelecek 12 üzerinde - 24 saat hücreleri tek bir küre oluşturmak için bir araya toplar. </li><li> 24 saat sonra, hücreler, kuyunun merkezinde tek sfero formu dikkate alınmalıdır. büyümeyi teşvik etmek için her bir tam ortam, 100 uL ekleyin. </li><li> Üç gün sonra ortam doldurun. Yavaşça her bir ortamdaki, 100 uL çıkarın ve taze ortam 100 uL ilave edin. </li><li> 7. günde, nicel zaman küremsi büyüme izleyebilir, bir plaka okuyucusu üzerinde otomatik küremsi boyutunu ölçmek (bakınız Bölüm 3). </li><li> Daha sonra, bir ışık saçan hücre canlılığı boya (Bakınız Bölüm 4) kullanılarak hücre canlılığı belirler. </li></ol> 3. Otomatik Resim Alma <ol><li> sitometresi 7. günde bir tezgah üstü, mikro-plaka görüntüleme plakaları tarayın. <ol> &lt;, &#39;96 Eh plaka &#39;uygun plaka türünü seçin ve bir deneme adı girin: li&gt; Aşağıdaki seçin yazılımını açın. NOT: Herhangi bir ek bilgi de yazılım içine eklenebilir. </li><li> &#39;Tumorsphere&#39; uygulamasını seçin. sfero odakta ve optimal kontrast, böylece odağı değiştirin. NOT: &#39;Görüntü tabanlı odak&#39; beklenen sfero boyutlarda olduğu gibi önemli değişiklikler önerilmektedir. </li><li> tarama ve &#39;Start taraması&#39; gerektiren kuyu seçin. </li><li> plaka tarayıcı yazılımı kullanarak, nesne maske doğru sfero boyutunu temsil eder emin olun. Koloni çapı, sınır dilatasyon, minimum kalınlık ve hassas ayarlarını ayarlayarak bunu yapın, her bir hücre hattına özgü 11,12 test etti. NOT: sfero alan daha sonra yazılım algoritması kullanılarak hesaplanır. Örneğin, doğru &#39;yüksek&#39; bir karşı hassasiyetini ayarlamak yedi gün için yetiştirilen BT474 sferoidler alanı hesaplamak içind 200 uM minimum koloni çapı ayarlayın. Bu sfero alanın uygun bir steoid maskesi temsilcisine üretmek gerekir. NOT: Bu veriler daha sonra açıklamalı veri dosyası biçiminde de ihracat işlevini kullanarak, makineden ihraç edilebilir. Tarih plaka medyan normalize, kombine ve sfero alan üzerinde istatistiksel olarak anlamlı bir etkisi vardı siRNA&#39;lar tespit edilmesi için analiz ya z-score veya kesinlikle standardize ortalama fark (SSMD) gereğidir. </li></ol></li></ol> 4. Hücre Canlılık Belirlenmesi <ol><li> sferoid alanı hesaplandıktan sonra, parlak bir canlılık hücre boya kullanılarak canlılık belirler. üreticinin talimatlarına göre reaktif hazırlayın. </li><li> Dikkatle her bir ortamdaki 100 uL kaldırmak ve canlılık boya 100 mcL ekleyin. 15 dakika boyunca plakalar daha sonra ışık yayma plaka okuyucusu kullanılarak tarama inkübe edin. NOT: Bu veriler daha sonra in, ihracat işlevini kullanarak, makineden ihraç edilebiliraçıklamalı veri dosyasının biçimi. Tarih plaka medyan normalize, kombine ve sfero canlılığı üzerinde istatistiksel olarak anlamlı bir etkisi vardı siRNA&#39;lar tespit edilmesi için analiz ya z-score veya kesinlikle standardize ortalama fark (SSMD) gereğidir. </li></ol>

<ol>
	<li>Seton-Rogers, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+the+ErbB2+receptor+and+transforming+growth+factor+beta+in+induction+of+migration+and+invasion+in+mammary+epithelial+cells.">Cooperation of the ErbB2 receptor and transforming growth factor beta in induction of migration and invasion in mammary epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (5), 1257-1262 (2004).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Chia, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+a+novel+hypoxia-regulated+marker,+carbonic+anhydrase+IX,+in+invasive+breast+carcinoma.">Prognostic significance of a novel hypoxia-regulated marker, carbonic anhydrase IX, in invasive breast carcinoma.</a> J Clin Oncol. 19 (16), 3660-3668 (2001).</li><li>Trastour, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1alpha+and+CA+IX+staining+in+invasive+breast+carcinomas:+prognosis+and+treatment+outcome.">HIF-1alpha and CA IX staining in invasive breast carcinomas: prognosis and treatment outcome.</a> Int J Cancer. 120 (7), 1451-1458 (2007).</li><li>Wilson, W. R., Hay, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+hypoxia+in+cancer+therapy.">Targeting hypoxia in cancer therapy.</a> Nat Rev Cancer. 11 (6), 393-410 (2011).</li><li>Ros, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+metabolic+screen+identifies+6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase+4+as+an+important+regulator+of+prostate+cancer+cell+survival.">Functional metabolic screen identifies 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 4 as an important regulator of prostate cancer cell survival.</a> Cancer Discov. 2 (4), 328-343 (2012).</li><li>Baenke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+identifies+MCT4+as+a+key+regulator+of+breast+cancer+cell+metabolism+and+survival.">Functional screening identifies MCT4 as a key regulator of breast cancer cell metabolism and survival.</a> J Pathol. 237 (2), 152-165 (2015).</li><li>Schug, Z. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-CoA+synthetase+2+promotes+acetate+utilization+and+maintains+cancer+cell+growth+under+metabolic+stress.">Acetyl-CoA synthetase 2 promotes acetate utilization and maintains cancer cell growth under metabolic stress.</a> Cancer Cell. 27 (1), 57-71 (2015).</li><li>Mashimo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+is+a+bioenergetic+substrate+for+human+glioblastoma+and+brain+metastases.">Acetate is a bioenergetic substrate for human glioblastoma and brain metastases.</a> Cell. 159 (7), 1603-1614 (2014).</li><li>Comerford, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+dependence+of+tumors.">Acetate dependence of tumors.</a> Cell. 159 (7), 1591-1602 (2014).</li><li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+tumor+spheroid+invasion+assay.">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> J Vis Exp. (99), e52686 (2015).</li><li>Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents.">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods Mol Biol. 986, 253-266 (2013).</li><li>Barretina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+Cell+Line+Encyclopedia+enables+predictive+modelling+of+anticancer+drug+sensitivity.">The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity.</a> Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).</li><li>Maguire, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SF3B1+mutations+constitute+a+novel+therapeutic+target+in+breast+cancer.">SF3B1 mutations constitute a novel therapeutic target in breast cancer.</a> J Pathol. 235 (4), 571-580 (2015).</li><li>Brough, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+viability+profiles+of+breast+cancer.">Functional viability profiles of breast cancer.</a> Cancer Discov. 1 (3), 260-273 (2011).</li><li>Ferber, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO3a+regulates+reactive+oxygen+metabolism+by+inhibiting+mitochondrial+gene+expression.">FOXO3a regulates reactive oxygen metabolism by inhibiting mitochondrial gene expression.</a> Cell Death Differ. 19 (6), 968-979 (2012).</li><li>Jensen, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO3A+promotes+metabolic+adaptation+to+hypoxia+by+antagonizing+Myc+function.">FoxO3A promotes metabolic adaptation to hypoxia by antagonizing Myc function.</a> EMBO J. 30 (22), 4554-4570 (2011).</li><li>Ivascu, A., Kubbies, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+cell-mediated+adhesions+in+breast+cancer+spheroids.">Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids.</a> Int J Oncol. 31 (6), 1403-1413 (2007).</li><li>Bitler, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethality+by+targeting+EZH2+methyltransferase+activity+in+ARID1A-mutated+cancers.">Synthetic lethality by targeting EZH2 methyltransferase activity in ARID1A-mutated cancers.</a> Nat Med. 21 (3), 231-238 (2015).</li><li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9.">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nat Biotechnol. 33 (4), 390-394 (2015).</li></ol>

Open Access fees were supported by Nexcelom Bioscience, LLC.

Kanser üç boyutlu modeller, giderek daha seçici bir şekilde kanser hücrelerini öldürmek için tasarlanmıştır bilinen ve yeni bileşiklerin etkisini değerlendirmek için kullanılmaktadırlar. Kanser hücresi sferoidler bu şekilde, 3D etkinliğe sahip bileşikler, in vivo koşullarında bir etkiye sahip olasılığı daha yüksek olan, in vivo olarak tümör karşılaşılanlardan daha benzer koşullar görüntüler yapılardır. Ancak, bu yöntemler kanser tedavisinde önemli etkiye sahip olabilir ilaç tasarımı konusu olmamıştır potansiyel yeni hedeflerin belirlenmesi için izin vermez. Biz kanser hücre hattı küresellerde yedi güne kadar dayanıklı gen susturma için izin verilen bir siRNA işlevsel genomik yaklaşım geliştirdi. siRNA ekranı uygulanmadan önce optimizasyon gerektirebilir protokole birçok kritik adım vardır. büyük ölçekte yeniden üretilebilir uygulanabilir küreler oluşturma yeteneğini gereklidir. Ayrıca,ppropriate transfeksiyon koşulları dikkatli bir optimize edilmelidir. Biz uygun olmayan hedefleme ile birkaç farklı transfeksiyon reaktifleri trialing ve ekran denemeden önce kontrol öldürme öneririz. Biz MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 ve JIMT1 siRNA transfeksiyon için uygun olan, yani, BT474 olan çeşitli sık kullanılan göğüs kanseri hücre çizgileri, gösterebilmişlerdir. Ayrıca, proof-of-prensibi BT474 sferoidler meme kanseri 200 en sık mutasyona uğramış genleri tarama verileri sağlamak, HER2 yükseltilmesi ve PIK3CA onkojenik mutasyonun olan bağımlılıklarını doğruladı. İlginç bir şekilde, transkripsiyon faktör FOXO3 susturulması sferoid boyutunda bir azalmaya ancak canlılığı üzerinde önemli bir etki ile sonuçlanmıştır. FOXO3 onların çevre 16 daha kolaylıkla uyum sağlayan kanser hücrelerinin metabolik kapasitesini değiştirmek, hipoksiyaya tepki düzenlediği bilinmektedir. ATP bolluğu algıladığı gibi bu rol potansiyel hücre canlılığı okuma olumsuz etkileyebilir, Hücre metabolizmasının ana ürünlerinden biri. Küremsi boyutunda bir azalma gözlenmesi destek olarak, HeLa FOXO3 bu susturulması tümör büyümesini engellediğini ve apoptosis 17 kaynaklı ksenograftlarının gösterilmiştir. Bazı genler yanlış pozitif sonuç verebilir kendi 3D mimarisi, korumak için kanser hücrelerinin kapasitesini etkileyebilir dikkat etmek önemlidir. Örneğin, E-kaderin demonte BT474 küremsi yapısının çözündü. Bu, daha önce e-Cadherin antikorlar 18 hedef kullanılarak rapor edilmişti. Herhangi bir tarama platformu olduğu gibi, potansiyel hedefler gözlenen etkinin tekrarlanabilirliği değerlendirmek için tekrar elenebilir edilmelidir. tekniği, siRNA aracılı gen demonte yani geçici doğası sınırlamalar vardır. susturma Sürekli daha uzun yedi gün siRNA ile elde değildi. Bu yaklaşımın avantajı, çeşitli başka biyomunun ile birleştirilebilir olmasıdırtric boyalar sadece sfero hipoksi mekansal bilgi veren ya da apoptoz geçiren hücrelerin izlenmesi, örneğin, sfero canlılığını değerlendirmek olanlar. plaka okuyucu taramaları nispeten hızlı ve non-invaziv çünkü Ayrıca, sfero boyutuna siRNA&#39;lar etkisi zamanla yerine sadece deneysel uç noktasında değerlendirilebilir. Nitekim, şu anda bizim tarama boru hattı olan bu caddeleri birkaç keşfediyoruz. yeni bağımlılıkları tespit etmek 3D kültürleri kullanan alternatif bir yaklaşım hedefleri veya proteinlerin, özellikle ailelerinin geniş bir yelpazesi, ya önleyen kimyasal kütüphanelerin kullanılmasıdır. Gerçekten de, Bitler ve diğ. yumurtalık berrak hücreli karsinom 19 ARID1A durumu ve EZH2 inhibitörleri arasında sentetik öldürücü etkileşimi tanımlamak için bu hedef yaklaşımı kullanılmıştır. CRISPR-Cas9 gen düzenleme teknolojisinin keşfinden da organoid kültürlerinde ve in vivo genetik ekranlar geliştirilmesi için izin vermektedir. Bununla birlikte, TOnun yaklaşımı uygun hayvan tesislerine sahip bağlıdır ve 20 fahiş mal olabilir. Sonuç olarak, biz bir protokol belirttiğimiz inanıyorum daha doğru modelleri yeni kanser hedefleri ya da kurulmuş hedeflerin sağlam doğrulama belirlenmesi için izin vivo tümör mikro özellikleri, oksijen ve besin gradyanlar. Ayrıca, protokol sferoidler oluşturur ve bu nedenle düzenli olarak yüksek verimli siRNA ekranlar için kanser araştırma eden kullanılabilen hücre çizgisinin her türlü uygulanabilir.

Solid tümörler başarıyla hastaları tedavi edememek önemli bir meydan okuma ile klinisyenlerin sunan önemli histolojik, genetik ve mikro-çevre içi tümör heterojenitesini, görüntüler. roman tanımlamak için kullanılan modellerin çoğunluğu tedavileri bu özelliklerin birçoğu dahil değil hedef. Gerçekten de, klinikte kullanılan mevcut hedeflenen tedavi, iki boyutlu (2D) kültür koşulları altında yetiştirilir kanser hücre hatları kullanan tarama yaklaşımı kullanılarak, son on yıl içinde geliştirilmiştir. Bu tür reseptör tirozin kinaz inhibitörleri gibi çeşitli başarıları, hakkında getirmiş olmasına rağmen, kanser daha karmaşık modeller tam in vivo tümörogenez sürücü ve geçiş yapmak yeni tedaviler sayısını artırmak katkıda bulunan faktörlerin takdir için gerekli olduğunu belirgin hale gelmektedir klinik çalışmalarda, önceden klinik modelleri. Ayrıca, şimdi de 2B kültür sistemlerinde yansıtmak için başarısız olduğunu takdirdavranışı 1,2 vivo. Örneğin, zayıf vaskülarize tümörlerde mikro olan oksijen ve besin elde etmek için talep arz geçebilir olarak, yüksek ve düşük doğum bölgeleri geliştirir. Karbonik anhidraz IX (CAIX) olarak kurulan hipoksik belirteçleri tümör bölümlerinin imünohistokimyasal lekelenmesi ile tespit edilen tümör düşük oksijen (hipoksi) varlığı, meme kanseri daha kötü bir klinik sonuç 3,4 Böylece içeren özellikler gibi korelasyon tarama modellerine hipoksi in vivo daha etkili olacak yeni ilaç hedefleri keşfetmek için kapasitemizi artırmak olabilir. Nitekim, hipoksi ihtiva başarıyla hedefleyen agresif tümörler klinik öncelik 5&#39;tir. daha doğru bir şekilde tümörün mikro kanser hücreleri tarafından karşılaşılan koşullar elemanlarını özetlemek amacıyla geleneksel 2D siRNA tarama değiştiren, bir kaç genin tanımlanması inci yol açmıştırin vivo tümör büyümesi için önemli olduğu tespit edilmiştir. Bu düşük serum koşullarına 6, hipoksik koşullarda 7 altında ve kombinasyon 8 gerçekleştirilen fonksiyonel genomik ekranlar yer alıyor. Düşük serum yetiştirilen Örneğin, 6-fosfofrukto-2-kinazı / Fruktoz-2,6-bisfosfataz 4 (PFKFB4), karbon giren glikolizi düzenlenmesinden sorumlu bir protein susturulması, metastaza türetilmiş prostat kanser hücre apoptoza neden olmuştur. Aynı koşullar altında, normal prostat hücre hatlarında PFKFB4 susturulması ise PFKFB4 bölgesinin tüketimi, tam olarak, prostat kanseri hücre kuşağının büyümesinin 6 ksenogrefleri ablasyon, hiçbir etkisi yoktu. göğüs kanseri hücre çizgilerinin uzun bir panelinde, mono- karboksilaz taşıyıcı 4 (MCT4) susturulması, tercihen, düşük oksijen koşullarında hücre hattı büyüme azalmasına neden olmuştur. Bu güvenlik, meme kanseri hücre dizisi ortotrop xenogra in vivo olarak doğrulandıFTS. besin stres koşulları altında Belki de en çarpıcı, Asetil-CoA sentetazı 2 (ACSS2), asetil-CoA içine asetat dönüştürmekten sorumlu bir enzim susturma, indirgenmiş kanser hücre numarası (düşük oksijen ve serum), ancak, normal kültür koşulları altında çok az veya hiç etki 8. ACSS2 ablasyonu besin gradyanlar tümör mikroçevresinin içinde ve bu bölgelerde ikamet hücreler tümör ilerlemesi 8 için gerekli olduğu izole yoktur düşündürmektedir meme ve prostat kanseri xenogreftler büyümesini etkiledi. Ayrıca, ACSS2 da tümörlerinde artış ACSS2 aktivitesi olmayan koşullarda büyümesini destekleyen temel mekanizma olabileceğine işaret etmektedir, glioblastoma ve hepatoselüler karsinom 9,10 önemli olduğu bulunmuştur. Toplu olarak, bu çalışmalar, in vivo olarak karşılaşılan koşullar yansıtan ve siRNA ekranlar performans g saptanmasına olanak kanıtlamakKanser yaşam için gerekli enes. Yanı sıra besin stres koşulları altında 2B ve kanserli hücrelerin büyümesi etki olarak bu çalışmalar, hedef gen tükenmesi tümör ksenograftlarının 6,8 gözlenmiştir ne yansıtma, kanser hücre hattı sfero büyümesini inhibe etti. Böylece, kanser hücre hattı sferoidler ACSS2 susturulması duyarlılık kazandırmak tümör mikroçevresinde karşılaşılan durumların birkaç içerir. Gerçekten de, sferoidler besin gradyanlar (serum ve oksijen), pH değişiklikleri gösterir, üç boyutlu (3D) hücre-hücre teması hem de, hücre siklüs hapsine ve apoptozise hücre proliferatif sürat değişiklikler. Bu nekrotik bölgeler, kanser sferoidler varlığı ile tarif edilmektedir, özelliği geleneksel 2B kültür bulunamadı. Kanser hücresi sferoidler önce küçük molekül inhibitörleri taranması için daha fazla biyolojik ilgili model olarak kullanılmıştır, ancak bu, sadece bileşik, etkinlik doğrulanması veya kaçakları repurposing sağlar adresunds başlangıçta diğer hastalıklar 11 için tasarım. Mevcut sferoid tarama yöntemleri, yüksek içeriği şekilde bir yüksek verimlilik belirli bir gen tükenmesi analiz için izin yoktur. Burada, ilk kez tarif, kanser hücre hattı sferoidler küçük müdahale edici RNA (siRNA) teknolojisini kullanan spesifik gen bağımlılıkları ortaya çıkarılması için fonksiyonel genomik boru hattı. Biz insan meme kanserlerinde 200 en sık mutasyona uğramış genleri hedefleyen siRNA&#39;lar ile ısmarlama kütüphane tasarlanmış ve BT474 meme kanseri küresellerde sfero büyüklüğü ve metabolik aktivitesi üzerine gen tükenmesi etkisi değerlendirildi. Biz sağlam ve tekrarlanabilir ERBB2 ve PIK3CA 3D kültürlerde susturma etkisini tespit başardık. Ayrıca, biz immünhistokimya kullanarak BT474 sferoidler mekansal mimarisi üzerine gen tükenmesi etkisini değerlendirmek olabilir.

<table><tbody><tr><td>Lullaby</td><td>Oz Biosciences</td><td>LL70500&amp;nbsp;</td><td>lipid-based transfection reagent</td></tr><tr><td>Viromer</td><td>Lipocalyx</td><td>VB-01LB-01</td><td>virus-like polymer transfection reagent</td></tr><tr><td>Ultra-low attachment plate</td><td>Corning</td><td>CLS7007</td><td>96 well plate</td></tr><tr><td>Foil plate seals</td><td>ThermoFisher</td><td>AB-0626</td><td></td></tr><tr><td>Luminescent cell viability dye</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td>CellTitre-Glo</td></tr><tr><td>Pipette tips (200 &amp;#956;L)</td><td>Starlab</td><td>S1111-0806</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips (10 &amp;#956;L)</td><td>Starlab</td><td>S1111-3800</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips (1, 000 &amp;#956;L)</td><td>Starlab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.025</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (10 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.025</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (25 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1685.020</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Media</td><td>GIBCO</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>GIBCO</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>GIBCO</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Feta bovine serum</td><td>GIBCO</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>Cherry picked library</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counter</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Cell counting chamber slides</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Celigo S</td><td>Nexcelom</td><td>contact company</td><td></td></tr><tr><td>Victor X5</td><td>Perkin Elmer</td><td>contact company</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert Inverted brightfield microscope</td><td>Zeiss</td><td>contact company</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; Incubator</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mulitichannel pipette</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilizing functional genomics screening to identify potentially novel drug targets in cancer cell spheroid cultures

Kanserde fonksiyonel sürücü olayların tanımlanması yeni ilaç hedefleri nesil keşif için kanser biyolojisi anlayışımızı sürdürmek için merkez ve vazgeçilmezdir. Bu kanser daha karmaşık modeller in vivo tümörogenez sürücü ve klinik çalışmalar klinik öncesi modellerde geçiş yapmak yeni tedavilerin etkinliğini artırmak katkıda bulunan faktörlerin tam takdir için gerekli olduğunu belirgin hale gelmektedir. Burada siRNA fonksiyonel olan tarama işlemine tabi tutulabilir tip ve yeniden üretilebilir bir tümör parçacıklarının üretilmesi için bir yöntem sunulmuştur. Bu sferoidler klasik iki boyutlu kültüründe mevcut değildir katı tümörlerde bulunan birçok özellikleri gösterir. Bir çok yaygın olarak kullanılan bir meme kanseri hücre çizgileri bu protokol için uygun olduğunu göstermektedir. Ayrıca, proof-of-prensibi meme kanseri hücre hattı BT474 kullanan veri sağlamak, teyit onlarınfosfatidilinositol-4,5-bifosfat 3-kinaz (PIK3CA) epidermal büyüme faktörü reseptörü, HER2 ve mutasyon amplifikasyonu bağımlılık, tümör sferoidler olarak yetiştirilen. Son olarak, biz daha fazla araştırmak ve immünohistokimyasal kullanarak bu bağımlılıkları mekansal etkisini teyit edebiliyoruz.

Ultra-düşük bağlanma 96 oyuklu plakalar küremsi deneyler hali hazırda daha tümörlerin in vivo bulunan fizyolojik koşulları tekrarlar bir ortamda potansiyel onkojeniklik için yüksek verimli bir fenotipik değerlendirme sağlar. Gerçekten de, kanser hücre çizgileri MCF10DCIS.com ve BT474 bir şekilde sıkı bir sferoid yapılar (Şekil 1A) ve sferoid bölümlerin immünohistolojik araştırması, hücresel ve nükleer morfolojisinde belirgin bir mekansal değişiklikler gösterdi. Zamanla, örneğin BT474 küremsi gibi küremsi nekrotik bölgeler, agresif tümörlerin (Şekil 1B) ortak bir özelliği geliştirmek. Bazı sferoidler gibi MDA-MB-231 hücre hattı olarak nekrotik çekirdeği, geliştirmek, ancak ters yarılan caspsase-3 ifadesi, apoptoz bir belirteç (Şekil 1C) ile ilişkilidir proliferatif işaretleyici Ki67, ekran işaretli varyasyonu yapmıyoruz. birden çok hücre çizgileri gerçekten Recep olan kurmaksiRNA aracılı gen susturma BT474 için tive, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 ve JIMT1 hücreleri ters yedi gün siRNA ile transfekte edilmiştir. Test edilen tüm hücre hatları (Şekil 1D) &#39;de elzem genin Ubikuitin B (UBB) önemli ölçüde küremsi canlılığının susturma ise transfeksiyon (sahte) bir reaktif veya kontrol siRNA&#39;lar transfeksiyonu varlığı, sferoid ömrü üzerinde hiç bir etkisi olmamıştır. Biz seçilmemiş en sık mutasyona uğramış genleri, ER +, HER2 + ve üçlü negatif meme kanserleri kapsayan bir insan siRNA kütüphane olarak tasarlanmış. Bu kütüphane gibi myc PIK3CA ve TP53 olan ve katılım karsinoj oluşturulmamıştır gibi bilinen fonksiyon genleri içerir. Ekran aynı zamanda çeşitli sivil hedefleme kontrol siRNA&#39;lar içeren (Kontrol 1. Kontrol # 2) ve siRNA&#39;lar kontrolleri (Tablo 1) öldürme olarak hareket gibi PLK1 ve UBB gibi temel genleri, hedef. Biz meme CAnC kullanmayı tercihbunlar hali hazırda tekrar oluşturulmuş temel membran ilavesi olmaksızın parçacıklarının oluşturulması olarak ER hücre çizgileri, BT474, beygir hücre çizgileri kurulmuş ve bilinen bir genomik mimari sahiptir. Örneğin, BT474 hücrelerinin, östrojen reseptörü (ER +) için pozitif TP53 (E285K) ve PIK3CA (K111N) 13, insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2 +) ve liman mutasyonlar aşın. Yukarıda belirtilen protokolünü kullanan biz etki geni tükenmesi siRNA ters transfeksiyon yedi gün (Şekil 1 E) sonra, küremsi boyut ve canlılığı üzerindeki izledi. İlginç bir şekilde, genlerin büyük bir çoğunluğunun sferoid alan veya canlılığı (Şekil 2A) üzerinde önemli bir etkiye sahip değildi. FOXO3, PIK3CA, erbB2 ve SF3B1 bir susturma sferoid boyutunda en önemli tekrarlanabilir azalma ile sonuçlandı. Bu azalma, aynı zamanda erbB2 ve SF3B1 susturma sonra küremsi canlılığı gözlendi. Umut verici bir biz confPIK3CA, ErbB2 ve SF3B1 parlak alan mikroskopi (Şekil 2B) kullanılarak küremsi boyutuna susturma etkisi irmed. Daha önce bir çok hücre soyu modellerinde önemli bir gen olarak SF3B1 tanımlanabilir ve siSF3B1 UBB 14 ek olarak iyi bir öldürücü kontrol eder. İlginçtir, e-Cadherin tüm 200 genlerin sadece susturulması steoid canlılığı (Şekil 2A) önemli bir artışa yol açmıştır. Sfero morfoloji İncelenmesi E-Cadherin susturma canlı hücreler de düşük ekin altındaki (Şekil 2B) dinlenme ile, sfero mimarisinin tam bir dökümünü yol açtığını gösterdi. sfero hacmi ekran verilerinin Manuel Soruşturma, bu durum set boyutu sınırlamaları üzerinde olmasını nesneye de gözlenmiştir ama alan ölçümü elendiği olduğunu gösterdi. Daha önce belirtildiği gibi, BT474 hücrelerinin reseptör tirosin kinaz, HER2 fazla sentezleyen ve bir onkojenik mutasyonu<html> PIK3CA (K111N). Bu olmayan hedefleme kontroller ile transfeksiyon etkisi (Şekil 2C) vardı erbB2 ve PIK3CA bu susturulması, indirgenmiş küremsi canlılığı ile sonuçlanmıştır doğruladı. Sonraki biz sfero histoloji üzerinde siRNA tükenmesi etkisini araştırdık. BT474 sferoidler ters olmayan hedefleme kontrol siRNA ve siRNA&#39;lar PIK3CA, erbB2 ve UBB hedefleme ile transfekte edilmiştir. ErbB2 ve UBB bir susturma Ki67 siRNA (Şekil 2D) kontrol grubuna göre pro-proliferatif markörün bir azalma ile sonuçlanmıştır. pro-apoptotik markörün aktivasyon kaspaz-3, sadece apoptoz ile sonuçlanmamıştır HER2 ve PIK3CA tükenmesinin düşündürmektedir UBB susturma sonra gözlenen daha çok sitotoksik daha sitostatik idi ayrıldı. Gerçekten de, HER2 ve PIK3CA susturulması transfekte sferoidler kontrol ile karşılaştırıldığında hücre döngüsü tutuklama proteini p27 protein ifadesinde bir artışa neden etmedi. ent &quot;fo: keep-together.within sayfa =&quot; 1 &quot;&gt; Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar BT474 hücreleri onkojenik HER2 ve PIK3CA 3D sferoidler olarak büyüdüğü zaman sinyal tarafından tahrik olduğunu göstermektedir Daha da önemlisi, bu sonuçlar, mümkün olduğunu göstermektedir. tasarım ve sağlam ve tekrarlanabilir kanser hücre hattı sferoidler genlerin yüzlerce ısmarlama siRNA tarama kütüphanesi uygulamak. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54738/54738fig1.jpg" /> Şekil 1: 3 boyutlu Büyüme Hücre Hattı Optimizasyon. C. göğüs kanseri hücre çizgileri, MCF10DCIS.com ve BT474 7 gün, düşük bağlanma plakalarda kültürlenmiştir. Aydınlık Örnek görüntüler, bir ters mikroskop kullanılarak alınmıştır. Ölçek çubukları 100 mikron =. B. MCF10DCIS.com ve BT474 sferoidler 28 gün boyunca kültürlenmiştir. 4 gün - taze medya 100 uL her 3 doldurulan. Sferoidler% 3.8 formaldehit, e tespit edildimbedded, kesit ve hematoksilin ve eosin (H &amp; E) ile boyandı. Temsilcisi görüntüleri düşük ve yüksek büyütmede gösterilmiştir. Ölçek çubukları sırasıyla 100 mm ve 33 mm temsil etmektedir. C, MDA-MB-231 sferoidler 21 gün boyunca kültürlenmiştir. 4 gün - taze medya 100 uL her 3 doldurulan. Sferoidler,% 3.8 formaldehit sabit gömülü, Ki67 ile kesitli ve lekeli ve kaspaz-3 bölündü. Temsilcisi görüntüler gösterilir. Ölçek çubukları 100 mikron =. D. BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 ve JIMT1 hücre çizgileri ters mock (yalnızca transfeksiyon reaktifi) ve kontrol siRNA&#39;lar ve sürenin sonunda alıcı ile transfekte edildi, ultra düşük bağlanma Plakalar daha sonra küreler oluşturma döndürülmüştür. Taze ortam (100 uL) günde 1 ile 4, 7 gün sonra ilave edildi, hücre canlılığı nicelleştirilmiştir. Veriler 1. kontrol normalize üç kopya halinde gerçekleştirilmiş olan iki bağımsız biyolojik çoğaltır ± SD ortalamasını temsil etmektedir. İstatistiksel anlamlılık bir UNPA kullanılarak hesaplandıIRED Öğrenci t-testi (p &lt;0.05). E. işlevsel kanseri hücre dizisi parçacıklarının gen bağımlılık sorgulamak için kullanılabilir ters transfeksiyon protokolü özetleyen bir akış diyagramıdır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54738/54738fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54738/54738fig2.jpg" /> Şekil 2: BT474 küremsi Ortaya Onkogenik bağımlılıklar fonksiyonel genomik İncelenmesi. C. BT474 hücrelerinin ters üç kopya halinde 200 geni insan siGENOME siRNA kütüphanesi ile transfekte edilmiştir. Sferoid boyut ve canlılığı gözlendi. Ham veri değerleri plaka medyan normalize ve z skorları 1.7x daha fazla önemli outliers 15 medyan plaka standart sapma belirlemek için hesaplanmıştır idi. dış genleri Not ERBB2, SF3B1, PLK1 ve UBB böyle birnd e-cad. önemli ölçüde sfero alanı ve canlılığını artırılabilir veya azaltılabilir siRNA&#39;lar kırmızı kontrol siRNA &#39;s tasvir etmektedir, mavi ve kırmızı gölgeli. B. Hücreler ters olmayan hedefleme kontrolü, e-kaderin (E-CAD), PIK3CA, ErbB2 veya UBB siRNA ile transfekte edilmiş ve daha sonra sferoidler oluşturmak üzere bir ultra-düşük bağlanma plakasında döndürülmüştür. 7 gün sonra, Örnek sferoid ve görüntüler, bir ters mikroskop kullanılarak alınmıştır aydınlık. Ölçek çubukları 100 mikron =. Hücreler ters olmayan hedefleme kontrolü, PIK3CA, ErbB2 veya UBB siRNA ile transfekte edilmiş ve daha sonra sferoidler oluşturmak üzere bir ultra-düşük bağlanma plakasında döndürülmüştür. 7 gün sonra hücre canlılığı, nicelleştirilmiştir. Veriler 1. kontrol normalize üç kopya halinde gerçekleştirilmiş olan iki bağımsız biyolojik çoğaltır ± SD ortalamasını temsil etmektedir. İstatistiksel anlamlılık Eşleştirilmemiş Öğrenciler t-testi (p &lt;0.05) kullanılarak hesaplanmıştır. D. 7 gün sonra, sferoidler, sabit gömülmüş, parçalarına ayrılmış ve lekeliH &amp; E, Ki67, Cleaved Kaspaz-3 ve p27 için. Temsilcisi görüntüler gösterilir. Ölçek çubukları 100 mikron =. siControl küremsi H &amp; E nedeniyle boyanma için seçilen işleme ve bireysel sağlam küremsi bir eserin daha küçük görünür unutmayın. Ancak bu Taranan görüntülerin ve hücre canlılığı sonuçları ile gözlenen değişikliklerden olumsuz etkisi yok. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54738/54738fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1 Sigara hedefleme </td><td> TP53 </td><td> DST </td><td> KMT2C </td><td> İşlenmemiş 1 </td><td> FCGBP </td><td> ARID1B </td><td> FBXM7 </td><td> TTC40 </td><td> 2 Sigara hedefleme </td><td></td></tr><tr><td></td><td> GATA3 </td><td> TTN </td><td> MUC12 </td><td> MUC4 </td><td> AHNAK </td><td> HUWEI1 </td><td> DNAH11 </td><td> ITPR2 </td><td> ABCA13 </td><td> CREBBP </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MAP2K4 </td><td> PIK3CA </td><td> F5 </td><td> APOB </td><td> ANKRD30A </td><td> MUC17 </td><td> DNAH17 </td><td> LAMA2 </td><td> ACE </td><td> CSMD2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> STARD9 </td><td> USH2A </td><td> FAT3 </td><td> LPR2 </td><td> CSMD3 </td><td> MYO18B </td><td> DNAH5 </td><td> MDN1 </td><td> ARHGAP5 </td><td> DNAH9 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CXCR3 </td><td> MUC16 </td><td> RB1 </td><td> PKHD1L1 </td><td> DNAH2 </td><td> SYNE2 </td><td> DYNC1H1 </td><td> PCLO </td><td> CACNA1B </td><td> ERBB2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PLK1 </td><td> SYNE1 </td><td> Lyst </td><td> PTEN </td><td> SPTA1 </td><td> İşlenmemiş 2 </td><td> VHL </td><td> RYR1 </td><td> Col6A3 </td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1 Sigara hedefleme </td><td> Enam </td><td> RYR2 </td><td> BRCA2 </td><td> İşlenmemiş 1 </td><td> FMN2 </td><td> HECW1 </td><td> LAMB4 </td><td> Sİ </td><td> 2 Sigara hedefleme </td><td></td></tr><tr><td></td><td> FHOD3 </td><td> MACF1 </td><td> RYR3 </td><td> C2ORF16 </td><td> DMD </td><td> FRG1 </td><td> HERC2 </td><td> MYH11 </td><td> STAB1 </td><td> ZDBF2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> GOLGA6L2 </td><td> NEB </td><td> SMG1 </td><td> CACNA1E </td><td> DNA14 </td><td> GCC2 </td><td> HIVEP2 </td><td> NIPBL </td><td> TANC1 </td><td> ZNF536 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> HMCN1 </td><td> NF1 </td><td> UBR5 </td><td> CACNA1F </td><td> DYNC2H1 </td><td> GON4L </td><td> HYDIN </td><td> PKD1L1 </td><td> TF </td><td> ANK3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> HRNR </td><td> OBSCN </td><td> USP34 </td><td> CYMA5 </td><td> FAM208B </td><td> GPR112 </td><td> ITSN2 </td><td> RNF213 </td><td> TPR </td><td> ASPM </td><td></td></tr><tr><td></td&gt; <td> PLK1 </td><td> PCDH15 </td><td> XIRP2 </td><td> COL7A1 </td><td> FLG2 </td><td> İşlenmemiş 2 </td><td> VHL </td><td> SAGE1 </td><td> UNC80 </td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1 Sigara hedefleme </td><td> DCHS2 </td><td> MUC5B </td><td> ZFHX4 </td><td> İşlenmemiş 1 </td><td> MYO9A </td><td> SPHKAP </td><td> CXORF22 </td><td> NCOR1 </td><td> VPS13D </td><td></td></tr><tr><td></td><td&gt; ATR </td><td> DMXL2 </td><td> MXRA5 </td><td> ANK2 </td><td> KIAA1210 </td><td> PRUNE2 </td><td> TCHH </td><td> DANH6 </td><td> NOTCH2 </td><td> ANKRD12 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> BIRC6 </td><td> DNAH10 </td><td> TENM1 </td><td> ATM </td><td> lrp1 </td><td> SCN10A </td><td> VPS13C </td><td> DNAH7 </td><td> spen </td><td> C5ORF42 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CDH1 </td><td> DNAH3 </td><td> PEG3 </td><td> DIDO1 </td><td> MAP1A </td><td> SCN2A </td><td> IPTR3 </td><td> ERBB3 </td><td> SRRM2 </td><td> CCDC88A </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CUBN </td><td> NOCK11 </td><td> RELN </td><td> DNAH8 </td><td> MED12 </td><td> SHROOM2 </td><td> CEP350 </td><td> FAT4 </td><td> SZT2 </td><td> CHD4 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PLK1 </td><td> EYS </td><td> SACS </td><td> KIAA1109 </td><td> MED13 </td><td> İşlenmemiş 2 </td><td&gt; VHL </td><td> KMT2A </td><td> VPS13A </td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Sigara hedefleme </td><td> QSER1 </td><td> ARID1A </td><td> WDFY3 </td><td> İşlenmemiş 1 </td><td> SDK1 </td><td> TEX15 </td><td> LAMA1 </td><td></td><td> 2 Sigara hedefleme </td><td></td></tr><tr><td></td><td> COL14A1 </td><td> SHROOM3 </td><td> Ldşftkrd </td><td> EFCAB5 </td><td> SF3B1 </td><td> CBFB </td><td> AHNAK2 </td&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> CSMD1 </td><td> TBX3 </td><td> KIAA0947 </td><td> FOXA1 </td><td> ITPR1 </td><td> DDX3X </td><td> KIF4A </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> MEFV </td><td> UBR4 </td><td> MYCBP2 </td><td> INPPL1 </td><td> FLG </td><td> HECTD4 </td><td> FAT2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> MGAM </td><td> Vcan </td><td> NBEAL1 </td><td> MAP3K1 </td><td> AKAP9 </td><td> GPR98 </td><td> FOXO3 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> PLK1 </td><td> ZNF462 </td><td> SETX </td><td> NRP1 </td><td> HERC1 </td><td> İşlenmemiş 2 </td><td> VHL </td><td></td><td></td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1: Plaka Düzen ve İnsan siRNA Kütüphane De kıvrımlı. tablo ekranında kullanılan düşük bağlanma plakaları için siRNA havuzları ve düzeni her içeriğe sahip.

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures at JoVE.com

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

İşlevsel Genomik Tarama kullanılması Kanser Hücre Sfero Kültürleri Potansiyel Yeni İlaç Hedefleri Belirlemek İçin

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

utilizing-functional-genomics-screening-to-identify-potentially-novel

Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.3K Görüntüleme.  The Institute of Cancer Research. Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

Video: Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated cancer associated fibroblasts are a key component of the tumor stroma that interact with cancer cells and support their growth and survival. Models that recapitulate the interaction of cancer cells and activated fibroblasts are important tools for studying the stromal biology and for development of antitumor agents. Here, a method is described for the rapid generation of robust 3-dimensional (3D) spheroid co-culture of pancreatic cancer cells and activated pancreatic fibroblasts that can be used for subsequent biological studies. Additionally, described is the use of 3D spheroids in carrying out functional metabolic assays to probe cellular bioenergetics pathways using an extracellular flux analyzer paired with a spheroid microplate. Pancreatic cancer cells (Patu8902) and activated pancreatic fibroblast cells (PS1) were co-cultured and magnetized using a biocompatible nanoparticle assembly. Magnetized cells were rapidly bioprinted using magnetic drives in a 96 well format, in growth media to generate spheroids with a diameter ranging between 400-600 &#181;m within 5-7 days of culture. Functional metabolic assays using Patu8902-PS1 spheroids were then carried out using the extracellular flux technology to probe cellular energetic pathways. The method herein is simple, allows consistent generation of cancer cell-fibroblast spheroid co-cultures and can be potentially adapted to other cancer cell types upon optimization of the current described methodology.

Here, a method is described for the preparation of 3-dimensional (3D) spheroid co-culture of pancreatic cancer cells and fibroblasts, followed by measurement of metabolic functions using an extracellular flux analyzer.

Hazırlık ve pankreas kanseri hücreleri ve fibroblastlar 3 boyutlu küresel ortak kültürlerin metabolik tahlil

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Kanser Araştırmaları

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is exposed to in vivo. Solid tumors grow not as a sheet attached to plastic, but instead as a collection of clonal cells in a three-dimensional (3D) space interacting with their neighbors, and with distinct spatial properties such as the disruption of normal cellular polarity. These interactions cause 3D-cultured cells to acquire morphological and cellular characteristics which are more relevant to in vivo tumors. Additionally, a tumor mass is in direct contact with other cell types such as stromal and immune cells, as well as the extracellular matrix from all other cell types. The matrix deposited is comprised of macromolecules such as collagen and fibronectin.
In an attempt to increase the translation of research findings in oncology from bench to bedside, many groups have started to investigate the use of 3D model systems in their drug development strategies. These systems are thought to be more physiologically relevant because they attempt to recapitulate the complex and heterogeneous environment of a tumor. These systems, however, can be quite complex, and, although amenable to growth in 96-well formats, and some now even in 384, they offer few choices for large-scale growth and screening. This observed gap has led to the development of the methods described here in detail to culture tumor spheroids in a high-throughput capacity in 1536-well plates. These methods represent a compromise to the highly complex matrix-based systems, which are difficult to screen, and conventional 2D assays. A variety of cancer cell lines harboring different genetic mutations are successfully screened, examining compound efficacy by using a curated library of compounds targeting the Mitogen-Activated Protein Kinase or MAPK pathway. The spheroid culture responses are then compared to the response of cells grown in 2D, and differential activities are reported. These methods provide a unique protocol for testing compound activity in a high-throughput 3D setting.

Across a wide variety of disease indications, more physiologically relevant models are being developed and implemented into drug discovery programs. The new model system described here demonstrates how three-dimensional tumor spheroids can be cultured and screened in a high-throughput 1536-well plate-based system to search for new oncology drugs.

Yüksek işlem hacmi üç boyutlu tümör pulcuklarının nesil uyuşturucu taraması

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of anti-cancer therapeutics in a physiologically representative microenvironment. We outline the formation of patient derived cancer stem cell spheroids, as well as, the manipulation of these spheroids for thorough analysis following drug treatment. Specifically, we describe collection of spheroid morphology, proliferation, viability, drug toxicity, cell phenotype and cell localization data. This protocol focuses heavily on analysis techniques that are easily implemented using the 384-well hanging drop platform, making it ideal for high throughput drug screening. While we emphasize the importance of this model in ovarian cancer studies and cancer stem cell research, the 384-well platform is amenable to research of other cancer types and disease models, extending the utility of the platform to many fields. By improving the speed of personalized drug screening and the quality of screening results through easily implemented physiologically representative 3D cultures, this platform is predicted to aid in the development of new therapeutics and patient-specific treatment strategies, and thus have wide-reaching clinical impact.

This protocol describes generation of patient-derived spheroids, and downstream analysis including quantification of proliferation, cytotoxicity testing, flow cytometry, immunofluorescence staining and confocal imaging, in order to assess drug candidates&#8217; potential as anti-neoplastic therapeutics. This protocol supports precision medicine with identification of specific drugs for each patient and stage of disease.

Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

Hücre viability ve ölüm kanser hücrelerinin 3D Küroid kültürlerde değerlendirilmesi

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

İlaç test için bir sulu iki-fazlı bir sistem ile Cancer Celi sferoitlerin Robotik üretimi

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Biyomühendislik

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

Hasta Kaynaklı Tümör Örneklerinden 3 Boyutlu Sferoidlerin Oluşturulması ve İlaçlara Duyarlılıklarının Değerlendirilmesi

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the evaluation of anticancer drugs. However, the conventional culture methods lack the ability to manipulate the tumor spheroids in a homogeneous manner at the three-dimensional level. To address this limitation, in this paper, we present a convenient and effective method of constructing average-sized tumor spheroids. Additionally, we describe a method of image-based analysis using artificial intelligence-based analysis software that can scan the whole plate and obtain data on three-dimensional spheroids. Several parameters were studied. By using a standard method of tumor spheroid construction and a high-throughput imaging and analysis system, the effectiveness and accuracy of drug tests performed on three-dimensional spheroids can be dramatically increased.

This article demonstrates a standardized method for constructing three-dimensional tumor spheroids. A strategy for spheroid observation and image-based deep-learning analysis using an automated imaging system is also described.

İlaç Değerlendirme Çalışmaları için 3D Tümör Sferoidlerinin Üretimi

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

Tümörlerde Terapötik Hedefleri Belirlemek ve Karşılaştırmak için Genom Ölçeğinde Tarama

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome neurofibromatosis type 1 (NF1), MPNSTs are the most common malignancy and the leading cause of death. These rare and aggressive soft-tissue sarcomas offer a stark future, with 5-year disease-free survival rates of 34-60%. Treatment options for individuals with MPNSTs are disappointingly limited, with disfiguring surgery being the foremost treatment option. Many once-promising therapies such as tipifarnib, an inhibitor of Ras signaling, have failed clinically. Likewise, phase II clinical trials with erlotinib, which targets the epidermal growth factor (EFGR), and sorafenib, which targets the vascular endothelial growth factor receptor (VEGF), platelet-derived growth factor receptor (PDGF), and Raf, in combination with standard chemotherapy, have also failed to produce a response in patients. 
In recent years, functional genomic screening methods combined with genetic profiling of cancer cell lines have proven useful for identifying essential cytoplasmic signaling pathways and the development of target-specific therapies. In the case of rare tumor types, a variation of this approach known as cross-species comparative oncogenomics is increasingly being used to identify novel therapeutic targets. In cross-species comparative oncogenomics, genetic profiling and functional genomics are performed in genetically engineered mouse (GEM) models and the results are then validated in the rare human specimens and cell lines that are available. 
This paper describes how to identify candidate driver gene mutations in human and mouse MPNST cells using whole exome sequencing (WES). We then describe how to perform genome-scale shRNA screens to identify and compare critical signaling pathways in mouse and human MPNST cells and identify druggable targets in these pathways. These methodologies provide an effective approach to identifying new therapeutic targets in a variety of human cancer types.

Yazar Spotlight: Genom Ölçekli shRNA Ekranları Aracılığıyla Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümörü için Yeni Terapötik Hedefler Bulma 

We have developed a cross-species comparative oncogenomics approach utilizing genomic analyses and functional genomic screens to identify and compare therapeutic targets in tumors arising in genetically engineered mouse models and the corresponding human tumor type.

Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümörünün Fare Modellerinde Terapötik Hedefleri Belirlemek için Genetik Profilleme ve Genom Ölçeğinde Bırakma Taraması

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...

İşlevsel Genomik Tarama kullanılması Kanser Hücre Sfero Kültürleri Potansiyel Yeni İlaç Hedefleri Belirlemek İçin

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

PLAYLIST