NS088206 ve ES026892: Bu çalışma Sağlık (NIH) Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibeleriyle desteklenmiştir. W. Eugene ve Linda Lloyd bahşedilmiş Sandalye AGK ve AK Dekanlar Profesörlük da kabul edilmektedir.

hayvan ve protokol prosedürlerinin kullanılması onaylanmış ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Iowa State Üniversitesinde Komitesi (IACUC) (Ames, IA, ABD) tarafından denetlenen edildi 1. Karışık glial Kültürlerin yetiştirilmesi <ol><li> 5.5 inç işletim makasla 1- 2 günlük bir yavrular hızlı başını kesmek, ve buz üzerinde bir 50 ml tüp içinde hemen kafaları yerleştirin. Bu decapitation ötenazi modu olduğunu unutmayın. </li><li> Laminar hava akımı kaput, kafatası ve 4.5 inç düz mikro sistemleri kesme makasları kullanılarak meningeste küçük bir kesi yapmak. Rostral ucunun (burun) kaudal ucundan kesme başlayın. Kafaları kesilmek suretiyle oluşturulan açıklığı kullanarak derinin altına alın. <ol><li> Kesme işleminden sonra, yan hemisferlerin bir soyun. Daha sonra, bütün beyin kaldırmak için kıvrık ya da çengel cımbız kullanın. </li></ol></li><li> % 0.25 tripsin-ethylenediaminetetraacet içeren yeni bir 50 ml tüp içinde beyin (ler) daldırın37 ° C bir su banyosu içinde 15 dakika boyunca asit (EDTA), yedi. beyin başına tripsin-EDTA 2 mL kullanın. </li><li> ekleme ve kaldırma taze büyüme ortamı (% 10 FBS, DMEM / F12,% 1 penisilin / streptomisin,% 1 L-glutamin,% 1 sodyum piruvat ve% 1 temel olmayan amino asitler) ile beyin (ler) yıkayın medya. Bu 4x tekrarlayın. </li><li> Her beyin için, büyüme ortamı içeren iki T-75 balonları plaka. Bu nedenle, boruya beyin başına büyüme ortamının 2 ml. Bu nedenle, bu T-75 şişe başına büyüme ortamının 8-9 mL homojenize beyin 1 mL&#39;lik bir eşdeğer olacaktır. </li><li> En küçüğüne amacıyla, açıklık farklı boyutlarda pipetler ile beyin (ler) öğütülerek homojenize edilir. Beyin dokusu, sonraki pipet geçişi küçülüyor olmadığını görünür olduğunda. Toz haline sonunda, süspansiyon hiçbir görünür topakları, açık olmalıdır. <ol><li> 25 ml pipet, 5 ml pipet ve daha sonra 10 mL&#39;lik bir pipet ardışık kullanım. </li></ol></li><li> Her homog geçirin70 um&#39;lik bir hücre süzgecinden Venöz beyin süspansiyonu tek bir hücre kültürü dönüştürebilmek için. </li><li> (T-75 balonuna başına büyüme ortamının 8-9 mL homojenize beyin 1 mL) adım 1.5 de tarif edildiği gibi, her homojenize beyin için, plaka, iki T-75 şişeler, büyüme ortamını ihtiva eden. </li><li> 6 günden sonra büyüme ortamı değiştirin ve 16 inci günde tecrit kadar büyür. </li></ol> Mikroglial Hücreler 2. İzolasyon <ol><li> 16 gün sonra, şişeden büyüme ortamını çıkarın ve yeni bir 50 mL tüp içine koyun. Her T-75 balonuna 3 mL,% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin. Bir orbital çalkalayıcıda oda sıcaklığında 5 dakika boyunca çalkalama cam deney şişesinin. <ol><li> Santrifüj çıkarıldı büyüme 5 dakika süre ile 0.4 x g&#39;de ortam ve bir sonraki aşamada tripsin-EDTA, reaksiyonu durdurmak için kullanılır. </li></ol></li><li> 5 dakika çalkalandıktan sonra tripsin-EDTA, reaksiyonu durdurmak için büyüme (taze veya 2.1.1 kullanılan ortam) ortam 4 mL, en az ekleyin. </li><li> sağlamak için toz haline getirin hepsi carşın müstakil edilmiştir. </li><li> ezildikten sonra, tek bir hücre kültürüne yapmak için bir 70 um&#39;lik bir hücre süzgecinden hücrelere geçme bir hücre sayımı gerçekleştirmek ve daha sonra 5 dakika süre ile 0.4 x g&#39;de hücreleri aşağı döndürün. </li><li> Her 100 x 10 6 hücre (kabaca 15 x T-75 şişeler), hücre topağı tekrar süspansiyon için tavsiye edilen ortam (% 2 FBS, DPBS (kalsiyum ve magnezyum klorür içermeyen), 1 mM EDTA) içinde 1 mL kullanın. Not: Aşağıdaki bütün işlemler, bir 1 ml ayrılması için tasarlandı. </li><li> Bir 5 ml polistiren tüp al Önerilen Medya 1 mL ekleyin ve menisküs olarak işaretlemek. 2.5 mL kadar Önerilen Medya ekle ve de bu işaretleyin. Önerilen Ortam atın ve 5 ml polistiren tüp yeniden süspansiyon haline hücreleri transferi. </li><li> asma hücrelerinin her 1 ml sıçan serumu, 50 uL ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> bileşen A&#39;nın 25 uL ve bileşen B için 25 uL Bu bileşenler özel olarak karıştırılarak seçimi kokteyli hazırlanır. </li><li> 50 ekle1 &#39;dir; hücreleri seçim kokteyl L. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. NOT: daha saf kültürler için tekrarlayın adım 2.9 (önerilir, ancak zorunlu değil). </li><li> 45 saniye boyunca Girdap mıkrokürecikler. örnek 1 mL başına mikrosferler 80 uL ekleyin. Oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkalayın. </li><li> Önerilen Ortam eklenerek polistiren tüpü içinde 2.5 mL hacim getirin. </li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca mıknatıs tüp koyun. saflığını arttırmak için inkübasyon ayarlayın. Yavaş yavaş polistiren tüp içinde hala bir mıknatıs ile bir 15 ml tüp içine Önerilen Ortam dökmek. </li><li> Adımı tekrarlayın 2.12 üç kere daha. Ek manyetik inkübasyonlar saflığını arttırmak için gerçekleştirilebilir. </li><li> Büyüme ortamının 3 mL ekleyin ve bir hücre sayacı kullanılarak hücre sayısı. </li><li> buna göre Poli-D-Lisin (PDL) tedaviler için ıslah edilmiş plakalarda plakası hücreleri. inPDL-kaplanmış plakalar tohumlamadan sonra hücreler 48 saat maruz bırakınız. Bu hücreler ayrılık stresten kurtarmak için izin verir. NOT: CheDaha önce tarif edildiği gibi 15 immünsitokimya kullanarak kültür saflığı ck. </li><li> Çoğunlukla büyüme aracı madde içinde T-75 şişelerinde, astrositler içeren (15 ml bir tüp içinde toplanmıştır) negatif kısmını, Plate. </li><li> 37 ° C inkübatör içinde inkübe en azından 6 saat sonra, orta değiştirmek ve / N O büyümesine izin. tedaviler için ertesi gün astrositler bölün. </li></ol>

<ol><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li>
<li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+brain+macrophages+in+the+molecular+age%3A+from+origin+to+neuropsychiatric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).</li>
<li>Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+derive+from+progenitors%2C+originating+from+the+yolk+sac%2C+and+which+proliferate+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain.</a> Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).</li>
<li>Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).</li>
<li>Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+new+roles+for+the+synaptic+stripper%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia: new roles for the synaptic stripper.</a> Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synuclein+activates+microglia+in+a+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).</li>
<li>Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+is+genetically+implicated+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Inflammation is genetically implicated in Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 302, 89-102 (2015).</li>
<li>Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+p38alpha+MAPK+is+critical+for+LPS-induced+neuron+degeneration%2C+through+a+mechanism+involving+TNFalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha.</a> Mol Neurodegener. 6, 84(2011).</li>
<li>Panicker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fyn+Kinase+Regulates+Microglial+Neuroinflammatory+Responses+in+Cell+Culture+and+Animal+Models+of+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson's Disease.</a> J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).</li>
<li>Moehle, M. S., West, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M1+and+M2+immune+activation+in+Parkinson%27s+Disease%3A+Foe+and+ally%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">M1 and M2 immune activation in Parkinson's Disease: Foe and ally?</a> Neuroscience. 302, 59-73 (2015).</li>
<li>Saijo, K., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+origin+and+phenotypes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial cell origin and phenotypes in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li>
<li>Floden, A. M., Combs, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+repetitively+isolated+from+in+vitro+mixed+glial+cultures+retain+their+initial+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype.</a> J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).</li>
<li>Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+isolation+of+murine+microglia+by+mild+trypsinization%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization.</a> Glia. 44 (3), 183-189 (2003).</li>
<li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).</li>
<li>Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+CNS+myeloid+cells+and+their+roles+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration.</a> Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).</li>
<li>Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma,, J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+cell+sorting%3A+a+fast+and+effective+method+of+concurrent+isolation+of+high+purity+viable+astrocytes+and+microglia+from+neonatal+mouse+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).</li>
<li>Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+receptor+signaling+in+the+brain+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Adenosine receptor signaling in the brain immune system.</a> Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).</li>
<li>Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+thrombin+receptor+modulates+inflammation+and+astrogliosis+to+improve+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury.</a> Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).</li>
<li>Ay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+epigenetic+regulation%2C+and+functional+characterization+of+Prkd1+gene+promoter+in+dopaminergic+cell+culture+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson's disease.</a> J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).</li>
<li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+Cdelta+upregulation+in+microglia+drives+neuroinflammatory+responses+and+dopaminergic+neurodegeneration+in+experimental+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Eski mikroglial izolasyon yöntemleri, çeşitli protein Western blot analizleri ve RNA QRT-PCR ile analiz için uygun değildir sınırlı geri kazanımları sahiptir. Diferansiyel yapışma ve hafif tripsinizasyon yöntemler düşük mikroglial verim 13, 14, 15 sahip iki genel yaklaşım vardır. Sütun tabanlı CD11b yaklaşım aynı zamanda düşük bir iyileşme, ancak diferansiyel yapışma ve hafif tripsinizasyon <sup cl...

Mikroglia c-kit + / CD45- ayırt mezodermal kökenli myb bağımsız yerleşik makrofajlar yolk kesesi 1, 2, kan Adaları progenitörleri erythromyeloid bulunmaktadır. Embriyolojik mikroglia merkezi sinir sistemini (CNS) kolonileştiklerinde, bir dallanmış formda 3&#39;e bir amoeboid geçiş. Dinamik yansımaları potansiyel hakaretler 4 için sağlıklı beyin parankimi soruşturma beri Bunlar yetişkin mikroglia surveillant olarak sınıflandırılır. Mikroglia sadece MSS hücre nüfusunun yaklaşık% 10&#39;una katkıda rağmen, kendi aralarında döşemek için yetenekleri parankimindeki 4, 5 maksimal tarama sağlar. Örneğin α-sinüklein 6, 7 ve amiloid-P 8 ya da p tehlikesi ile bağlantılı moleküler yapılar (DAMPS),lipopolisakarid (LPS) ile 9 olarak athogen ilişkili moleküler yapılar (PAMP), klasik amoeboid etkin duruma reversiyon ve nitrik oksit üretimi, tümör nekroz faktörü-α (TNFa), interlökin 1β ile vasıflandırılan enflamatuar bir tepki teşvik etmek mikroglia aktive (IL-1β), IL-6, IL-12 ve kemokin CC motifi ligandı 2 9, 10, 11. Patojenik α-sinüklein birikmiş olan Parkinson hastalığı gibi nöro koşullarında, bir nörodejeneratif döngüsü ayrıca mikroglia 7 klasik aktivasyonunu teşvik, daha birleşik α-sinükleinin serbest dopaminerjik nöronların ölümden oluşturulur. periferal makrofajlar benzer şekilde, mikroglia da alternatif olarak, anti-enflamatuar sitokinlerin IL-4 ve IL-10 varlığında aktive etme yeteneğine sahip onları etkili verecek şekilde olabiliriltihap 2, 11 sinir tamirinin geliştirilmesi ve hafifletme ial. Kenara CNS&#39;de immünolojik rolleri, mikroglia gelişim sırasında sinaps budama nöronal devrenin hayati düzenleyicileri olarak tarif edilmiştir. Örneğin, Cx3cr1- KO fareleri, daha az yoğun mikroglia ve dendritik dikenler, olgunlaşmamış sinaps ve gelişmemiş bir CNS 12 elektrofizyolojik desen bir çok artışına neden düşük sinaptik budama sahiptir. CNS homeostazında bu fizyolojik karmaşıklığını ve mikroglia farklı işlevsel roller anlama nörodejeneratif bozuklukların hedefleyen terapötikler araştırılmasında için çok önemlidir. Nöroimmünoloji alanında, in vitro deneyler için mekanik çalışmalar için daha fizibilite yüksek ölçüde istenebilecektir, düşük bakım maliyeti, daha az zaman ve emek-yoğun olduğu için. Furthermoyeniden hücre popülasyonlarının izole edilmesi yeteneği öngörülen koşullar altında, bu hedef hücrelerin işlevini tarif etmek önemlidir. Çok sayıda mikrogliyal izolasyon yöntemleri mevcuttur, ancak bunlar geniş bir deney 13, 14, 15 için nispeten yüksek bir sayı ve saflık elde etme kabiliyetleri ile sınırlıdır. Örneğin, farklılaşma 11b, bir küme (CD11), monositler, makrofajlar, ve mikroglia 16 ortak bir yüzey markörüdür. CD11b yararlanarak, manyetik ayırma, bir yöntem, ilk olarak neonatal beyin 17 başına bir sütun tabanlı vermiştir yaklaşım ~% 99.5 saflık ve ~ 1.6 x 10 6 mikroglia olarak tarif edilmiştir. Laboratuvar son zamanlarda fikoerıtrinle konjüge edilmiş bir monoklonal antikor (PE) CD11b etiketleyerek bir polistiren tüp içinde gerçekleştirilen bir kolonsuz CD11 manyetik ayırma yöntemi 15, geliştirdi. Bir bispesifik secondary antikor PE ve PE ile dekstran kompleksleri. Bir kez bağlanmış, dekstran-kaplı manyetik parçacıklar antikor kompleksinin dekstran ucuna bağlama yapan, tanıtılmaktadır. Son olarak, polistiren tüp mikroglial izolasyonu için bir mıknatıs yerleştirilir. Bu yaklaşım için verim iki ~ neonatal beyin başına ancak ~% 97 saflıkta azaltılması pahasına 3.2 x 10 6 mikroglia. Burada, hızlı ve rafine kolonsuz CD11 manyetik ayırma protokolü (Şekil 1) göstermektedir. CD 11 b manyetik ayırma kiti fiyatı aynı olduğu için bu iyileştirilmiş yöntem orijinal kolonsuz metodu kadar hala mümkün. tamamlanma süresi, hücre hayatta kalması ve verimi maksimize etmek önemli olabilir yarısında, azaltılır. Özellikle, bu optimize yöntemden elde saflık ~&gt;% 99, laboratuvarımızda 15 tarafından geliştirilen özgün kolonsuz yönteminden elde saflık üzerinde belirgin bir düzelme sağlanır. En önemlisi, CD11-PEIşıktan uzak kuluçkaya ihtiyacını ortadan kaldırarak ve floresan mikroskobu için kırmızı kanalının kullanımına izin veren, kullanılmaz. Son olarak, orijinal CD11b yönteminde olduğu gibi, yüksek verim ve saflıkta bir astrositik fraksiyonu, bu geliştirilmiş bir yöntem ile elde edilir. Astrositler onların homeostatik fonksiyonları patofizyolojisi 18 göre vazgeçilmezdir fikrine yol açan, CNS içinde en çok glial hücrelerdir. Bu glial hücreler, glial kendi soruşturma potansiyel örneklendiren, besin desteği sağlayan, kan-beyin bariyeri oluşturan nörotransmiter homeostazın korunması hasarı, nöro-yanıt glial yara izi oluşturma, öğrenme ve hafıza, ve Nöro gibi çeşitli fizyolojik fonksiyonlarında önemli bir rol oynar biyoloji 19. Morfoloji ve mikroglia ve astrositlerin işlevselliği konfokal mikroskopi, Western kurutma nicel Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (QRT PCR), G aracılığıyla tespit edilmiştirRiess nitrit deneyi, ve Luminex multipleks sitokin deneyi. Bu protokolü tarafından sağlanan arıtma in vitro deneyler için önemli olan, tüm bunların mıkroglıal veya astrositik saflık, kırmızı kanalın kullanılabilirliği ile floresan mikroskobu geniş uygulamasına ilişkin güveni arttı ve zaman tasarrufu sunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>EasySep CD11b Separation Kit II</td><td>StemCell Technologies</td><td>18970</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>StemCell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acids (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>13H469</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS (DPBS)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid and refined cd11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility

Mikroglia merkezi sinir sistemi sıvı ataklarında birincil yanıt olarak; Ancak çok nöro-inflamasyonu düzenleyen rolleri hakkında bilinmiyor. Mikroglia inflamatuar stresi ölçme makrofajlar benzer şekilde işlev mezodermal hücrelerdir. Klasik (M1-tipi) ve alternatif (M2-tipi) makrofajlar aktivasyonlar da daha iyi bu fenotipleri böyle Parkinson, Alzheimer ve Huntington Hastalıkları gibi nöro koşullarda sahip altta yatan etkileşimi anlamak için bir çaba mikroglia uzatılmıştır. In vitro deney in vivo ortama uzatılabilir hızlı ve güvenilir sonuçlar birincil mikroglia sunmaktadır kullanılarak. Bu sorun olmuştur uygun saflıkta yeterli verimler elde ederken mikroglia izole in vivo deney üzerinde açık bir avantaj olmasına rağmen. Şu anda kullanımda olan Sık kullanılan yöntemler ya düşük kurtarma, düşük saflık veya her ikisi muzdarip. Bu yazıda, demlenmeyesürenin yarısı miktarda yüksek hücre kurtarma ve gelişmiş saflıkta elde kolonsuz CD11 manyetik ayırma yönteminin bir arıtma onstrate. Biz nöro-inflamasyonu ve nörodejenerasyonu okuyan amacıyla ana mikroglial izolasyonun son derece yararlı bir model olarak bu duruma getirilmiş yöntem önerilmektedir.

Mikroglia II yüksek saflığa sahip CD11 pozitif seçim kiti kullanılarak izole Primer fare mikroglia yukarıda belirtilen protokol kullanılarak izole edilmiş ve izolasyon saflığını kontrol etmek için poli-D-lizin kaplı lamelleri kaplandı. On bin hücreleri izole mikroglia saflığı kontrol etmek için mikroglia ve astrositler bir işaretçi olarak glial fibriler asidik protein (GFAP) &#39;in bir işaretleyici olarak ...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility at JoVE.com

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Burada, in vitro deneyler için doğum sonrası fare yavrularından mikroglia izole etmek için bir protokol (gün 1) sunulmuştur. izolasyon Bu doğaçlama yöntem hem de yüksek verim ve saflıkta, mikroglial biyoloji açıklık amacıyla geniş bir aralık deney sağlar alternatif yöntemler üzerinde önemli bir avantaj oluşturur.

Geliştirilmiş Saflık ve Çok Yönlü İlköğretim mikroglia hızlı ve Rafine CD11 Manyetik İzolasyon

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

rapid-refined-cd11b-magnetic-isolation-primary-microglia-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.7K Görüntüleme.  Iowa State University.  Burada, in vitro deneyler için doğum sonrası fare yavrularından mikroglia izole etmek için bir protokol (gün 1) sunulmuştur. izolasyon Bu doğaçlama yöntem hem de yüksek verim ve saflıkta, mikroglial biyoloji açıklık amacıyla geniş bir aralık deney sağlar alternatif yöntemler üzerinde önemli bir avantaj oluşturur. 

Video: Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Nörobilim

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during development, homeostasis, and disease. Although macrophages have been studied in detail for decades, specialized features of microglia, the tissue-resident macrophages of the CNS, have remained largely mysterious, in part due to limitations in the ability to recapitulate mature microglial properties in culture. Here, we illustrate a straightforward procedure for the rapid isolation of pure microglia from the mature rodent brain. We also describe serum-free culture conditions that support high levels of microglial viability over time. Microglia cultured under these defined-medium conditions exhibit elaborate ramified processes and dynamic surveillance behavior. We illustrate some effects of serum exposure on cultured microglia and discuss how these serum-free cultures compare to both serum-exposed cultures as well as microglia in vivo.

Efforts to understand microglial function in detail have been hindered by the lack of microglial culture models that recapitulate the properties of mature in vivo microglia. This protocol describes an isolation and culture approach designed to maintain robust survival of highly ramified mature rat microglia under defined-medium conditions.

Yalıtım ve dinamik bir teşvik etmek kemirgen Microglia kültürünü Morfoloji Serum-Alerjik orta Ramified

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive human diseases. Considerable advances have been made to uncover the molecular signatures of homeostatic microglia as well as alterations of their gene expression in response to environmental stimuli. With the advent and maturation of single-cell genomic methodologies, it is increasingly recognized that heterogenous microglia may underlie the diverse roles they play in different developmental and pathological conditions. Further dissection of such heterogeneity can be achieved through efficient isolation of microglia from a given region of interest, followed by sensitive profiling of individual cells. Here, we provide a detailed protocol for the rapid isolation of microglia from different brain regions in a single adult mouse brain hemisphere. We also demonstrate how to use these sorted microglia for plate-based deep single-cell RNA sequencing. We discuss the adaptability of this method to other scenarios and provide guidelines for improving the system to accommodate large-scale studies.

We provide a protocol for isolation of microglia from different dissected regions of an adult mouse brain hemisphere, followed by semi-automated library preparation for deep single-cell RNA sequencing of full-length transcriptomes. This method will help to elucidate functional heterogeneity of microglia in health and disease.

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Primary Microglia Isolation from Postnatal Mouse Brains

Microglia are the mononuclear phagocytes in the central nervous system (CNS), which play key roles in maintaining homeostasis and regulating the inflammatory process in the CNS. To study the microglial biology in vitro, primary microglia show great advantages compared to immortalized microglial cell lines. However, microglia isolation from the postnatal mouse brain is relatively less efficient and time-consuming. In this protocol, we provide a quick and easy-to-follow method to isolate primary microglia from the neonatal mouse brain. The overall steps of this protocol include brain dissection, primary brain cell culture, and microglia isolation. Using this approach, researchers can obtain primary microglia with high purity. In addition, the harvested primary microglia were able to respond to the lipopolysaccharides challenge, indicating they retained their immune function. Collectively, we developed a simplified approach to efficiently isolate primary microglia with high purity, which facilitates a wide range of microglial biology investigations&#160;in vitro.

<meta charset="utf8"></head><body>Doğum Sonrası Fare Beyinlerinden Primer Mikroglia İzolasyonu

Primary cell culture is one of the primarily used approaches for studying microglial biology in vitro. Here, we developed a method for simple and rapid microglia isolation from the mouse postnatal day 1 (P1) to P4.

Doğum Sonrası Fare Beyinlerinden Primer Mikroglia İzolasyonu

Microglia are the mononuclear phagocytes in the central nervous system (CNS), which play key roles in maintaining homeostasis and regulating the ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.

Birincil Hücre Kültürleri için Yenidoğan Fareden Mikroglial Hücrelerin Manyetik İzolasyonu

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). Microglia can be divided into resting state and activated state and can rapidly change state in response to the microenvironment of the brain. Microglia will be activated under different pathological conditions and exhibit different phenotypes. In addition, there are many different subgroups of activated microglia and great heterogeneity between different subgroups. The heterogeneity mainly depends on the molecular specificity of microglia. Studies have revealed that microglia will be activated and play an important role in the pathological process of inflammatory demyelination. To better understand the characteristics of microglia in inflammatory demyelinating diseases such as multiple sclerosis and neuromyelitis optica spectrum disorder, we propose a perilesional primary microglial sorting protocol. This protocol utilizes columnar magnetic-activated cell sorting (MACS) to obtain highly purified primary microglia and preserve the molecular characteristics of microglia to investigate the potential effects of microglia in inflammatory demyelinating diseases.

Here, we present a protocol to isolate and purify primary microglia in animal models of demyelinating diseases, utilizing columnar magnetic-activated cell sorting.

Fare Primer Mikroglia'sının Hayvan Demiyelinasyon Modellerinde Manyetik-Aktif Hücre Sıralama ile İzolasyonu

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

İn Vitro Deneyler için MACS Kullanılarak Farelerden Hipotalamik Mikroglia İzolasyonu

Isolation of Hypothalamic Microglia from Freshly Perfused Adult Mouse Brain by Magnetic-Activated Cell Sorting

Microglia, as the resident macrophages of the brain, are essential for maintaining brain homeostasis. They shape neuronal circuits during development, survey their environment for debris or dead cells, as well as respond to infection and injury in the brain, among many other functions. However, their important role in neurodevelopment and synaptic plasticity and pathophysiology has not been fully defined, highlighting the need for further investigation. To gain a more comprehensive understanding of the role of microglia in these processes, we need to isolate microglia and characterize them genetically, metabolically, and functionally. However, the isolation of microglia from adult mice, especially from small brain structures, is challenging as they represent a small percentage of the total brain cells, and the yield of isolated microglia is often too low. Here, the magnetic isolation of microglia using CD11b+ microbeads allows us to sort microglial cells from the hypothalamus of a freshly perfused adult mouse brain. The current method allows us to achieve relatively high purity and yield in a short period while maintaining cell viability.

Yazar Spotlight: Beslenmenin Fare Beyin Fonksiyonu ve Metabolik Bozukluklar Üzerindeki Etkisinin Araştırılması 

We describe a protocol for isolating microglial cells from the mouse hypothalamus (or equivalent small brain structures) using magnetically activated cell sorting (MACS), in a relatively short time. The MACS-sorted hypothalamic microglia can be used for ex vivo analysis and can be plated to perform in vitro assays.

Hipotalamik Mikroglia'nın Manyetik Olarak Aktive Edilmiş Hücre Ayıklama ile Yeni Perfüze Edilmiş Yetişkin Fare Beyninden İzolasyonu  

Microglia, as the resident macrophages of the brain, are essential for maintaining brain homeostasis. They shape neuronal circuits during development, ...

Geliştirilmiş Saflık ve Çok Yönlü İlköğretim mikroglia hızlı ve Rafine CD11 Manyetik İzolasyon

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Yalıtım ve dinamik bir teşvik etmek kemirgen Microglia kültürünü Morfoloji Serum-Alerjik orta Ramified

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

Doğum Sonrası Fare Beyinlerinden Primer Mikroglia İzolasyonu

Doğum Sonrası Fare Beyinlerinden Primer Mikroglia İzolasyonu

Birincil Hücre Kültürleri için Yenidoğan Fareden Mikroglial Hücrelerin Manyetik İzolasyonu

Fare Primer Mikroglia'sının Hayvan Demiyelinasyon Modellerinde Manyetik-Aktif Hücre Sıralama ile İzolasyonu

Hipotalamik Mikroglia'nın Manyetik Olarak Aktive Edilmiş Hücre Ayıklama ile Yeni Perfüze Edilmiş Yetişkin Fare Beyninden İzolasyonu

Hipotalamik Mikroglia'nın Manyetik Olarak Aktive Edilmiş Hücre Ayıklama ile Yeni Perfüze Edilmiş Yetişkin Fare Beyninden İzolasyonu

Hipotalamik Mikroglia'nın Manyetik Olarak Aktive Edilmiş Hücre Ayıklama ile Yeni Perfüze Edilmiş Yetişkin Fare Beyninden İzolasyonu