Biz rakamları oluşturmada yardım için Oriya Vardi teşekkür ederiz. BS grubunda çalışma, İsrail Bilim Vakfı (hibe No 567/10) ve Grant (# 281306) Başlangıç ​​Avrupa Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir.

Not: Şartname sadece büyüyor, eşitlenmemiş hücreler üzerinde ölçülebilir. Genellikle S fazında ~ 1 x 10 5 hücre neden olur 2 x 10 6 hızlı büyüyen hücreler, (oran sınırlayıcı adım) - prosedür en az 1 ile başlamalıdır. Iki ya da üç kez tekrarlanmış kullanılarak her bir deney için tavsiye edilir. CNR-ToR&#39;un tüm süreci bir hafta içinde tamamlanabilir - iki gün bir veya iki gün sıralama için gerekli olan ve ek bir gün ilk veri analizi için gerekli olan, kütüphane hazırlanmasına kadar tüm adımlar adanmış olmalıdır. Kültür hücreleri 1. Koleksiyonu NOT: protokolü (yaklaşık 2 içeren - 5 x 10 6 hücre) 10 cm&#39;lik plakalar kültür büyüyen hücreler için yazılmıştır, ancak kolayca diğer platformlara ayarlanabilir. <ol><li> süspansiyon içinde büyütüldü hücreler için, fiksasyon (bölüm 2) geçin. </li><li> Yapışık hücreler, aspirat ve pl yıkama içinCa 2+ ve Mg 2+ olmadan 3 ml PBS ile yedi. </li><li> PBS atın ve hücreler ayrılana kadar 1 ml ticari bir tripsin-EDTA ile 37 ° C &#39;de 5 dakika boyunca hücreler inkübe edin. Not: tripsin tedavi süresi, her hücre türü için ayarlanmalıdır. </li><li> Tripsin nötralize ve 15 ml konik tüp veya 5 ml polistiren tüp hücreleri toplamak için 3 ml kültür ortamı ekleyin. buz üzerinde tutun. </li></ol> 2. Sabitleme Not: Bu parça için, tüm adımlar 4 ° C&#39;de yapılmalıdır. <ol><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. </li><li> Aspire edin ve 1 ml soğuk PBS ile iki kez yıkama hücreleri. </li><li> 250 uL (toplam) soğuk PBS içinde süspanse edin hücreleri. </li><li> tüp hafifçe vorteks birlikte, yavaş yavaş Cı% 100 etanol -20 ° damla damla 800 mL ekleyin. % 80 - Bu 70 bir son etanol konsantrasyonu yol açar. NOT: Yüksek saflıkta etanol bu aşamada tavsiye edilir. </li><li> fo buz üzerinde inkübe hücreleriR 30 dk. NOT: Bu aşama, hücreler 4 ° C&#39;de ya da -20 ° C&#39;de bir kaç ay için bir kaç gün için muhafaza edilir ve bu da. </li></ol> 3. PI Boyama <ol><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 500 xg&#39;de hücreleri santrifüjleyin. </li><li> dikkatle süpernatant aspirat ve 1 ml soğuk PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. </li><li> Aspire, aşağıdaki karışım ile her bir örnek tekrar süspansiyon ve 1 ml PBS, 5 uL 10 mg / mL RnazA, 50 uL 1 mg / ml propidium iodide (PI, kullanımdan önce şişe karıştırıldı). ~ 2 x 10 6 hücre / ml) kadar konsantrasyonunu ayarlayın. NOT: Işık uzak tutun - PI duyarlı ışıktır. </li><li> 5 ml polistiren tüp 35 mikron örgü süzülmeye ve Parafilm ile yakın. </li><li> 30 dakika - 15, karanlıkta, oda sıcaklığında inkübe edin. NOT: Hücreler artık FACS analizi için hazırız. Gerekirse, lekeli hücreler, karanlıkta 4 ° C&#39;de en az 24 saat süre ile depolanabilir. </li></ol> 4. Sıralama <ol><li> FACS makinesi kullanılarak Sıralama hücreleri. Bizekendi PI yoğunluğuna dayalı hücreleri ayırt etmek için 561 nm lazer e. 488 nm veya 532 gibi 535 nm uyarma maksimum yakın diğer lazerler FACS makine konfigürasyonuna bağlı olarak kullanılabilir. </li><li> En iyi sonuçlar için, (çoğu hücreleri 85 mikron için) belirli bir hücre boyutu için önerilen en küçük meme kullanın. verim üzerinde saflık modları öncelik. 