Name: genome-wide determination of mammalian replication timing by dna content measurement
Uploaded: 2017-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement at JoVE.com

Biz rakamları oluşturmada yardım için Oriya Vardi teşekkür ederiz. BS grubunda çalışma, İsrail Bilim Vakfı (hibe No 567/10) ve Grant (# 281306) Başlangıç ​​Avrupa Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir.

Not: Şartname sadece büyüyor, eşitlenmemiş hücreler üzerinde ölçülebilir. Genellikle S fazında ~ 1 x 10 5 hücre neden olur 2 x 10 6 hızlı büyüyen hücreler, (oran sınırlayıcı adım) - prosedür en az 1 ile başlamalıdır. Iki ya da üç kez tekrarlanmış kullanılarak her bir deney için tavsiye edilir. CNR-ToR&#39;un tüm süreci bir hafta içinde tamamlanabilir - iki gün bir veya iki gün sıralama için gerekli olan ve ek bir gün ilk veri analizi için gerekli olan, kütüphane hazırlanmasına kadar tüm adımlar adanmış olmalıdır. Kültür hücreleri 1. Koleksiyonu NOT: protokolü (yaklaşık 2 içeren - 5 x 10 6 hücre) 10 cm&#39;lik plakalar kültür büyüyen hücreler için yazılmıştır, ancak kolayca diğer platformlara ayarlanabilir. <ol><li> süspansiyon içinde büyütüldü hücreler için, fiksasyon (bölüm 2) geçin. </li><li> Yapışık hücreler, aspirat ve pl yıkama içinCa 2+ ve Mg 2+ olmadan 3 ml PBS ile yedi. </li><li> PBS atın ve hücreler ayrılana kadar 1 ml ticari bir tripsin-EDTA ile 37 ° C &#39;de 5 dakika boyunca hücreler inkübe edin. Not: tripsin tedavi süresi, her hücre türü için ayarlanmalıdır. </li><li> Tripsin nötralize ve 15 ml konik tüp veya 5 ml polistiren tüp hücreleri toplamak için 3 ml kültür ortamı ekleyin. buz üzerinde tutun. </li></ol> 2. Sabitleme Not: Bu parça için, tüm adımlar 4 ° C&#39;de yapılmalıdır. <ol><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. </li><li> Aspire edin ve 1 ml soğuk PBS ile iki kez yıkama hücreleri. </li><li> 250 uL (toplam) soğuk PBS içinde süspanse edin hücreleri. </li><li> tüp hafifçe vorteks birlikte, yavaş yavaş Cı% 100 etanol -20 ° damla damla 800 mL ekleyin. % 80 - Bu 70 bir son etanol konsantrasyonu yol açar. NOT: Yüksek saflıkta etanol bu aşamada tavsiye edilir. </li><li> fo buz üzerinde inkübe hücreleriR 30 dk. NOT: Bu aşama, hücreler 4 ° C&#39;de ya da -20 ° C&#39;de bir kaç ay için bir kaç gün için muhafaza edilir ve bu da. </li></ol> 3. PI Boyama <ol><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 500 xg&#39;de hücreleri santrifüjleyin. </li><li> dikkatle süpernatant aspirat ve 1 ml soğuk PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. </li><li> Aspire, aşağıdaki karışım ile her bir örnek tekrar süspansiyon ve 1 ml PBS, 5 uL 10 mg / mL RnazA, 50 uL 1 mg / ml propidium iodide (PI, kullanımdan önce şişe karıştırıldı). ~ 2 x 10 6 hücre / ml) kadar konsantrasyonunu ayarlayın. NOT: Işık uzak tutun - PI duyarlı ışıktır. </li><li> 5 ml polistiren tüp 35 mikron örgü süzülmeye ve Parafilm ile yakın. </li><li> 30 dakika - 15, karanlıkta, oda sıcaklığında inkübe edin. NOT: Hücreler artık FACS analizi için hazırız. Gerekirse, lekeli hücreler, karanlıkta 4 ° C&#39;de en az 24 saat süre ile depolanabilir. </li></ol> 4. Sıralama <ol><li> FACS makinesi kullanılarak Sıralama hücreleri. Bizekendi PI yoğunluğuna dayalı hücreleri ayırt etmek için 561 nm lazer e. 488 nm veya 532 gibi 535 nm uyarma maksimum yakın diğer lazerler FACS makine konfigürasyonuna bağlı olarak kullanılabilir. </li><li> En iyi sonuçlar için, (çoğu hücreleri 85 mikron için) belirli bir hücre boyutu için önerilen en küçük meme kullanın. verim üzerinde saflık modları öncelik. 45 psi kılıf basıncı ile, genellikle yukarı 300-500 olaylar / s, sürekli yavaş akış kullanın. </li><li> Yolluk kullanarak, SSC vs FCS çizimi ile ölü hücreleri ve hücre içi enkaz (düşük FCS ve yüksek SSC) ayırt. PI-H (çiftli aynı H-değere sahip olacaktır vs canlı hücreler bir FSC-W FSC-H arsa vs ve PI W tarafından takip SSC-Genişlik (W) vs SSC-Boy (H) çizerek çiftleri ayırt ama daha büyük W-değer). canlı tek hücrelerin hücrelerin DNA içeriğini temsil eden PI-Alan (A) yoğunluk histogramı çizin. </li><li> Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, G1 ve S evreye kriteri hücreleri,. S Yolluk genişliğinde ve G1 yolluk dar ve bildiğim kadarıyla S mümkün olduğunca gerekirken, G1 ve G2 fazları davetsiz gerekir. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55157/55157fig1.jpg" /> Şekil 1. Hücre döngüsü faz belirleme PI yoğunluğuna göre. fare embriyonik fibroblast (MEF) nüfusun (PI-Alan ile ölçülen) hücresel DNA içeriğinin dağılımını gösteren histogram. Işaretlenmiş bölgeleri kullanılarak, 4N DNA muhtevasına) - DNA içeriği, iki alt-popülasyonları i) G1 hücreleri (2N DNA içeriği) ve ii) S fazı hücreleri (2N içine nüfus sıralamak için kullanılmaktadır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55157/55157fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> NOT: G1 hücreleri toplanması amacı farklı genomik bölgeler arasında sıralama verimliliği önyargıları hesaba etmektir. Alternatif uygulamaRoach, aynı hücre tipinden G1 tutuklandı hücreleri kullanmaktır. Bu yaklaşım temizleyici sonuçlar verir (o S fazı kontaminasyonu minimize beri) ama tutuklandı hücreleri ve ölçülen hücreler arasındaki genetik farklılıklardan kaynaklanan önyargıları tanıtmak olabilir. <ol start="5"><li> soğuk koşullarda sıralama ve 1.5 / 2 ml tüpler içine sıralanan hücreleri toplamak. sıralama aşağıdaki buz üzerinde tüpler tutun. Not: 4 ° C&#39;de 18 ° C&#39;de 3 saat - 1 -% 5 BSA, DNA kurtarma geliştirmek için, düşük bağlanma tüpleri kullanmak için ya da 4 ile kaplanmış tüpler kullanımı daha iyidir. </li></ol> 5. DNA Saflaştırma <ol><li> Her bir örnek (G1 ve G) için bir DNA saflaştırma kiti kullanılarak DNA arındırmak. Not: ticari kit kullanılarak üreticinin tavsiye ettiği gibi, yüksek verim için 2 ml tüp içine 400 uL yıkama tamponu ile yıkayın. </li><li> fluorometreyle DNA konsantrasyonu kontrol edin. NOT: FACS tarafından toplanan 100.000 memeli hücrelerden, bir DNA ~ 1 mikrogram almalısınız. birt Bu aşamada DNA 4 ° C&#39;de veya uzun depolama için -20 ° C&#39;de birkaç gün muhafaza edilebilir. </li></ol> 6. Sonication <ol><li> kullanılan manyetik standı ile uyumlu olan bir 1.7 mL tüp içine DNA transferi. </li><li> manyetik bir stand kullanılarak üreticinin talimatlarına göre 2x SPRI boncuklar kullanılarak DNA Konsantre ve 50 uL yıkama tamponu içinde elüte. </li><li> 250 bp bir ortalama hedef pik boyutuna odaklanmış ultrasonikatör yamultma DNA. 50 uL DNA örneği için aşağıdaki ayarları kullanın: 50 W,% 20 Duty faktörü, patlama başına 200 Cycles, 20 ° C, 120 s. </li><li> elektroforez ile kesilmiş DNA boyutunu kontrol edin. ~ 250 bp bir zirve ile 700 bp - önerilen boyut dağılımı 200. NOT: Bu aşama, DNA, 4 ° C&#39;de veya uzun depolama için -20 ° C&#39;da bir kaç gün için muhafaza edilir ve bu da. </li></ol> 7. Kütüphane Hazırlık ve Sıralama NOT: farklı Birçok kütüphane hazırlık setleri veent sıralama platformları malzemeler bölümünde bizim tarafımızdan kullanılan ve söz konusu olanları benzer şekilde çalışması gerekir. Aslında, geçmişte, Tanımı harita mikrodizi platformları 2 ile çok benzer bir metot kullanılarak elde edildi. <ol><li> herhangi bir ticari kütüphane hazırlık kiti kullanılarak kütüphaneleri hazırlayın. </li><li> 800 bp - kütüphane hazırlık sonunda, 300 manyetik boncuklar kullanılarak boyutunu seçin. </li><li> kütüphaneler hazırladıktan sonra, fluorometreyle DNA konsantrasyonu ölçmek. </li><li> elektroforezi kullanılarak DNA boyutunu ölçmek. </li><li> Herhangi bir platformda sıralama yapın. Not: Ardışık en az 10 m önerilir numune başına okur. Bu derinlik okuma yaklaşık her 300 bp (3 ~ için Gb boyutu genomu) eşdeğerdir ve 50 çözünürlükte Tanımı ölçümleri için yeterlidir - 100 kb. pencere boyutunda bir azalmaya neden olur derinliği artırılması ve böylece daha yüksek bir kesinlikle çözünürlüğünü artırma sağlayacaktır. Eşli uç sıralama gerekli değildirSadece kapsama bilgi beri bu protokol toplanır. Ancak, tekrar eden diziler içeren okur yerini çözümünde yardımcı olabilir. </li></ol> 8. Analiz NOT: Veri analizi A. Koren ve arkadaşları tarafından kullanılan yönteme dayanmaktadır. 19. <ol><li> bowtie2 ya da herhangi bir güvenilir kısa okumak hizalama kullanılarak ilgili genom Harita dizi verileri. değişen boyutu, 200 kapsamına giren kesimlerine eşit kapsama kromozomal pencereler G1 fraksiyonunda okur tanımlayın ve saymak S fazı aynı pencerelerde okur. </li><li> her pencere için S / G1 oranını hesaplayın. Bu genom (Şekil 3) boyunca S / G1 oranında büyük dalgalanmalar bir harita oluştursun. Tanımı ölçümlerin güvenilirliği için iyi bir denetim çok düz olmalıdır (G1 iki ayrı ölçümlerinden) G1 / G1 oranına Bu haritayı karşılaştırmaktır. </li><li> 0 veriler ortalama normalleştirmek ve her v çıkarılarak 1 SD(X kromozomu hariç) ve tüm pencereleri S / G1 standart sapma ile sonuçları bölünmesi tüm pencerelerin ortalama değerini Alue. Bu z skorları dönüştürmek ve farklı deneyler arasında karşılaştırma sağlamak amacıyla yapılır. </li><li> UCSC genom tarayıcısı yanı sıra 15&#39;den az veri pencereler içeren kalan her arası boşluk fragmanı listelenen tüm boşluk bölgeleri çıkarın. </li><li> 10 bir parametre ile Matlab fonksiyonu csaps üzerinden kübik yumuşatma eğri kalan parçaları Düzgün - 16 ve ayar noktaları her 100 kb enterpolasyon. NOT: yumuşatma ve interpolasyon parametreleri veri derinliğine göre ayarlanmalıdır. Diğer uygun düzeltme yöntemleri ve işlevleri vardır ve kullanılabilir. </li><li> görsel olarak her çoğaltmak güvenilirliğini onayladıktan sonra, tüm okur birleştirme ve bu verilere yukarıda açıklanan aynı işlemi gerçekleştirerek daha derin bir çözünürlük profili hesaplar. </li></ol>

<ol>
	<li>Farkash-Amar, S., Simon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+the+replication+program+in+mammals.">Genome-wide analysis of the replication program in mammals.</a> Chromosome Res. 18 (1), 115-125 (2010).</li><li>Yaffe, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+DNA+replication+timing+reveals+conserved+large-scale+chromosomal+architecture.">Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture.</a> PLoS Genet. 6 (7), e1001011 (2010).</li><li>Hiratani, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reorganization+of+replication+domains+during+embryonic+stem+cell+differentiation.">Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation.</a> PLoS Biol. 6 (10), (2008).</li><li>Rivera-Mulia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+replication+timing+and+gene+expression+during+lineage+specification+of+human+pluripotent+stem+cells.">Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells.</a> Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).</li><li>Ryba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+developmental+control+of+replication-timing+domains+in+pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia.">Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia.</a> Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).</li><li>Farkash-Amar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+organization+of+replication+time+zones+of+the+mouse+genome.">Global organization of replication time zones of the mouse genome.</a> Genome Res. 18 (10), 1562-1570 (2008).</li><li>Koren, A., McCarroll, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+replication+of+the+inactive+X+chromosome.">Random replication of the inactive X chromosome.</a> Genome Res. 24 (1), 64-69 (2014).</li><li>Mukhopadhyay, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+genome-wide+profiling+in+human+primary+erythroblasts+reveal+replication+program+organization.">Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization.</a> PLoS Genet. 10 (5), e1004319 (2014).</li><li>McNairn, A. J., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenomic+replication:+linking+epigenetics+to+DNA+replication.">Epigenomic replication: linking epigenetics to DNA replication.</a> Bioessays. 25 (7), 647-656 (2003).</li><li>Sima, J., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+correlations:+replication+timing+and+mutational+landscapes+during+cancer+and+genome+evolution.">Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution.</a> Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).</li><li>Kenigsberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mutation+spectrum+in+genomic+late+replication+domains+shapes+mammalian+GC+content.">The mutation spectrum in genomic late replication domains shapes mammalian GC content.</a> Nucleic Acids Res. 44 (9), 4222-4232 (2016).</li><li>Woo, Y. H., Li, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+timing+and+selection+shape+the+landscape+of+nucleotide+variation+in+cancer+genomes.">DNA replication timing and selection shape the landscape of nucleotide variation in cancer genomes.</a> Nat Commun. 3, 1004 (2012).</li><li>Liu, L., De, S., Michor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+timing+and+higher-order+nuclear+organization+determine+single-nucleotide+substitution+patterns+in+cancer+genomes.">DNA replication timing and higher-order nuclear organization determine single-nucleotide substitution patterns in cancer genomes.</a> Nat Commun. 4, 1502 (2013).</li><li>Goren, A., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicating+by+the+clock.">Replicating by the clock.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 25-32 (2003).</li><li>Selig, S., Okumura, K., Ward, D. C., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineation+of+DNA+replication+time+zones+by+fluorescence+in+situ+hybridization.">Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization.</a> EMBO J. 11 (3), 1217-1225 (1992).</li><li>Smith, L., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+replicating+timing+combined+with+fluorescent+in+situ+hybridization.">Chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization.</a> J Vis Exp. (70), e4400 (2012).</li><li>Simon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asynchronous+replication+of+imprinted+genes+is+established+in+the+gametes+and+maintained+during+development.">Asynchronous replication of imprinted genes is established in the gametes and maintained during development.</a> Nature. 401 (6756), 929-932 (1999).</li><li>Phi-Wilson, J. T., Recktenwald, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coating+agents+for+cell+recovery.">Coating agents for cell recovery.</a> Google Patents. , (1993).</li><li>Koren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+relationship+of+DNA+replication+timing+to+different+forms+of+human+mutation+and+variation.">Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation.</a> Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).</li><li>Rhind, N., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+timing.">DNA replication timing.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).</li><li>Koren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+human+DNA+replication+timing.">Genetic variation in human DNA replication timing.</a> Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

CNR-Tanımı (Rhind N. ve Gilbert DM 20 tarafından incelenmiştir) S FACS ve G1 aşamaları ile ayrılabilir bir ökaryotik proliferatif hücre popülasyonu ilke olarak gerçekleştirilebilir. Burada tarif edilen yöntem, insan ve fare gibi ~ 3 Gb bir genom boyutuna sahip memeli hücrelerine ayarlanmıştır. (Hücre hazırlama ve dizileme derinliğinde) CNR-tor protokol küçük değişiklikler ökaryotlarda için ayarlamak için, ihtiyaç vardır. bu hız sınırlayıcı bir adımdır çünkü...

Memeli DNA replikasyonu, hücre döngüsü sırasında tam olarak bir kez her kromozomun tam çoğaltma sağlamak için sıkıca düzenlenir. Çoğaltma oldukça düzenlenmiş sıraya göre gerçekleşir - Birden fazla büyük genomik bölgeler (~ Mb) diğer genomik bölgelerde orta ya da geç S fazı (orta ve geç kopyalayan etki) daha sonra çoğaltmak ise 1 (erken etki kopyalayan) S fazına başında çoğaltırlar. Genomun 50%, kanser dönüşüm 5 içinde farklılaşması 3, 4 sırasında ve daha az bir ölçüde, dokular 2 arasındaki ToR&#39;u bilgileri - genomunun en% 30 ise, tüm dokulardan (yapıcı Tanımı etki) aynı anda çoğaltır . Ayrıca, bazı genomik bölge senkronize olmayan bir 6, 7, 8, yani bir fark vardır çoğaltmaiki allel arasındaki Tanımında. Tanımı transkripsiyon seviyeleri, GC içeriği, kromatin durum, genin yoğunluk, vb 1, 9 da dahil olmak üzere pek çok genomik ve Epigenomik özellikleri ile ilişkilidir. Tanımı mutasyon oranları ve tip 10, 11 ve bu nedenle şaşırtıcı olmayan ilişkili, çoğaltma programı pertürbasyonlar kanseri 12, 13 ile bağlantılıdır. Şartname ve kromatin yapısı arasındaki nedensel ilişki henüz anlaşılamamıştır. Açık kromatin erken çoğaltma kolaylaştırır mümkündür. Bununla birlikte, alternatif bir model, 14 kromatin çoğaltma sırasında bir araya getirilen ve farklı bir kromatin başlangıçta mevcut düzenleyiciler ve S fazında kurşun ucu erken ve geç replike bölgeleri 1 ambalajını diferansiyel düşündürmektedir </sup&gt;. Son zamanlarda Tanımı genomik bölgelerden 11 oluşur mutasyon tipini etkileyerek GC içeriğine şekiller göstermiştir. In situ hibridizasyon (FISH) floresan bağımsız lokuslar Tor ölçmek için ana yöntem. Tek FISH sinyallerini genel belirli bir alel 15, 16 çifti arasında bir yüzdesini sergiler S fazı hücrelerin yüzdesi sayarak basit gerçekleştirilir. Alternatif bir yöntem, S boyunca çoklu zaman noktaları DNA içeriğine göre olan hücreler, sıralama BrdU DNA etiketleme BrdU içeren DNA immüno-çökeltilmesinin ve qPCR 17, çökelen DNA bolluk kontrol darbe oluşur. Genomik Tanımı eşleme iki yöntemle elde edilebilir. İlk yöntem, yukarıda tarif edilen BrdU-IP tabanlı yöntemin genomik versiyonu olduğu bir miktarının ölçümüHer fraksiyonda Çökelen DNA mikrodizilerinin melezleştirme yoluyla tüm genom ya da derin dizilemesi ile eş zamanlı olarak yapılır. İkinci yöntem, CNR-tor G1 hücrelerdeki DNA içeriği ile S fazı hücreleri ve normalize her genomik bölgenin kopya sayısını ölçülmesi esasına dayanır. Bu yöntemde, hücreler, replike olmayan (G1 fazı) ve replike (S fazı) grupları (Şekil 1) içine FACS ile sıralanır. G1 Hücreler tüm genomik bölgelerde aynı kopya sayısını ve böylece onların DNA içeriği aynı olmalıdır. Öte yandan, S DNA kopya sayısı Geç replike bölgeleri dolayısıyla DNA içeriği olacak hücrelerin çoğunda yapılmamış tekrarlanıp değil ise, erken replike bölgeler çok hücre replikasyonu yapılmış ve bu nedenle DNA içeriği iki olduğundan, Şartname bağlıdır G1 hücre edilene benzer. Bu nedenle DNA içeriği G1 oranı S Şartname göstergesidir. Her bir genomik bölge için DNA miktarı ile hibridizasyon yoluyla ölçülürmikroarrayler veya derin sıralama 2, 8 ile. CNR-Şartname yöntemin avantajları daha ayrıntılı olarak ele alınacaktır. Şekil 2&#39;de tarif edildiği gibi, kağıt genomik Tanımı eşleme CNR-tor yöntemi tarif etmektedir. Kağıt sonuçlarının temel analiz ve genomik Şartname haritalarının oluşturulması kadar hücrelerin toplanması kadar tüm sürecin ince ayrıntıları anlatılır. Bu yazıda anlatılan protokol başarıyla kültüründe yetişen çeşitli hücre tipleri üzerinde yapılmıştır. Bu protokolün gelecek iyileştirmeler in vivo ToR&#39;un haritalama ve nadir hücre tiplerinde yol açabilir.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>BI (Biological Industries)</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>BI (Biological Industries)</td><td>03-052-1B</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap&amp;nbsp;</td><td>BD-Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Gadot</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RNAse-A 10 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>R4875</td><td></td></tr><tr><td>Propidiom iodide 1 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Parafilm</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL DNA LoBind Eppendorf tubes&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL MaxyClear tube&amp;nbsp;</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>magnetic beads - Agencourt AMPure XP&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonicator</td><td>Covaris</td><td>M-series&amp;nbsp; -530092</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;micro;L microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6 x 16 mm</td><td>Covaris</td><td>520096</td><td></td></tr><tr><td>Qubit fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis 2200 Tape station system</td><td>Agilent</td><td>D1000 ScreenTape</td><td></td></tr><tr><td>Seqeuncing - Illumina NextSeq system</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1001</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy kit for DNA purification</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>PureProteom Magnetic Stand</td><td>Millipore</td><td>LSKMAGS08</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BrdU/FITC</td><td>DAKO</td><td>F7210</td><td></td></tr><tr><td>FACS sorter</td><td>BD</td><td>FACSARIA III</td><td></td></tr><tr><td>FACS software</td><td>BD</td><td>FACSDiva v 8.0.1</td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide determination of mammalian replication timing by dna content measurement

genomun replikasyonu, DNA kopyalama doğruluğunu sağlayan bir yüksek ölçüde düzenlenmiş bir işlemde, hücre döngüsünün S fazında oluşur. Her genomik bölge çoğaltma birden kökenleri eşzamanlı aktivasyonu yoluyla S fazında belirgin bir anda çoğaltılır. çoğaltma (İş Tanımı) Zaman birçok genomik ve epigenetik özellikleri ile ilişkilidir ve mutasyon oranları ve kanser ile bağlantılıdır. Sağlıkta ve hastalıkta, çoğaltma programın tam genomik görünümü kavramak önemli bir gelecek hedefi ve mücadeledir. , Memeli hücrelerinin genomu geniş Tanımı eşleştirmek için basit bir yaklaşım: Bu makalede ayrıntılı olarak (CNR-İş Tanımı burada denir) yöntemini &quot;Çoğaltma genomik Zaman haritalama için S / G1 Kopya sayısı Oranı&quot; açıklar. yöntem S fazı hücreleri ve G1 faz hücreleri arasındaki kopya sayısı farklılıklara dayanmaktadır. CNR-tor yöntemi 6 adımda gerçekleştirilir: propidyum iyodür (PI) hücre ve boyama hazırlanması 1.; 2. Sorting G1 ve sıralama floresan aktive hücre kullanılarak S fazı hücreleri (FACS); 3. DNA saflaştırılması; 4. Sonication; 5. Kütüphane hazırlık ve sıralama; ve 6. Biyoinformatik analizi. CNR-Şartname yöntemi ayrıntılı çoğaltma haritalarda sonuçlanan hızlı ve kolay bir yaklaşımdır.

Tipik Tanımı harita fare embriyonik fibroblastlar için Şekil 3 (MEF&#39;ler) &#39;de gösterilmiştir. gösterir çünkü bu rakam analiz sürecini gösteren bireysel pencereler (adım 8.3) için normalize S / G1 oranı olan noktalar, yanı sıra kübik yumuşatma ve enterpolasyon (adım 8.5) sonucunda oluşan çizgidir. i) erken aynı anda (TO = sabit Tanımı bölgeler) çoğaltmak bir megabase sırasın...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement at JoVE.com

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

DNA İçerik Ölçüm tarafından Memeli Çoğaltma Zamanlama genom Tayini

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

genome-wide-determination-mammalian-replication-timing-dna-content

Research

JoVE Journal

Genetics

8.4K Görüntüleme.  Hebrew University of Jerusalem. We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Video: Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have been directed toward elucidation of the location and timing of initiation of genome duplication rather than its completion. However, it is critical that we understand regions of the genome that are last to complete replication, because these regions suffer elevated levels of chromosomal breakage and mutation, and they have been associated with both disease and aging. Here we describe how we have extended a technique that has been used to monitor replication initiation to instead identify those regions of the genome last to complete replication. This approach is based on a combination of flow cytometry and high throughput sequencing. Although this report focuses on the application of this technique to yeast, the approach can be used with any cells that can be sorted in a flow cytometer according to DNA content.

We describe a technique for combining flow cytometry and high throughput sequencing to identify late replicating regions of the genome.

G2-seq: geç genom bölgelerinde çoğaltma tanımlamak için bir yüksek işlem hacmi-dayandırılmış tekniği

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

Genetik

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Biyoloji

<meta charset="utf8"></head><body>DNA Replikasyonu ve Çatal Durma Olaylarını Analiz Etmek için 2D Jel Elektroforezi

Electrophoretic Analysis of Replication Through Structure-Prone DNA Repeats Within the SV40-Based Human Episome

Two-dimensional neutral/neutral gel-electrophoresis (2DGE) emerged as a benchmark technique to analyze DNA replication through natural impediments. This protocol describes how to analyze replication fork progression through structure-prone, expandable DNA repeats within the simian virus 40 (SV40)-based episome in human cells. In brief, upon plasmid transfection into human cells, replication intermediates are isolated by the modified Hirt protocol and treated with the DpnI restriction enzyme to remove non-replicated DNA. Intermediates are then digested by appropriate restriction enzymes to place the repeat of interest within the origin-distal half of a 3-5 kb-long DNA fragment. The replication intermediates are separated into two perpendicular dimensions, first by size and then by shape. Following Southern blot hybridization, this approach allows researchers to observe fork stalling at various structure-forming repeats on the descending half of the replication Y-arc. Furthermore, this positioning of the stall site allows the visualization of various outcomes of repeat-mediated fork stalling, such as fork reversal, the advent of a converging fork, and recombinational fork restart.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Gündemi: Replikasyon Çatalı Durma ve Genişleme Mekanizmalarını Ortaya Çıkarmak için Patojenik Tekrarların DNA Replikasyonunu Karakterize Etme

Here, we outline the procedure for analyzing replication progression through pathogenic, structure-prone repeats using 2-dimensional gel electrophoresis.

SV40 Tabanlı İnsan Epizomu İçinde Yapıya Eğilimli DNA Tekrarları Yoluyla Replikasyonun Elektroforetik Analizi

Two-dimensional neutral/neutral gel-electrophoresis (2DGE) emerged as a benchmark technique to analyze DNA replication through natural impediments. This ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Proximity Ligation Assay to Study Oncogene-Derived Transcription-Replication Conflicts

Both DNA replication and RNA transcription utilize genomic DNA as their template, necessitating spatial and temporal separation of these processes. Conflicts between the replication and transcription machinery, termed transcription-replication conflicts (TRCs), pose a considerable risk to genome stability, a critical factor in cancer development. While several factors regulating these collisions have been identified, pinpointing primary causes remains difficult due to limited tools for direct visualization and clear interpretation. In this study, we directly visualize TRCs using a proximity ligation assay (PLA), leveraging antibodies specific to PCNA and phosphorylated CTD of RNA polymerase II. This approach allows precise measurement of TRCs between replication and transcription processes mediated by RNA polymerase II. The method is further enhanced through DNA primers conjugated covalently to these antibodies, coupled with PCR amplification using fluorescent probes, providing a highly sensitive and specific means of detecting endogenous TRCs. Fluorescence microscopy enables the visualization of these conflicts, offering a powerful tool to study genome instability mechanisms associated with cancer. This technique addresses the gap in direct TRC visualization, allowing for a more comprehensive analysis and understanding of the underlying processes driving genome instability in cells.

Here, we present a sensitive and specific method to detect oncogene-induced transcription-replication conflicts (TRCs) using the proximity ligation assay (PLA). This approach leverages specific antibodies targeting PCNA and phospho-CTD RNAPII, enabling the assessment of TRC prevalence between RNA polymerase II transcription and DNA replication machinery.

Onkogenden Kaynaklı Transkripsiyon-Replikasyon Çatışmalarını İncelemek için Yakınlık Ligasyon Testi

Both DNA replication and RNA transcription utilize genomic DNA as their template, necessitating spatial and temporal separation of these processes. ...

Kanser Araştırmaları

<meta charset="utf8"></head><body>ssDNA-RPA Yolu Büyümesi ile Gözlenen CMG Aracılı DNA Çözülmesi

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Tek Moleküllü Görselleştirme Yoluyla Ökaryotik DNA Replikasyonunun Dinamiklerini Çözme

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

DNA İçerik Ölçüm tarafından Memeli Çoğaltma Zamanlama genom Tayini

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

G2-seq: geç genom bölgelerinde çoğaltma tanımlamak için bir yüksek işlem hacmi-dayandırılmış tekniği

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

SV40 Tabanlı İnsan Epizomu İçinde Yapıya Eğilimli DNA Tekrarları Yoluyla Replikasyonun Elektroforetik Analizi

SV40 Tabanlı İnsan Epizomu İçinde Yapıya Eğilimli DNA Tekrarları Yoluyla Replikasyonun Elektroforetik Analizi

SV40 Tabanlı İnsan Epizomu İçinde Yapıya Eğilimli DNA Tekrarları Yoluyla Replikasyonun Elektroforetik Analizi

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

Onkogenden Kaynaklı Transkripsiyon-Replikasyon Çatışmalarını İncelemek için Yakınlık Ligasyon Testi

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi