Name: enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain
Uploaded: 2017-10-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain at JoVE.com

Drs. Jim Lah ve Allan Levey, Emory sevgi Nöroloji, yazarlar yararlı yorumlar ve öneriler için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen finanse edildi hızlanan tıp ortaklık tarafından (U01AG046161-02), Emory Alzheimer'ın hastalığı Araştırma Merkezi (P50AG025688) ve yaşlanma Ulusal Enstitüsü (R01AG053960-01) N.T.S. için erişim izni verme Bu araştırma da kısmen Emory nörolojik NINDS çekirdek İmkanları grant, P30NS055077 nevropatoloji çekirdeği tarafından desteklenmiştir.

etik beyanı: tüm beyin dokuları Emory Alzheimer elde edilmiştir &#39; s hastalığı Araştırma Merkezi (ADRC) beyin banka. İnsan öldükten sonra dokular uygun kurumsal inceleme Kurulu (IRB) protokolleri altında elde.
 1. homojenizasyon ve ayırma <ol><li>doku seçim Not: ölüm sonrası frontal korteks doku sağlıklı kontrol (Ctl) ve patolojik olarak dondurulmuş teyit edilen reklam durumlarda Emory seçildi ADRC beyin banka (n = 2). Alzheimer için bir kayıt defteri kurmak için konsorsiyum göre gerçekleştirilen amiloid plak dağıtım öldükten sonra neuropathological değerlendirilmesi yapıldı. &#39; s hastalığı yarı nicel ölçüt 24, her ne kadar puanlama neurofibrillary dolaştırmak patoloji Braak hazırlama sistemine uygun olarak değerlendirildi. Ölüm sonrası beyin dokusunun sağlıklı kontrol (Ctl) ve patolojik olarak dondurulmuş 16 <ol><li>elde edilir reklam durumlarda doğruladı. Kuru buz, forseps ve jilet konteyner kullanmak, tüketim ~ 250 mg bölümlerini tek kullanımlık şeytan üzerinde her doku örneği üzerinden gri cevherde tartmak tekneler, doku çözdürme gelen önlemek için dikkat çekici. Homojen için her parçası ağırlığı kaydetmek.</li>
		<li>Tüketim ~ gri cevherde forseps ve jilet görsel olarak inceleyerek dış gri madde ve iç beyaz madde arasındaki arabirimi bulmak için kullanarak 250 mg. Beyaz madde ve daha da önemlisi, herhangi bir kaçının büyük kan damarları veya kanlı bölgeler, zarları veya araknoid mater. Hızlı bir şekilde çalışıyor ve sık sık tartı sandala polistren kapları kuru buz ile beyin dokusu ile yerleştirerek kesme işlemi sırasında dondurulmuş doku devam</li>
		<li>Gri madde bir analitik denge kullanarak her dondurulmuş parça eksize tam ağırlığı kaydetmek. Düşük tuz (LS) arabellek hacmi hesaplamak dounce homojenizasyon (5 mL/g veya % 20 w/v) için gerekli (bkz. Tablo 1).</li>
		<li>Hazırlamak 10 mL LS arabellek fosfataz ve proteaz inhibitörü kokteyl ve buz üzerinde sakin x 1</li>
		Bu Tammy'nin gibi <li>tartılır doku ve tartı tekne kuru buz ve kabaca 2 x 2 mm parçalar halinde zar çıkarın. 2 mL önceden soğutulmuş dounce homogenizer Tube transferinde buz</li>
		<li>5 mL/g (% 20 w/v) 1 X fosfataz ve proteaz inhibitörü kokteyl ile buz gibi düşük tuz (LS) tampon ekleyin.</li>
		<li>Homogenize beyin dokusu yüksek izni havaneli A ve düşük giriş izni havaneli d. 15 vuruş yaklaşık 10 vuruş kullanarak buz üstünde</li>
		<li>Tüm homogenate bir cam Pasteur pipet kullanarak 2 mL polipropilen boru için transfer. Tüp ile etiket &#8220; TH &#8221; (Toplam Homogenate), doku olgu sayısı ve homogenate cilt. Aliquot 0.8 mL etiketli 1,5 mL tüp içine. Herhangi bir aşırı homogenate benzer şekilde bölünmemeli ve-80 adlı saklı olabilir ° C.</li>
		<li>Aliquot her 0.8 mL için 5 M NaCl ve % 10 (w/v) sarkosyl her 100 µL 0,5 M ve % 1 w/v, konsantrasyonları sırasıyla ekleyin. Mix tüpler de INVERSION tarafından ve 15 dk. etiket tüpleri ile buz üzerinde kuluçkaya &#34; TH-S &#34; (Toplam Homogenate-homogenates sarkosyl-arabellekte (Tablo 1) olduğunu belirtmek için Sarkosyl).</li>
		<li>Her tüpün üç 5 s bakliyat, buz üzerinde % 30 genlik için solüsyon içeren temizleyicide (maksimum yoğunluk % 40 =) microtip sonda kullanarak</li> <li>bicinchoninic asit (BCA) kullanarak homogenates protein konsantrasyonları tahlil 25 belirlemek yöntemi. 
		Not: 15-20 mg/mL 5 mL LS doku gram başına hazırlanmış TH-S homogenates ortalama protein konsantrasyonu olduğunu. Hemen şeker veya-80 ° C'de kadar kullanmak saklı homogenates.</li>
		<li>10 mg/ml 1 x fosfataz ve proteaz inhibitörleri ile buz gibi sark tampon (Tablo 1) kullanarak seyreltik TH-S homogenates.</li>
		Her TH-S homogenate 500 µL polikarbonat ultracentrifuge tüpler ve Sark'ın arabellek ile çift-denge <li>transfer 5 mg protein (0.5 mL). Yük tüpler içine önceden soğutulmuş rotor ve 180.000 x g 1.5 mL tüpler için 4 ° C. Transfer sarkosyl çözünür supernatants (S1), 30 dk için de ultracentrifuge ve saklamak-80 ° C. 
		Not: (İsteğe bağlı yıkama) eklemek 200 µL sark-arabelleği ultracentrifuge için tüpler deterjan çözünmez kesirler (P1) içeren ve granül (P1) 200 µL pipet ucu kullanarak ultracentrifuge tüpler altından çıkarmak.</li>
		<li>Kısaca nabız-spin ters tüpler için 2-3 s (&#8804; 2500 x g) üzerinde 1,5 mL tüpler aşağıdaki granül (P1) ve arabellek aktarmak için bir microcentrifuge. Pelet bozulur sağlamak için yukarı ve aşağı pipetting tarafından sark arabellekte çözünmez granül (P1) resuspend.</li>
		<li>Çift-denge ve 180.000 x g, santrifüj için ek bir 30 dk 4 ° C.</li>
		<li>İsteğe bağlı yıkama süpernatant (S2) atmak ve sarkosyl çözünmez granül (P2) 50-75 µL üre arabelleği (Tablo 1) 1 ile kuluçkaya x solubilize için oda sıcaklığında 30 dk (proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyl) PIC Pelet. 
		Not: Sıcak üre arabelleğe oda sıcaklığında SDS yağış önlemek için kullanmadan önce. Deterjan duyarlı uygulamalar için üre arabelleğinden SDS atlarsanız, çözünmez Pelet (P2) yıkama düşük tuz arabellekte üre arabellekte resuspending önce düşünün.</li>
		<li>Resuspended granül (P2) 0.5 mL tüpler için transfer edecek ve kısa (1 s) microtip sonication % 20 genlik, (maksimum yoğunluk = % 40) tam granül solubilize için.</li>
		<li>Sarkosyl çözünür (S1) protein konsantrasyonları belirlemek ve - BCA kullanarak çözünmez (P2) kesirler yöntemini tahlil. Bu kesirler hemen kullanmayın veya saklamayın-80 ° C'de kadar kullanmak.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunoblotting <ol><li>Western Blot Not: Western Blot gerçekleştirilen hafif değişiklikler ile daha önce raporlanmış yordamlara göre belirleme yapılacağı. 5 , 10 <ol><li>Toplam homogenates (TH-S), sark çözünür (S1) ve sark çözünmez (P2) kesirler 1 X Laemmli SDS-sayfa örnek arabelleği 5 mM TCEP pH 7 ile hazırlamak 40 µg örnekleri. Örnekleri 5 dakika süreyle 95 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Yük örnekleri bir prekast 10-iyi 4-%12 Bis-Tris SDS-sayfa jel. 80 V için ilk santimetre (10 dakika) ve 120 V kalanı (60 dk) için veya izleme boya jel sonuna ulaşana kadar electrophorese.</li>
		<li>Split-önceden döküm jel kaset açık için bir taze jilet ve jel bıçak kullanın. Yavaşça Kes gitsin tarak ve taze bir tıraş bıçağı ile jel çok altında.</li>
		<li>200 µl sark-tampon PIC pipetting tarafından yukarı ve aşağı 1 x ile çözünmez granül (P1) resuspend.</li>
		<li>Transfer blotting bir makinede bir kuru aktarım yöntemini kullanarak bir 0.2 µm nitroselüloz membran için (malzeme tabloya bakın).</li>
		<li>Blok BB ile %0,05 ile takip membran engelleme arabelleği (BB) olmadan ara 20 için 30 dk, 30 dk için ara 20 (BB/T). Engelleme sonra durulama zar TBS/t (% 0,1 ara 20) aşırı engelleme arabellek kaldırmak 5 min için.</li>
		<li>Hazırla 1:1,000 dilutions birincil antikorlar pT231, Tau-2 (pan tau), AT8 ve EEA1 BB/t (% 0.05 arası 20).</li>
		<li>Gecede 4 ° C'de dairesel ajitasyon ile birincil antikor çözümde membranlar kuluçkaya. Membran TBS/T 3 x 15 dk. için durulama</li>
		<li>Sonda membran 1:20,000 seyreltme fluorescently etiketli bir ile en yakın-IR ikincil antikor BB/t shaker üzerinde karanlık oda sıcaklığında 60 dk için. Membran 3 x 10 dk TBS/T ve 2 x 5 dk içinde TBS. durulama</li>
		<li>Membran görüntüleme sistemi uygun uyarma dalga boyu (örneğin 700 nm (kırmızı kanalı) kızılötesi boya 680 keçi Anti-fare IgG (H + L) ikincil ve 800 nm (yeşil kanal) kızılötesi boya 790 eşek Anti-tavşan IgG (H + L için için bir kızılötesi kullanarak tarama ) ikincil).</li>
		<li>Sinyal yoğunluklarda ölçmek ve üretici göre Dansitometresi ölçümleri gerçekleştirmek için görüntüleme yazılımı kullanmanız &#39; s talimatları, tüm arka plan ortalama üzere ayarlanmışsa otomatik arka plan ayarlama sağlanması.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+Proteins+in+Neurodegenerative+Disease.">Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease.</a> Science. 296 (5575), 1991 (1991).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).</li><li>Ram&#237;rez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+exploration+of+the+influence+of+the+protein+stability+on+amyloid+fibril+formation+in+vitro.">A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).</li><li>Hamley, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyloid+Beta+Peptide:+A+Chemist's+Perspective.+Role+in+Alzheimer's+and+Fibrillization.">The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization.</a> Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).</li><li>Diner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+Properties+of+the+Small+Nuclear+Ribonucleoprotein+U1-70K+in+Alzheimer+Disease.">Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease.</a> J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).</li><li>Gozal, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+Analysis+Reveals+Novel+Components+in+the+Detergent-Insoluble+Subproteome+in+Alzheimer's+Disease.">Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease.</a> J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).</li><li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+detergent-insoluble+brain+proteome+linked+to+amyloid+and+tau+in+Alzheimer's+Disease+progression.">Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression.</a> PROTEOMICS. , (2016).</li><li>Julien, C., Bretteville, A., Planel, E., Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Amyloid Proteins: Methods and Protocols. , 473-491 (2012).</li><li>Nizhnikov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Screening+for+Amyloid+Proteins.">Proteomic Screening for Amyloid Proteins.</a> PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).</li><li>Seyfried, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+detergent-insoluble+brain+proteome+in+frontotemporal+lobar+degeneration+using+SILAC+internal+standards.">Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards.</a> J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).</li><li>Woltjer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+determination+of+widespread+detergent+insolubility,+including+A&#946;+but+not+tau,+early+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease.">Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including A&#946; but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> FASEB J. , (2005).</li><li>Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+Characterization+of+the+Core+Structure+of+&#945;-Synuclein+Filaments.">Biochemical Characterization of the Core Structure of &#945;-Synuclein Filaments.</a> J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).</li><li>Hasegawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+&#945;-Synuclein+Is+Ubiquitinated+in+&#945;-Synucleinopathy+Lesions.">Phosphorylated &#945;-Synuclein Is Ubiquitinated in &#945;-Synucleinopathy Lesions.</a> J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitinated+TDP-43+in+Frontotemporal+Lobar+Degeneration+and+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130 (2006).</li><li>Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Intrinsically+Disordered+Low+Complexity+Domain+is+Required+for+U1-70K+Self-association.">An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association.</a> FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).</li><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes.">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).</li><li>Noguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Patient-derived,+Toxic,+High+Mass+Amyloid+&#946;-Protein+(A&#946;)+Assembly+from+Alzheimer+Disease+Brains.">Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid &#946;-Protein (A&#946;) Assembly from Alzheimer Disease Brains.</a> J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).</li><li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer's+disease.">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li><li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+&#946;-Amyloid+Protein+Is+Covalently+Modified+when+Dissolved+in+Formic+Acid.">Alzheimer's &#946;-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid.</a> J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).</li><li>Yang, L. -. S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+Released+from+Paired+Helical+Filaments+with+Formic+Acid+or+Guanidine+Is+Susceptible+to+Calpain-Mediated+Proteolysis.">Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis.</a> J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).</li><li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer's+disease.">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li><li>Hales, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U1+small+nuclear+ribonucleoproteins+(snRNPs)+aggregate+in+Alzheimer's+disease+due+to+autosomal+dominant+genetic+mutations+and+trisomy+21.">U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21.</a> Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).</li><li>Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+change,+aggregation+and+fibril+formation+induced+by+detergent+treatments+of+cellular+prion+protein.">Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein.</a> J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).</li><li>Mirra, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Consortium+to+Establish+a+Registry+for+Alzheimer's+Disease+(CERAD).+Part+II.+Standardization+of+the+neuropathologic+assessment+of+Alzheimer's+disease.">The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease.</a> Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Guo, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+pathological+tau+conformers+from+Alzheimer's+brains+transmit+tau+pathology+in+nontransgenic+mice.">Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice.</a> J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).</li><li>Matveev, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+subfraction+of+A&#946;+is+responsible+for+the+high-affinity+Pittsburgh+compound+B-binding+site+in+Alzheimer's+disease+brain.">A distinct subfraction of A&#946; is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain.</a> J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada biz tanıtmak ve kütle spektrometresi tabanlı proteomik analizinden deneyleri misfolding fonksiyonel proteini değişen deneysel uygulamalar çok çeşitli için geçerlidir kısaltılmış bir tek adım deterjan-Ayırma Protokolü tartışmak ve western Blot. 5 , 6 , 7 , 10 Bu metodoloji olduğunu Belki de çoğu zaman nörodejeneratif proteinopathies Alzheimer gibi çalışmak için ...

Nörodejeneratif hastalıklar Alzheimer hastalığı (Ah), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD), amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve yakından ilgili prion hastalıkları gibi yavaş yavaş birikimi ile karakterize proteinopathies vardır deterjan çözünmez protein toplamları ile bilişsel birlikte beyin reddedin. 1 , 2 bu paylaşılan patolojik özellik etyoloji ve bu nörodejeneratif hastalıklar Patofizyoloji merkezi bir rol oynadığı düşünülmektedir. 2 bu toplamları liflerinin misfolded protein βsergilenmesi birim yinelenen oluşan polimer amiloid, genellikle-yapısı. 1 , 2 , 3 , 4 biyokimyasal olarak, amiloid toplamları kimyasal veya termal denatürasyon ve solubilization, onların arıtma, analiz için benzersiz zorluklar sunar3 son derece dayanıklıdır ve geleneksel biyokimyasal teknikleri ile çalışma. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 şaşırtıcı olmayan bir şekilde, deterjan çözünmez protein fraksiyonu nörodejeneratif hastalıklar misfolded proteinleri birikimi ile ilgili Patofizyoloji içine çok araştırma odağı olmuştur. 6 , 12 , 13 , 14
Biyokimyasal ayırma teknikleri kez ölüm sonrası beyin homogenates dan deterjan çözünmez kesir zenginleştirmek için kullanılmıştır. 6 , 12 , 13 , 14 en yaygın yöntemlerden birini doku homogenates ile tampon sıralı çıkarma ve sıkılık çözünür ve çözünmez kesirler bölme ultrasantrifüj tarafından takip, artan deterjanlar içerir. Yaygın olarak kullanılan sıralı Ayırma Protokolü6,14 donmuş doku örnekleri bir deterjan-Alerjik düşük tuz (LS) arabelleği homojenizasyon içerir ve sonuç çözünmez granül sonra sırayla ile ayıklanır yüksek tuz, non-iyonik deterjanlar, yüksek Sükroz içeren arabellekleri, üre iyonik deterjanlar ve nihayet chaotropes gibi. 6 , 14 önemli ölçüde zaman ve emek taahhüt bunları tamamlamak için gereken böyle bir sıralı ayırma iletişim kuralları belli bir dezavantajı var. Homojenizasyon ve ultrasantrifüj de dahil olmak üzere, tipik beş adım Ayırma Protokolü saat veya bile birkaç alabilir gün tamamlamak için. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 Ayrıca, çok sayıda patolojik protein toplamları kalır en sert koşullar19,20 hariç hepsi çözünmez oluşturulan kesirler çoğu sınırlı değeri. Böylece, yüksek tuz konsantrasyonları ve non-iyonik deterjanlar kullanarak daha az sıkı ayırma adımları büyük ölçüde gereksizdir.
Önceki çalışmalarda iyonik deterjan N-loril-sarcosine (sarkosyl) basitleştirilmiş tek adım deterjan Ayırma Protokolü için mükemmel bir aday olduğunu göstermiştir. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 denaturing bir deterjan olarak sarkosyl beta-amiloid (Aβ),6,11 oluşan misfolded protein toplamları çözücü olmadan yerel olarak katlanmış proteinlerin beyinde büyük çoğunluğu solubilize için sıkı fosforile tau (pTau),6 TAR DNA'ya bağlanıcı protein 43 (TDP-43),14 Alfa-synuclein,12,13 büyük,23 veya U1 küçük nükleer ribonucleoproteins (U1 snRNPs) gibi U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 Sarkosyl her yerde Anyonik deterjan Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) daha az sıkı olduğu için daha az sağlam oligomeric formları SDS tedavi dayanıklı olamaz misfolded protein toplamları korur. 9
Daha önce biz sonuçları daha zahmetli sıralı ayırma yöntemleri için karşılaştırılabilir elde kısaltılmış bir deterjan-Ayırma Protokolü nitelendirdi. 5 daha az sıkı ayırma adımları ihmal olarak, deterjan çözünmez protein toplamları üzerinden öldükten sonra insan beyni zenginleştirme için facile tek adım Ayırma Protokolü geliştirmeye başardık. 5 burada açıklanan bu ayrıntılı iletişim kuralı deneysel uygulamalar Western Blot arasında değişen geniş bir yelpazesi için son derece uygundur ve kütle spektrometresi tabanlı proteomik fonksiyonel proteini misfolding ve tohum toplama deneyleri. 5 , 6 , 21

<table><tbody><tr><td>Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>78441</td><td>protease &amp;amp; phosphatase inhibitor cocktail</td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB505110</td><td>microtip ultrasonicator</td></tr><tr><td>Optimax TLX Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>361545</td><td>refrigerated ultracentrifuge</td></tr><tr><td>TLA120.1 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>362224</td><td>ultracentrifuge rotor</td></tr><tr><td>500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwall</td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td>ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor</td></tr><tr><td>4X SDS sample buffer</td><td>Home-made</td><td>N/A</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TCEP solution, neutral pH</td><td>Thermo Fisher</td><td>77720</td><td>reducing agent</td></tr><tr><td>(TBS) blocking buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>37542</td><td>blocking buffer</td></tr><tr><td>(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20</td><td>Thermo Fisher</td><td>37543</td><td>blocking buffer and antibody diluent</td></tr><tr><td>4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well</td><td>Thermo Fisher</td><td>NW04120BOX</td><td>precast SDS-PAGE gels</td></tr><tr><td>MES SDS Running Buffer (20X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>B0002</td><td>SDS-PAGE running buffer</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5777-50G</td><td>detergent</td></tr><tr><td>Anti-Tau-2 (pan tau) antibody</td><td>Chemicon</td><td>MAB375</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB5450</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8)</td><td>Thermo Fisher</td><td>MN1020</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody</td><td>abcam</td><td>ab2900</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21058</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11374</td><td>antibodies</td></tr><tr><td>iBlot2 Dry Blotting System</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB21001</td><td>Gel transfer</td></tr><tr><td>iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini</td><td>Thermo Fisher</td><td>IB23002</td><td>Gel transfer</td></tr></tbody></table>

enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain

Bu çalışmada, deterjan çözünmez protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme için bir kısaltılmış tek adım Ayırma Protokolü açıklar. İyonik deterjan N-loril-sarcosine (sarkosyl) etkin bir şekilde beyin dokusu gibi deterjan çözünmez protein toplamları nörodejeneratif proteinopathies, geniş bir dizi zenginleştirme sağlayan yerel olarak katlanmış proteinlerin solubilizes Alzheimer hastalığı (Ah), Parkinson hastalığı ve amyotrofik lateral skleroz ve prion hastalıkları. İnsan kontrolü ve reklam ölüm sonrası beyin dokuları ultrasantrifüj patolojik fosforile tau, neurofibrillary temel bileşenidir dahil olmak üzere deterjan çözünmez protein toplamları zenginleştirmek için sarkosyl huzurunda tarafından homojenize ve posalı düğüm reklam. Western Blot toplanan fosforile tau ve deterjan çözünür protein, erken Endosome antijen 1 (EEA1) kontrolü ve reklam beyin farklı çözünürlük gösterdi. Proteomik çözümleme Ayrıca βzenginlik ortaya-amiloid (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70 K) ve apolipoprotein E (APOE) bu kontrol, önceki doku ayırma stratejileri ile tutarlı göre reklam beyin sarkosyl çözünmez kesirler . Böylece, bu basit zenginleştirme Protokolü deneysel uygulamalar Western Blot ve fonksiyonel proteini ortak toplama deneyleri kütle spektrometresi tabanlı proteomik kadar geniş bir yelpazede için idealdir.

Deterjan çözünmez protein toplamları kontrol ve AD ölüm sonrası beyin (şekil 1) zenginleştirmek için kullanılan kısaltılmış tek adım sarkosyl-ayırma protokol. Proteinler üzerinden TH-S, S1, S2 ve P2 kesirler SDS-sayfa, 15 dk Coomassie nazik Coomassie parlak mavi G-250 boyama arabellek ile boyama tarafından mavi sabitleştirici arabellek takip için sabit tarafından çözüldü. Protein S2 kesir tespit edilemez seviyede olduğundan resuspen...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain at JoVE.com

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Deterjan çözünmez protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme için bir kısaltılmış Ayırma Protokolü tanımlanır.

Deterjan çözünmez Protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

enrichment-detergent-insoluble-protein-aggregates-from-human

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.0K Görüntüleme.  Emory School of Medicine. Deterjan çözünmez protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme için bir kısaltılmış Ayırma Protokolü tanımlanır.

Video: Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&beta; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

The anomalous folding and polymerization of the &beta;-amyloid (A&beta;) peptide is thought to initiate the neurodegenerative cascade in Alzheimer's disease pathogenesis1. A&beta; is predominantly a 40- or 42-amino acid peptide that is prone to self-aggregation into &beta;-sheet-rich amyloid fibrils that are found in the cores of cerebral senile plaques in Alzheimer's disease. Increasing evidence suggests that low molecular weight, soluble A&beta; multimers are more toxic than fibrillar A&beta; amyloid2. The identification and quantification of low- and high-molecular weight multimeric A&beta; species in brain tissue is an essential objective in Alzheimer's disease research, and the methods employed also can be applied to the identification and characterization of toxic multimers in other proteopathies3. Naturally occurring A&beta; multimers can be detected by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis followed by immunoblotting with A&beta;-specific antibodies. However, the separation and detection of multimeric A&beta; requires the use of highly concentrated cortical homogenates and antigen retrieval in small pore-size nitrocellulose membranes. Here we describe a technique for the preparation of clarified human cortical homogenates, separation of proteins by SDS-PAGE, and antigen-epitope retrieval/Western blotting with antibody 6E10 to the N-terminal region of the A&beta; peptide. Using this protocol, we consistently detect A&beta; monomers, dimers, trimers, tetramers, and higher molecular weight multimers in cortical tissue from humans with Alzheimer's pathology.

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&#946; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

We describe a technique for the preparation of clarified human cortical homogenates, protein separation by SDS-PAGE, antigen retrieval and immunoblotting with an antibody to the A&beta; peptide. Using this protocol, we consistently detect monomeric and multimeric A&beta; in cortical tissue from humans with Alzheimer's pathology.

İnsan Kortikal Doku Aβ multimerlerin SDS-PAGE/Immunoblot Algılama Antijen-epitop Alma kullanarak homojenatlarında

The anomalous folding and polymerization of the &beta;-amyloid (A&beta;) peptide is thought to initiate the neurodegenerative cascade in Alzheimer's ...

Nörobilim

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform PrPSc 1. PrPC is detergent-soluble and sensitive to proteinase K (PK)-digestion, whereas PrPSc forms detergent-insoluble aggregates and is partially resistant to PK2-6. The conversion of PrPC to PrPSc is known to involve a conformational transition of &alpha;-helical to &beta;-sheet structures of the protein. However, the in vivo pathway is still poorly understood. A tentative endogenous PrPSc, intermediate PrP* or "silent prion", has yet to be identified in the uninfected brain7.
Using a combination of biophysical and biochemical approaches, we identified insoluble PrPC aggregates (designated iPrPC) from uninfected mammalian brains and cultured neuronal cells8, 9. Here, we describe detailed procedures of these methods, including ultracentrifugation in detergent buffer, sucrose step gradient sedimentation, size exclusion chromatography, iPrP enrichment by gene 5 protein (g5p) that specifically bind to structurally altered PrP forms10, and PK-treatment. The combination of these approaches isolates not only insoluble PrPSc and PrPC aggregates but also soluble PrPC oligomers from the normal human brain. Since the protocols described here have been used to isolate both PrPSc from infected brains and iPrPC from uninfected brains, they provide us with an opportunity to compare differences in physicochemical features, neurotoxicity, and infectivity between the two isoforms. Such a study will greatly improve our understanding of the infectious proteinaceous pathogens. The physiology and pathophysiology of iPrPC are unclear at present. Notably, in a newly-identified human prion disease termed variably protease-sensitive prionopathy, we found a new PrPSc that shares the immunoreactive behavior and fragmentation with iPrPC 11, 12. Moreover, we recently demonstrated that iPrPC is the main species that interacts with amyloid-&beta; protein in Alzheimer disease13. In the same study, these methods were used to isolate Abeta aggregates and oligomers in Alzheimer's disease13, suggesting their application to non-prion protein aggregates involved in other neurodegenerative disorders.

A new species of cellular prion protein (PrPC) has recently been identified in uninfected human brains using the methods described here. These methods can be used to isolate various PrP species, while some of them are also useful in isolating other misfolded protein aggregates from human brains.

Normal İnsan Beyin Çözünür ve çözünmez PrP Oligomerleri İzolasyonu

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

Tıp

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, little is known about changes in neuronal chromatin and nuclear organization during the course of development and aging, or in chronic neuropsychiatric disease. However, to date most chromatin and DNA based assays (other than FISH) lack single cell resolution. To this end, the considerable cellular heterogeneity of brain tissue poses a significant limitation, because typically various subpopulations of neurons are intermingled with different types of glia and other non-neuronal cells. One possible solution would be to grow cell-type specific cultures, but most CNS cells, including neurons, are ex vivo sustainable, at best, for only a few weeks and thus would provide an incomplete model for epigenetic mechanisms potentially operating across the full lifespan.  Here, we provide a protocol to extract and purify nuclei from frozen (never fixed) human postmortem brain. The method involves extraction of nuclei in hypotonic lysis buffer, followed by ultracentrifugation and immunotagging with anti-NeuN antibody. Labeled neuronal nuclei are then collected separately using fluorescence-activated sorting. This method should be applicable to any brain region in a wide range of species and suitable for chromatin immunoprecipitation studies with site- and modification-specific anti-histone antibodies, and for DNA methylation and other assays. 

The cellular heterogeneity of brain tissue poses a significant limitation for the study of epigenetic markings in chromatin because most assays lack single cell resolution. Neurons typically are intermingled with glia and other non-neuronal cells. We provide a protocol to extract and collect neuronal nuclei from human brain.

İnsan Postmortem Beyin Dokusu Nöronal Çekirdekler İzolasyon

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Biyoloji

Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or pathological conditions. Basically, this technique is based on the separation of proteins according to their isoelectric point in a first step, and secondly according to their molecular weights by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In this report an optimized sample preparation protocol for little amount of human post-mortem and mouse brain tissue is described. This method enables to perform both two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2D-DIGE) and mini 2DE immunoblotting. The combination of these approaches allows one to not only find new proteins and/or protein modifications in their expression thanks to its compatibility with mass spectrometry detection, but also a new insight into markers validation. Thus, mini-2DE coupled to western blotting permits to identify and validate post-translational modifications, proteins catabolism and provides a qualitative comparison among different conditions and/or treatments. Herein, we provide a method to study components of protein aggregates found in AD and Lewy body dementia such as the amyloid-beta peptide and the alpha-synuclein. Our method can thus be adapted for the analysis of the proteome and insoluble proteins extract from human brain tissue and mice models too. In parallel, it may provide useful information for the study of molecular and cellular pathways involved in neurodegenerative diseases as well as potential novel biomarkers and therapeutic targets.

A common protein extraction protocol using urea/thiourea/SDS buffer for human and mice brain tissue allows indentification of proteins by 2D-DIGE and their subsequent characterization by mini 2DE immunoblotting. This method enables one to obtain more reproducible and reliable results from human biopsies and experimental models.

Konsensus Beyin kaynaklı protein, 2D-DIGE ve Mini 2DE İmmünoblotting Hem kullanma İnsan ve Kemirgen Beyin proteomun Çalışmaları Ekstraksiyon Protokolü

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, oligomers and fibrils. During disease, &#945;-syn undergoes conformational changes to form oligomers and high molecular weight aggregates that tend to make the protein more insoluble. Abnormally aggregated &#945;-syn is a neuropathological feature of Parkinson&#39;s disease (PD), dementia with Lewy bodies (DLB) and multiple system atrophy (MSA). Biochemical characterization and analysis of insoluble &#945;-syn using buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation provides a powerful tool to determine the development of &#945;-syn pathology associated with disease progression. This protocol describes the isolation of increasingly insoluble/aggregated &#945;-syn from post-mortem human brain tissue. This methodology can be adapted with modifications to studies of normal and abnormal &#945;-syn biology in transgenic animal models harbouring different &#945;-syn mutations as well as in other neurodegenerative diseases that feature aberrant fibrillar deposits of proteins related to their respective pathologies.

Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (&#945;-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of &#945;-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.

Parkinson Brains gelen Çözünür ve çözünmez alfa-sinüklein Sıralı Ekstraksiyon

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin occurs in equilibrium in its two forms: monomeric globular (G-actin) and polymerized filamentous (F- actin). At the synaptic terminals, actin cytoskeleton forms the basis for critical pre- and post-synaptic functions. Moreover, dynamic changes in the actin polymerization status (interconversion between globular and filamentous forms of actin) are closely linked to plasticity-related alterations in synaptic structure and function. We report here a modified fluorescence-based methodology to assess polymerization status of actin in ex vivo conditions. The assay employs fluorescently labelled phalloidin, a phallotoxin that specifically binds to actin filaments (F-actin), providing a direct measure of polymerized filamentous actin. As a proof of principle, we provide evidence for the suitability of the assay both in rodent and post-mortem human brain tissue homogenates. Using latrunculin A (a drug that depolymerizes actin filaments), we confirm the utility of the assay in monitoring alterations in F-actin levels. Further, we extend the assay to biochemical fractions of isolated synaptic terminals wherein we confirm increased actin polymerization upon stimulation by depolarization with high extracellular K+.

We report a simple, time-efficient and high-throughput fluorescence spectroscopy-based assay for the quantification of actin filaments in ex vivo biological samples from brain tissues of rodents and human subjects.

Kemirgen ve İnsan Beyin Dokularında Aktüer Polimerizasyon Durumunu Değerlendirmek için Zaman Verimli Floresan Spektroskopi Tabanlı Bir Tahlil

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin ...

Nuclei Isolation and Super-Resolution Structured Illumination Microscopy for Examining Nucleoporin Alterations in Human Neurodegeneration

The nuclear pore complex (NPC) is a complex macromolecular structure comprised of multiple copies of ~30 different nucleoporin proteins (Nups). Collectively, these Nups function to regulate genome organization, gene expression, and nucleocytoplasmic transport (NCT). Recently, defects in NCT and alterations to specific Nups have been identified as early and prominent pathologies in multiple neurodegenerative diseases, including Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), Alzheimer&#39;s Disease (AD)/Frontotemporal Dementia (FTD), and Huntington&#39;s Disease (HD). Advances in both light and electron microscopy allow for a thorough examination of sub-cellular structures, including the NPC and its Nup constituents, with increased precision and resolution. Of the commonly used techniques, super-resolution structured illumination microscopy (SIM) affords the unparalleled opportunity to study the localization and expression of individual Nups using conventional antibody-based labeling strategies. Isolation of nuclei prior to SIM enables the visualization of individual Nup proteins within the NPC and nucleoplasm in fully and accurately reconstructed 3D space. This protocol describes a procedure for nuclei isolation and SIM to evaluate Nup expression and distribution in human iPSC-derived CNS cells and postmortem tissues.

<meta charset="utf8"></head><body>İnsan Nörodejenerasyonunda Nükleoporin Değişikliklerini İncelemek için Çekirdek İzolasyonu ve Süper Çözünürlüklü Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobu

This protocol describes an optimized workflow for nuclei isolation and super-resolution structured illumination microscopy to evaluate individual nucleoporins within the nucleoplasm and NPCs in induced pluripotent stem cell derived neurons and postmortem human tissues.

İnsan Nörodejenerasyonunda Nükleoporin Değişikliklerini İncelemek için Çekirdek İzolasyonu ve Süper Çözünürlüklü Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobu

The nuclear pore complex (NPC) is a complex macromolecular structure comprised of multiple copies of ~30 different nucleoporin proteins (Nups). ...

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease (AD), amyloid-beta peptides form protofibrils in the extracellular space, which act as seeds that gradually grow and mature into large amyloid plaques. Despite this basic understanding, current knowledge of the amyloid fibril structure, composition, and deposition patterns in the brain is limited. One major barrier has been the inability to isolate highly purified amyloid fibrils from brain extracts. Affinity purification and laser capture microdissection-based approaches have been previously used to isolate amyloids but are limited by the small quantity of material that can be recovered. This novel, robust protocol describes the biochemical purification of amyloid plaque cores using sodium dodecyl sulfate (SDS) solubilization with sucrose density gradient ultracentrifugation and ultrasonication and yields highly pure fibrils from AD patients and AD model brain tissues. Mass spectrometry (MS)-based bottom-up proteomic analysis of the purified material represents a robust strategy to identify nearly all the primary protein components of amyloid fibrils. Previous proteomic studies of proteins in the amyloid coronae have revealed an unexpectedly large and functionally diverse collection of proteins. Notably, after refining the purification strategy, the number of co-purifying proteins was reduced by more than 10-fold, indicating the high purity of the isolated SDS insoluble material. Negative staining and immuno-gold electron microscopy allowed confirmation of the purity of these preparations. Further studies are required to understand the spatial and biological attributes that contribute to the deposition of these proteins into amyloid inclusions. Taken together, this analytical strategy is well-positioned to increase the understanding of amyloid biology.

This biochemical purification method with mass spectrometry-based proteomic analysis facilitates the robust characterization of amyloid fibril cores, which may accelerate the identification of targets for preventing Alzheimer's disease.

Beyinden Amiloid Fibril Çekirdeklerinin Biyokimyasal Saflaştırılması ve Proteomik Karakterizasyonu

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

Isolation of Amyloid Fibrils from Brain Tissue Extract

Source: Upadhyay, A. et al., <a href="https://app.jove.com/v/63816">Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the protocol for isolating&#160; amyloid fibrils from mouse brain tissue extract using density gradient centrifugation and digestion of non-amyloid proteins.

Beyin Dokusu Ekstraktından Amiloid Fibrillerin İzolasyonu

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Tissue harvesting and ...

Deterjan çözünmez Protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

İnsan Kortikal Doku Aβ multimerlerin SDS-PAGE/Immunoblot Algılama Antijen-epitop Alma kullanarak homojenatlarında

Normal İnsan Beyin Çözünür ve çözünmez PrP Oligomerleri İzolasyonu

İnsan Postmortem Beyin Dokusu Nöronal Çekirdekler İzolasyon

Konsensus Beyin kaynaklı protein, 2D-DIGE ve Mini 2DE İmmünoblotting Hem kullanma İnsan ve Kemirgen Beyin proteomun Çalışmaları Ekstraksiyon Protokolü

Parkinson Brains gelen Çözünür ve çözünmez alfa-sinüklein Sıralı Ekstraksiyon

Kemirgen ve İnsan Beyin Dokularında Aktüer Polimerizasyon Durumunu Değerlendirmek için Zaman Verimli Floresan Spektroskopi Tabanlı Bir Tahlil

İnsan Nörodejenerasyonunda Nükleoporin Değişikliklerini İncelemek için Çekirdek İzolasyonu ve Süper Çözünürlüklü Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobu

İnsan Nörodejenerasyonunda Nükleoporin Değişikliklerini İncelemek için Çekirdek İzolasyonu ve Süper Çözünürlüklü Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobu

Beyinden Amiloid Fibril Çekirdeklerinin Biyokimyasal Saflaştırılması ve Proteomik Karakterizasyonu

Beyin Dokusu Ekstraktından Amiloid Fibrillerin İzolasyonu