45 psi kılıf basıncı ile, genellikle yukarı 300-500 olaylar / s, sürekli yavaş akış kullanın. </li><li> Yolluk kullanarak, SSC vs FCS çizimi ile ölü hücreleri ve hücre içi enkaz (düşük FCS ve yüksek SSC) ayırt. PI-H (çiftli aynı H-değere sahip olacaktır vs canlı hücreler bir FSC-W FSC-H arsa vs ve PI W tarafından takip SSC-Genişlik (W) vs SSC-Boy (H) çizerek çiftleri ayırt ama daha büyük W-değer). canlı tek hücrelerin hücrelerin DNA içeriğini temsil eden PI-Alan (A) yoğunluk histogramı çizin. </li><li> Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, G1 ve S evreye kriteri hücreleri,. S Yolluk genişliğinde ve G1 yolluk dar ve bildiğim kadarıyla S mümkün olduğunca gerekirken, G1 ve G2 fazları davetsiz gerekir. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55157/55157fig1.jpg" /> Şekil 1. Hücre döngüsü faz belirleme PI yoğunluğuna göre. fare embriyonik fibroblast (MEF) nüfusun (PI-Alan ile ölçülen) hücresel DNA içeriğinin dağılımını gösteren histogram. Işaretlenmiş bölgeleri kullanılarak, 4N DNA muhtevasına) - DNA içeriği, iki alt-popülasyonları i) G1 hücreleri (2N DNA içeriği) ve ii) S fazı hücreleri (2N içine nüfus sıralamak için kullanılmaktadır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55157/55157fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> NOT: G1 hücreleri toplanması amacı farklı genomik bölgeler arasında sıralama verimliliği önyargıları hesaba etmektir. Alternatif uygulamaRoach, aynı hücre tipinden G1 tutuklandı hücreleri kullanmaktır. Bu yaklaşım temizleyici sonuçlar verir (o S fazı kontaminasyonu minimize beri) ama tutuklandı hücreleri ve ölçülen hücreler arasındaki genetik farklılıklardan kaynaklanan önyargıları tanıtmak olabilir. <ol start="5"><li> soğuk koşullarda sıralama ve 1.5 / 2 ml tüpler içine sıralanan hücreleri toplamak. sıralama aşağıdaki buz üzerinde tüpler tutun. Not: 4 ° C&#39;de 18 ° C&#39;de 3 saat - 1 -% 5 BSA, DNA kurtarma geliştirmek için, düşük bağlanma tüpleri kullanmak için ya da 4 ile kaplanmış tüpler kullanımı daha iyidir. </li></ol> 5. DNA Saflaştırma <ol><li> Her bir örnek (G1 ve G) için bir DNA saflaştırma kiti kullanılarak DNA arındırmak. Not: ticari kit kullanılarak üreticinin tavsiye ettiği gibi, yüksek verim için 2 ml tüp içine 400 uL yıkama tamponu ile yıkayın. </li><li> fluorometreyle DNA konsantrasyonu kontrol edin. NOT: FACS tarafından toplanan 100.000 memeli hücrelerden, bir DNA ~ 1 mikrogram almalısınız. birt Bu aşamada DNA 4 ° C&#39;de veya uzun depolama için -20 ° C&#39;de birkaç gün muhafaza edilebilir. </li></ol> 6. Sonication <ol><li> kullanılan manyetik standı ile uyumlu olan bir 1.7 mL tüp içine DNA transferi. </li><li> manyetik bir stand kullanılarak üreticinin talimatlarına göre 2x SPRI boncuklar kullanılarak DNA Konsantre ve 50 uL yıkama tamponu içinde elüte. </li><li> 250 bp bir ortalama hedef pik boyutuna odaklanmış ultrasonikatör yamultma DNA. 50 uL DNA örneği için aşağıdaki ayarları kullanın: 50 W,% 20 Duty faktörü, patlama başına 200 Cycles, 20 ° C, 120 s. </li><li> elektroforez ile kesilmiş DNA boyutunu kontrol edin. ~ 250 bp bir zirve ile 700 bp - önerilen boyut dağılımı 200. NOT: Bu aşama, DNA, 4 ° C&#39;de veya uzun depolama için -20 ° C&#39;da bir kaç gün için muhafaza edilir ve bu da. </li></ol> 7. Kütüphane Hazırlık ve Sıralama NOT: farklı Birçok kütüphane hazırlık setleri veent sıralama platformları malzemeler bölümünde bizim tarafımızdan kullanılan ve söz konusu olanları benzer şekilde çalışması gerekir. Aslında, geçmişte, Tanımı harita mikrodizi platformları 2 ile çok benzer bir metot kullanılarak elde edildi. <ol><li> herhangi bir ticari kütüphane hazırlık kiti kullanılarak kütüphaneleri hazırlayın. </li><li> 800 bp - kütüphane hazırlık sonunda, 300 manyetik boncuklar kullanılarak boyutunu seçin. </li><li> kütüphaneler hazırladıktan sonra, fluorometreyle DNA konsantrasyonu ölçmek. </li><li> elektroforezi kullanılarak DNA boyutunu ölçmek. </li><li> Herhangi bir platformda sıralama yapın. Not: Ardışık en az 10 m önerilir numune başına okur. Bu derinlik okuma yaklaşık her 300 bp (3 ~ için Gb boyutu genomu) eşdeğerdir ve 50 çözünürlükte Tanımı ölçümleri için yeterlidir - 100 kb. pencere boyutunda bir azalmaya neden olur derinliği artırılması ve böylece daha yüksek bir kesinlikle çözünürlüğünü artırma sağlayacaktır. Eşli uç sıralama gerekli değildirSadece kapsama bilgi beri bu protokol toplanır. Ancak, tekrar eden diziler içeren okur yerini çözümünde yardımcı olabilir. </li></ol> 8. Analiz NOT: Veri analizi A. Koren ve arkadaşları tarafından kullanılan yönteme dayanmaktadır. 19. <ol><li> bowtie2 ya da herhangi bir güvenilir kısa okumak hizalama kullanılarak ilgili genom Harita dizi verileri. değişen boyutu, 200 kapsamına giren kesimlerine eşit kapsama kromozomal pencereler G1 fraksiyonunda okur tanımlayın ve saymak S fazı aynı pencerelerde okur. </li><li> her pencere için S / G1 oranını hesaplayın. Bu genom (Şekil 3) boyunca S / G1 oranında büyük dalgalanmalar bir harita oluştursun. Tanımı ölçümlerin güvenilirliği için iyi bir denetim çok düz olmalıdır (G1 iki ayrı ölçümlerinden) G1 / G1 oranına Bu haritayı karşılaştırmaktır. </li><li> 0 veriler ortalama normalleştirmek ve her v çıkarılarak 1 SD(X kromozomu hariç) ve tüm pencereleri S / G1 standart sapma ile sonuçları bölünmesi tüm pencerelerin ortalama değerini Alue. Bu z skorları dönüştürmek ve farklı deneyler arasında karşılaştırma sağlamak amacıyla yapılır. </li><li> UCSC genom tarayıcısı yanı sıra 15&#39;den az veri pencereler içeren kalan her arası boşluk fragmanı listelenen tüm boşluk bölgeleri çıkarın. </li><li> 10 bir parametre ile Matlab fonksiyonu csaps üzerinden kübik yumuşatma eğri kalan parçaları Düzgün - 16 ve ayar noktaları her 100 kb enterpolasyon. NOT: yumuşatma ve interpolasyon parametreleri veri derinliğine göre ayarlanmalıdır. Diğer uygun düzeltme yöntemleri ve işlevleri vardır ve kullanılabilir. </li><li> görsel olarak her çoğaltmak güvenilirliğini onayladıktan sonra, tüm okur birleştirme ve bu verilere yukarıda açıklanan aynı işlemi gerçekleştirerek daha derin bir çözünürlük profili hesaplar. </li></ol>

<ol>
	<li>Farkash-Amar, S., Simon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+the+replication+program+in+mammals.">Genome-wide analysis of the replication program in mammals.</a> Chromosome Res. 18 (1), 115-125 (2010).</li><li>Yaffe, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+DNA+replication+timing+reveals+conserved+large-scale+chromosomal+architecture.">Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture.</a> PLoS Genet. 6 (7), e1001011 (2010).</li><li>Hiratani, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reorganization+of+replication+domains+during+embryonic+stem+cell+differentiation.">Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation.</a> PLoS Biol. 6 (10), (2008).</li><li>Rivera-Mulia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+replication+timing+and+gene+expression+during+lineage+specification+of+human+pluripotent+stem+cells.">Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells.</a> Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).</li><li>Ryba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+developmental+control+of+replication-timing+domains+in+pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia.">Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia.</a> Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).</li><li>Farkash-Amar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+organization+of+replication+time+zones+of+the+mouse+genome.">Global organization of replication time zones of the mouse genome.</a> Genome Res. 18 (10), 1562-1570 (2008).</li><li>Koren, A., McCarroll, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+replication+of+the+inactive+X+chromosome.">Random replication of the inactive X chromosome.</a> Genome Res. 24 (1), 64-69 (2014).</li><li>Mukhopadhyay, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+genome-wide+profiling+in+human+primary+erythroblasts+reveal+replication+program+organization.">Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization.</a> PLoS Genet. 10 (5), e1004319 (2014).</li><li>McNairn, A. J., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenomic+replication:+linking+epigenetics+to+DNA+replication.">Epigenomic replication: linking epigenetics to DNA replication.</a> Bioessays. 25 (7), 647-656 (2003).</li><li>Sima, J., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+correlations:+replication+timing+and+mutational+landscapes+during+cancer+and+genome+evolution.">Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution.</a> Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).</li><li>Kenigsberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mutation+spectrum+in+genomic+late+replication+domains+shapes+mammalian+GC+content.">The mutation spectrum in genomic late replication domains shapes mammalian GC content.</a> Nucleic Acids Res. 44 (9), 4222-4232 (2016).</li><li>Woo, Y. H., Li, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+timing+and+selection+shape+the+landscape+of+nucleotide+variation+in+cancer+genomes.">DNA replication timing and selection shape the landscape of nucleotide variation in cancer genomes.</a> Nat Commun. 3, 1004 (2012).</li><li>Liu, L., De, S., Michor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+timing+and+higher-order+nuclear+organization+determine+single-nucleotide+substitution+patterns+in+cancer+genomes.">DNA replication timing and higher-order nuclear organization determine single-nucleotide substitution patterns in cancer genomes.</a> Nat Commun. 4, 1502 (2013).</li><li>Goren, A., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicating+by+the+clock.">Replicating by the clock.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 25-32 (2003).</li><li>Selig, S., Okumura, K., Ward, D. C., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineation+of+DNA+replication+time+zones+by+fluorescence+in+situ+hybridization.">Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization.</a> EMBO J. 11 (3), 1217-1225 (1992).</li><li>Smith, L., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+replicating+timing+combined+with+fluorescent+in+situ+hybridization.">Chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization.</a> J Vis Exp. (70), e4400 (2012).</li><li>Simon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asynchronous+replication+of+imprinted+genes+is+established+in+the+gametes+and+maintained+during+development.">Asynchronous replication of imprinted genes is established in the gametes and maintained during development.</a> Nature. 401 (6756), 929-932 (1999).</li><li>Phi-Wilson, J. T., Recktenwald, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coating+agents+for+cell+recovery.">Coating agents for cell recovery.</a> Google Patents. , (1993).</li><li>Koren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+relationship+of+DNA+replication+timing+to+different+forms+of+human+mutation+and+variation.">Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation.</a> Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).</li><li>Rhind, N., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+timing.">DNA replication timing.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).</li><li>Koren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+human+DNA+replication+timing.">Genetic variation in human DNA replication timing.</a> Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

CNR-Tanımı (Rhind N. ve Gilbert DM 20 tarafından incelenmiştir) S FACS ve G1 aşamaları ile ayrılabilir bir ökaryotik proliferatif hücre popülasyonu ilke olarak gerçekleştirilebilir. Burada tarif edilen yöntem, insan ve fare gibi ~ 3 Gb bir genom boyutuna sahip memeli hücrelerine ayarlanmıştır. (Hücre hazırlama ve dizileme derinliğinde) CNR-tor protokol küçük değişiklikler ökaryotlarda için ayarlamak için, ihtiyaç vardır. bu hız sınırlayıcı bir adımdır çünkü...

Memeli DNA replikasyonu, hücre döngüsü sırasında tam olarak bir kez her kromozomun tam çoğaltma sağlamak için sıkıca düzenlenir. Çoğaltma oldukça düzenlenmiş sıraya göre gerçekleşir - Birden fazla büyük genomik bölgeler (~ Mb) diğer genomik bölgelerde orta ya da geç S fazı (orta ve geç kopyalayan etki) daha sonra çoğaltmak ise 1 (erken etki kopyalayan) S fazına başında çoğaltırlar. Genomun 50%, kanser dönüşüm 5 içinde farklılaşması 3, 4 sırasında ve daha az bir ölçüde, dokular 2 arasındaki ToR&#39;u bilgileri - genomunun en% 30 ise, tüm dokulardan (yapıcı Tanımı etki) aynı anda çoğaltır . Ayrıca, bazı genomik bölge senkronize olmayan bir 6, 7, 8, yani bir fark vardır çoğaltmaiki allel arasındaki Tanımında. Tanımı transkripsiyon seviyeleri, GC içeriği, kromatin durum, genin yoğunluk, vb 1, 9 da dahil olmak üzere pek çok genomik ve Epigenomik özellikleri ile ilişkilidir. Tanımı mutasyon oranları ve tip 10, 11 ve bu nedenle şaşırtıcı olmayan ilişkili, çoğaltma programı pertürbasyonlar kanseri 12, 13 ile bağlantılıdır. Şartname ve kromatin yapısı arasındaki nedensel ilişki henüz anlaşılamamıştır. Açık kromatin erken çoğaltma kolaylaştırır mümkündür. Bununla birlikte, alternatif bir model, 14 kromatin çoğaltma sırasında bir araya getirilen ve farklı bir kromatin başlangıçta mevcut düzenleyiciler ve S fazında kurşun ucu erken ve geç replike bölgeleri 1 ambalajını diferansiyel düşündürmektedir </sup&gt;. Son zamanlarda Tanımı genomik bölgelerden 11 oluşur mutasyon tipini etkileyerek GC içeriğine şekiller göstermiştir. In situ hibridizasyon (FISH) floresan bağımsız lokuslar Tor ölçmek için ana yöntem. Tek FISH sinyallerini genel belirli bir alel 15, 16 çifti arasında bir yüzdesini sergiler S fazı hücrelerin yüzdesi sayarak basit gerçekleştirilir. Alternatif bir yöntem, S boyunca çoklu zaman noktaları DNA içeriğine göre olan hücreler, sıralama BrdU DNA etiketleme BrdU içeren DNA immüno-çökeltilmesinin ve qPCR 17, çökelen DNA bolluk kontrol darbe oluşur. Genomik Tanımı eşleme iki yöntemle elde edilebilir. İlk yöntem, yukarıda tarif edilen BrdU-IP tabanlı yöntemin genomik versiyonu olduğu bir miktarının ölçümüHer fraksiyonda Çökelen DNA mikrodizilerinin melezleştirme yoluyla tüm genom ya da derin dizilemesi ile eş zamanlı olarak yapılır. İkinci yöntem, CNR-tor G1 hücrelerdeki DNA içeriği ile S fazı hücreleri ve normalize her genomik bölgenin kopya sayısını ölçülmesi esasına dayanır. Bu yöntemde, hücreler, replike olmayan (G1 fazı) ve replike (S fazı) grupları (Şekil 1) içine FACS ile sıralanır. G1 Hücreler tüm genomik bölgelerde aynı kopya sayısını ve böylece onların DNA içeriği aynı olmalıdır. Öte yandan, S DNA kopya sayısı Geç replike bölgeleri dolayısıyla DNA içeriği olacak hücrelerin çoğunda yapılmamış tekrarlanıp değil ise, erken replike bölgeler çok hücre replikasyonu yapılmış ve bu nedenle DNA içeriği iki olduğundan, Şartname bağlıdır G1 hücre edilene benzer. Bu nedenle DNA içeriği G1 oranı S Şartname göstergesidir. Her bir genomik bölge için DNA miktarı ile hibridizasyon yoluyla ölçülürmikroarrayler veya derin sıralama 2, 8 ile. CNR-Şartname yöntemin avantajları daha ayrıntılı olarak ele alınacaktır. Şekil 2&#39;de tarif edildiği gibi, kağıt genomik Tanımı eşleme CNR-tor yöntemi tarif etmektedir. Kağıt sonuçlarının temel analiz ve genomik Şartname haritalarının oluşturulması kadar hücrelerin toplanması kadar tüm sürecin ince ayrıntıları anlatılır. Bu yazıda anlatılan protokol başarıyla kültüründe yetişen çeşitli hücre tipleri üzerinde yapılmıştır. Bu protokolün gelecek iyileştirmeler in vivo ToR&#39;un haritalama ve nadir hücre tiplerinde yol açabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="615">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">PBS</td>
			<td style="width:157px;">BI (Biological Industries)</td>
			<td style="width:119px;">02-023-1A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>BI (Biological Industries)</td>
			<td>03-052-1B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15ml conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430790</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5ml Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap&#160;</td>
			<td>BD-Falcon</td>
			<td align="right">352235</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>64-17-5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse-A 10mg/ml</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R4875</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propidiom iodide 1mg/ml</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">parafilm</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM-996</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5ml DNA LoBind Eppendorf tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right">22431021</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.7ml MaxyClear tube&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnetic beads - Agencourt AMPure XP&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>M-series&#160; -530092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 &#181;l microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6x16mm</td>
			<td>Covaris</td>
			<td align="right">520096</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrophoresis.2200 Tape station system</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>D1000 ScreenTape</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seqeuncing - Illumina NextSeq system</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dneasy kit for DNA purification</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">69504</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureProteom Magnetic Stand</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>LSKMAGS08</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-BrdU/FITC</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>F7210</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSARIA III</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS software</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSDiva v 8.0.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide determination of mammalian replication timing by dna content measurement

genomun replikasyonu, DNA kopyalama doğruluğunu sağlayan bir yüksek ölçüde düzenlenmiş bir işlemde, hücre döngüsünün S fazında oluşur. Her genomik bölge çoğaltma birden kökenleri eşzamanlı aktivasyonu yoluyla S fazında belirgin bir anda çoğaltılır. çoğaltma (İş Tanımı) Zaman birçok genomik ve epigenetik özellikleri ile ilişkilidir ve mutasyon oranları ve kanser ile bağlantılıdır. Sağlıkta ve hastalıkta, çoğaltma programın tam genomik görünümü kavramak önemli bir gelecek hedefi ve mücadeledir. , Memeli hücrelerinin genomu geniş Tanımı eşleştirmek için basit bir yaklaşım: Bu makalede ayrıntılı olarak (CNR-İş Tanımı burada denir) yöntemini &quot;Çoğaltma genomik Zaman haritalama için S / G1 Kopya sayısı Oranı&quot; açıklar. yöntem S fazı hücreleri ve G1 faz hücreleri arasındaki kopya sayısı farklılıklara dayanmaktadır. CNR-tor yöntemi 6 adımda gerçekleştirilir: propidyum iyodür (PI) hücre ve boyama hazırlanması 1.; 2. Sorting G1 ve sıralama floresan aktive hücre kullanılarak S fazı hücreleri (FACS); 3. DNA saflaştırılması; 4. Sonication; 5. Kütüphane hazırlık ve sıralama; ve 6. Biyoinformatik analizi. CNR-Şartname yöntemi ayrıntılı çoğaltma haritalarda sonuçlanan hızlı ve kolay bir yaklaşımdır.

Tipik Tanımı harita fare embriyonik fibroblastlar için Şekil 3 (MEF&#39;ler) &#39;de gösterilmiştir. gösterir çünkü bu rakam analiz sürecini gösteren bireysel pencereler (adım 8.3) için normalize S / G1 oranı olan noktalar, yanı sıra kübik yumuşatma ve enterpolasyon (adım 8.5) sonucunda oluşan çizgidir. i) erken aynı anda (TO = sabit Tanımı bölgeler) çoğaltmak bir megabase sırasın...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement at JoVE.com

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

DNA İçerik Ölçüm tarafından Memeli Çoğaltma Zamanlama genom Tayini

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

genome-wide-determination-mammalian-replication-timing-dna-content

Research

JoVE Journal

Genetics

8.4K Görüntüleme.  Hebrew University of Jerusalem. We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Video: Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

Edu Boyama tarafından Drosophila Yetişkin Yumurtalıkların Mitokondriyal DNA replikasyonu Yerinde Etiketlenmesi içinde

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Genetik

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Kaplama DNA sentezinin kinetiği<em&gt; İn Vitro</em&gt; Bakteriyofaj T7 çoğaltma Proteinler tarafından

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions of chromatin. These regions represent regulatory DNA elements (e.g., promoters, enhancers, locus control regions, insulators) to which transcription factors bind. Mapping the accessible chromatin landscape is a powerful approach for uncovering active regulatory elements across the genome. This information serves as an unbiased approach for discovering the network of relevant transcription factors and mechanisms of chromatin structure that govern gene expression programs. ATAC-seq is a robust and sensitive alternative to DNase I hypersensitivity analysis coupled with next-generation sequencing (DNase-seq) and formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE-seq) for genome-wide analysis of chromatin accessibility and to the sequencing of micrococcal nuclease-sensitive sites (MNase-seq) to determine nucleosome positioning. We present a detailed ATAC-seq protocol optimized for human primary immune cells i.e. CD4+ lymphocytes (T helper 1 (Th1) and Th2 cells). This comprehensive protocol begins with cell harvest, then describes the molecular procedure of chromatin tagmentation, sample preparation for next-generation sequencing, and also includes methods and considerations for the computational analyses used to interpret the results. Moreover, to save time and money, we introduced quality control measures to assess the ATAC-seq library prior to sequencing. Importantly, the principles presented in this protocol allow its adaptation to other human immune and non-immune primary cells and cell lines. These guidelines will also be useful for laboratories which are not proficient with next-generation sequencing methods.

Assay for Transposase-Accessible Chromatin coupled with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a genome-wide method to uncover accessible chromatin. This is a step-by-step ATAC-seq protocol, from molecular to the final computational analysis, optimized for human lymphocytes (Th1/Th2). This protocol can be adopted by researchers without prior experience in next-generation sequencing methods.

Birincil insan T lenfositler tarafından ataç-Seq genom genelinde erişilebilir Kromatin eşleme

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ours, have demonstrated that quiescence is associated with widespread changes in gene expression. Some of these changes occur through changes in the level or activity of proliferation-associated transcription factors, such as E2F and MYC. We have demonstrated that mRNA decay can also contribute to changes in gene expression between proliferating and quiescent cells. In this protocol, we describe the procedure for establishing proliferating and quiescent cultures of human dermal foreskin fibroblasts. We then describe the procedures for inhibiting new transcription in proliferating and quiescent cells with Actinomycin D (ActD). ActD treatment represents a straightforward and reproducible approach to dissociating new transcription from transcript decay. A disadvantage of ActD treatment is that the time course must be limited to a short time frame because ActD affects cell viability. Transcript levels are monitored over time to determine transcript decay rates. This procedure allows for the identification of genes and isoforms that exhibit differential decay in proliferating versus quiescent fibroblasts.

We describe a protocol for generating proliferating and quiescent primary human dermal fibroblasts, monitoring transcript decay rates, and identifying differentially decaying genes.

Genom çapında transkript çürüme oranları Proliferasyona ve durgun insan fibroblast belirleme

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

Genom çapında kromatin Conformation yakalama kitaplıklardan sıkıca aşamalı erken Drosophila embriyo nesil

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

Zebra balığı bir Vivo içinde Model sistemi olarak kullanarak DNA çoğaltma zamanlaması profil oluşturma

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

Organizatörü yakalama Merhaba-C: Yüksek çözünürlüklü, genom çapında organizatörü etkileşimlerin profil oluşturma

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in mammalian cell lines. Rather than globally assaying removal of xenobiotic-induced or spontaneous chromosomal DPC removal, this assay examines the repair of a homogeneous, chemically defined lesion specifically introduced at one site within a plasmid DNA substrate. Importantly, this approach avoids the use of radioactive materials and is not dependent on expensive or highly-specialized technology. Instead, it relies on standard recombinant DNA procedures and widely available real-time, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) instrumentation. Given the inherent flexibility of the strategy utilized, the size of the crosslinked protein, as well as the nature of the chemical linkage and the precise DNA sequence context of the attachment site can be varied to address the respective contributions of these parameters to the overall efficiency of DPC repair. Using this method, plasmids containing a site-specific DPC were transfected into cells and low molecular weight DNA recovered at various times post-transfection. Recovered DNA is then subjected to strand-specific primer extension (SSPE) using a primer complementary to the damaged strand of the plasmid. Since the DPC lesion blocks Taq DNA polymerase, the ratio of repaired to un-repaired DNA can be quantitatively assessed using qPCR. Cycle threshold (CT) values are used to calculate percent repair at various time points in the respective cell lines. This SSPE-qPCR method can also be used to quantitatively assess the repair kinetics of any DNA adduct that blocks Taq polymerase.

The goal of this protocol is to quantify the repair of defined DNA-protein crosslinks on plasmid DNA. Lesioned plasmids are transfected into recipient mammalian cell lines and low-molecular weight harvested at multiple time points post-transfection. DNA repair kinetics are quantified using strand-specific primer extension followed by qPCR.

Ölçü birimi üzerinde plazmid DNA-protein Glossar tamiri için basit, hızlı ve nicel tahlil memeli hücre içine Transfected

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

DNA İçerik Ölçüm tarafından Memeli Çoğaltma Zamanlama genom Tayini

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler