Name: methods for the study of regeneration in stentor
Uploaded: 2018-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Study of Regeneration in Stentor at JoVE.com

Bu eser NIH grant R01 GM113602 (WFM) ve NSF 1144247 (AL) tarafından desteklenmiştir. Biz Mark Slabodnick ve Natalie Kirkland bazı bu protokoller ilk sürümleri geliştirmek ve bilgilendirici tartışma kabul edersiniz. Karina Perlaza ve Greyson Lewis el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz.

1. kültür Stentor ve tek hücre veya hücre parçaları Stentor kültürler oluşturma
<ol><li>Chlamydomonas reinhardtii kültür Stentorgıda olarak kullanılmak üzere hazırlayın.<ol>
<li>Chlamydomonas reinhardtii hücreleri ticari bir tedarikçiden (Tablo reçetesi) edinin.</li>
		<li>Chlamydomonas reinhardtii 500 mL sıvı kültürünün steril tekniği13kullanarak ticari olarak mevcut musluk medyada kurmak.</li>
		<li>Chlamydomonas kültür altında bir lamba Doygunluk (at doz yaklaşık 1) yakınındaki bir konsantrasyon haftada iki kez dokunun medya ile sulandrarak tutun. Not: Chlamydomonas kültür bir shaker üzerinde yetiştirilen olabilir.</li>
		<li>Düzenli olarak Chlamydomonas kültür kültür bir damla bir slayt üzerinde bir coverslip ile kapsayan koyup 40 X büyütme, mikroskop altında kontrol sağlıklı olup olmadığını denetleyin. Not: kültür bakteri ile kontamine yoksa Chlamydomonas hücreleri kümeler halinde toplanan Stentor beslenmesi için kullanmayın. Bu sorunların her iki durumda da yeni bir Chlamydomonas kültür başlatın.</li>
	</ol></li>
	<li>Stentor coeruleus hücreleri ticari bir tedarikçiden (Tablo reçetesi) edinin.</li>
	<li>Stentor hücreleri onların doğal habitat gerekiyorsa, gölet, göl veya nehir11koleksiyon yapıyorum.<ol>
<li>Gölet, göl veya nehir Stentor toplamak için suyun nispeten sakin, gölgeli ve açık olduğu bir alan bazı bitki örtüsü ile bulmak. Not: Burada duckweed büyür adreslerde Stentor bulma daha yüksek bir olasılık vardır.</li>
		<li>En az 2 lt su pour kolaydır bir kap içinde toplamak.</li>
		<li>Döküntü ve partiküler madde kabın altına yerleşmiş sonra yavaşça Stentorbirkaç saniye sonra her koleksiyonu büyük konteyner yerleşmek döküntü için bekleyen için incelemek için birkaç küçük kaplar doldurun.</li>
		<li>Örnekleri topluluğu bir konumda tamamlandıktan sonra en az 10 metre uzaklıktadır yeni bir konuma geçin ve orada örnekleri topluluğu. Not: birden fazla gölet tatmak zorunda kalabilirsiniz Stentor Vaha'da her gölet bulunmaktadır.</li>
		<li>Örnekleri ile laboratuvara dönmek ve su kaplarından bireysel Petri yemekler aktarın.</li>
		<li>Her kabında Stentor için bir stereomicroscope 5 X büyütme, eğik ışık altında arayın. Piyasada bulunan pastörize kaynak suyu (PSW) en az 100 µL içeren bir cam spot levha bir kuyunun içine 1 mL pipet kullanarak tek tek Stentor hücreler aktarın. Not: bir substrat (Şekil 1) bağlandığında bir trompet gibi şekil Stentor hücreleri var. Yüzme Stentor bir substrat (Video 1) bağlı hücreler daha az genişletilmiş hücrelerdir.</li>
		<li>Stentor PSW en az 3 yıkama x. Kuyuda Stentor hücreleri tutarak kuyudan su yaklaşık yüzde 90'ını kaldırarak yıkar gerçekleştirmek PSW 500 µL kuyunun içine ekleyerek izledi. Not: pipetler pipet ipuçları 10 µL veya daha küçük ile kullanarak Stentor tutmadan önce yaklaşık 0,5 mm pipet ucu hücreleri aracılığıyla büyük hücreli akar gibi oluşturulan kesme kuvvetleri nedeniyle yaralama önlemek için makas ile sonu kapalı kesmek çok küçük bir ipucu op ening.</li>
	</ol></li>
	<li>Chlamydomonas her Stentorbesleme önce hazırlayın.<ol>
<li>Chlamydomonas kültür 1.5 mL microcentrifuge tüp içine adım 1.1 olduğu gibi hazırlanan 1 mL aktarın. 2,095 x g 3 dk de santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant kaldırmak ve Pelet PSW 1 mL resuspended. 2,095 x g 3 dk. Kaldır süpernatant de santrifüj kapasitesi ve Pelet PSW 500 µL içinde resuspend. Not: Böylece, yıkanmış ve konsantre Chlamydomonas "Chlamydomonashazırlanan" aşağıdaki adımlarda sevk edilecek. DOKUNUN medya önce Stentor besleme önemlidir böylece Chlamydomonas yıkama Stentoriçin zararlı olduğunu.</li>
	</ol></li>
	<li>Klonal Stentor kültür gerekirse kültür tek bir Stentor hücre veya bir hücre parçası başlatın.<ol>
<li>Bu yana tek Stentor hücreleri de PSW büyümek değil, klimalı ortam medya bir varolan, sağlıklı Stentor kültüründen 500 µL sterilize filtre hazırlayın.</li>
		<li>Klimalı ortam 500 µL bir cam spot levha kuyu birine aktarın.</li>
		<li>Bir Stentor şartına ortamı içeren cam spot kalıbının kuyuya aktarın. Transfer yapmak için mümkün olduğunca küçük orta olarak kullanın.</li>
		<li>Hazırlanan Chlamydomonas her Stentor 5 µL her 48 h besleme. Stentor böldüğünüzde, iyi hücreleri saymak ve hazırlanan Chlamydomonas hücre başına 5 µL ekleyin.</li>
		<li>Hücrelerin ışıkta (örneğin, şeffaf plastik kutular kağıt havlu ile kaplı) duyarlı olduğundan Stentor gölgeli bir yerde saklayın.</li>
		<li>Taze şartına orta her 96 h ile iyi Stentor ortam değişimi.<ol>
<li>Adım 1.5.1 olduğu gibi temiz klimalı ortam hazırlamak.</li>
			<li>Tüm Stentor hücreler sıvı yukarı ve aşağı kuyuda pipetting hafifçe tarafından kuyunun dibinden bağlantısını kesin olun.</li>
			<li>Dikkatle de kullanarak tüm hücreleri kuyuda kalır emin bir 1 mL pipet sıvı Aspire edin. Taze şartına medya 500 µL kuyuya ekleyin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>İyi hücre sayısı 20 aşarsa, hücreler daha büyük konteyner için örneğin, bir geniş ağız cam kavanoz geçiş yapar.<ol>
<li>Bir autoclaved geniş ağız cam kavanoza PSW 20 mL ekleyin. Not: Cam Stentor için ısıyla dikkatli yıkama ve durulama ile değiştirilebilir.</li>
			<li>Dikkatli bir şekilde medya yukarı ve aşağı kuyunun tüm hücrelerden ayırmak için iyi pipette. 1 mL pipet ucu kullanarak tüm Stentor hücreleri toplamak ve hafifçe cam sürahi aktarmak.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kültürlerle yeterli hava erişmesine izin vermek için Stentor , kavanoz kapakları sıkın değil.</li>
		<li>PSW kavanoz her 48 h Stentor yoğunluğu yaklaşık 20 hücre/mL tutmak için ekleyin. Hücre yoğunluğu göz tarafından tahmin ediyoruz. Not: Alternatif olarak, 1 mL pipet kabarcık hava için kavanoza duvarlarından pipet kültür, 1 mL kadar bağlantısını kesin ve Pipet Ucu hücreleri saymak hücreleri olun</li>
		<li>Her 48 h, yem Chlamydomonas Stentor kültürler (bkz. Adım 1.4) kavanoz hazır. Kültür ile hazırlanan Chlamydomonas200 µL besleme ile başlayın. Kültür hacmi arttıkça, yavaş yavaş hazır Chlamydomonas ilâ 1 mL beslemek için kullanılan miktarını artırın.</li>
		<li>Kültür birimi jar'ın kapasitesi yaklaşık yüzde 90'ını ulaştığında kültür daha büyük bir kaba aktarın.<ol>
<li>Kültür kavanoz içinde yukarı ve aşağı, camdan Stentor ayırmak için 1 mL pipet ile pipette.</li>
			<li>Kavanoz tüm içeriğini 2 bardak cam kap içine dökün.</li>
			<li>Yaklaşık 25 mL PSW kalan Stentortoplamak için 2 su bardağı cam kaba olan durulayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>2 bardak Cam kaplarda sağlıklı kültürleri korumak.<ol>
<li>Stentor kültürler hazırlanan Chlamydomonas Kültür 100 mL başına 2 mL her 4-5 günde besle. PSW Stentor yoğunluğu yaklaşık 20 hücre/mL tutmak için her 4-5 gün cam kaba ekleyin. Not: 450 mL 2-cup kapsayıcı tutan en fazla birimdir.</li>
		<li>Haftada bir kez, kültürler diseksiyon mikroskop Wrotek, mantar ve diğer büyüme için X 5 altında inceleyin. Sağlık Kültür uzatmak için bulaşıcı mikroorganizmalar ile birlikte anormal şekilli ve renksiz Stentor hücreleri 1 mL pipet kullanarak kaldırın.</li>
		<li>Cam kap %90 dolu olduğunda, kültür bölün.<ol>
<li>PSW 25 mL Cam kaba ekleyin. 25 mL pipet pipet yukarı ve aşağı Stentor camı ayırmak için kullanın. Yeni bir 2 bardak cam kap içine taşımak hakkında %50-kültür.</li>
			<li>Her iki kültürler için 25 mL PSW ekleyin ve iki kültür iletişim kuralının bu bölümde açıklandığı gibi korumaya devam etmeyi planlıyor. Not: Stentor hücreleri yüksek sıcaklığa duyarlı olduğundan, kültürler saklandığı Oda sıcaklığı 25 ° C veya daha düşük korumak. Alternatif olarak, kültürlerin bir kuluçka makinesine tutulabilir. Stentor kültür sorun giderme için Tablo 1 ' e bakın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. inducing rejenerasyon kesme Stentor hücreleri tarafından
<ol><li>Kılcal tüpler gibi program kullanarak üzerinden birkaç iğne yapmak için bir iğne çektirmenin kullanın: ısı - 735, çekme - 100, hız - 110, zaman - 150, basınç - 400.</li>
	<li>PSW 50 mL % 4 methylcellulose çözeltilerine hazırlayın.<ol>
<li>Methylcellulose 1 g ekleyin (viskozite: 1500 cP) PSW 50 ml.</li>
		<li>Methylcellulose dağılması kolaylaştırmak en az 8 h için 4 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>%4 methylcellulose çözüm oda sıcaklığında tutmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir cam spot levha kesim gerçekleştirdikten sonra hücre parçaları saklamak için hazırlayın.<ol>
<li>Filtre sterilize sağlıklı bir kültür, 500 mL Cam spot levha de gerekli başına ortamdan.</li>
		<li>500 mL steril ortam her gerekli Wells aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(Tanımlanmış trompet şekli, canlı mavi-yeşil renk ve hiçbir büyük boşluklara sahip) bir sağlıklı Stentor 2 µL damlacık içinde toplamak ve bir coverslip veya slayt üzerinde yerleştirin. 2 µL % 4 methylcellulose (Şekil 2) ekleyin. Stentor (Video 2) kesmeden önce sakin ol bırak.</li>
	<li>Cam iğne iğne kırılma önlemek mümkün olduğunca kesme yüzeyine paralel olarak tutun.</li>
	<li>Bir stereo diseksiyon mikroskop kullanarak, cam iğne ucu bulun ve taşımak daha yakın hücreye (Şekil 3A). Stentor sözleşme temas üzerine iğne (Şekil 3B ve C) ile gözlemlemek. Not: ön sonunda zor posterior ucundan ayıran yapar bir yönde hücreyse çok yavaşça iğneyi tarafıyla döndürün.</li>
	<li>Cam iğne yan ile sözleşmeli Stentor üzerinde iki hücreyi kesmek için hafifçe bastırın(şekil 3D ve E, Video 3). İki parça parça füzyon önlemek için aralarında sitoplazmik hiçbir bağlantı sağlamak ayrı hareket (Şekil 3F).</li>
	<li>Her iki parçaları en az bir macronuclear her parçaları eğik aydınlatma diseksiyon mikroskop altında incelenerek donanıma sahip olup olmadığını kontrol edin. Not: en az bir macronuclear düğüm olan hücre hayatta kalmak için gereklidir. Hücre mavi-yeşil pigment ile birlikte onun film tabakası (şeffaf kabuk) sırasında veya sonrasında kesme dökmek. Çoğu durumda, bu hücrenin uzun vadeli canlılığı etkilemez.</li>
	<li>Parçaları adım 2.3 hazırlanan bir cam spot levha kuyu içine taşıyın.</li>
	<li>Kesme hücreleri bir kısmını değil yenileyecek çünkü birden çok hücre kesmek.</li>
	<li>Bir oturumda birden çok kesim yapmak Eğer cam iğne yerine ağır Stentor kalıntı veya ucu kırık ne zaman ile kaplı olur. Alternatif olarak, iğne silikon spacer bir parçasına nazikçe silerek temizleyin. Not: Cam iğneler birden çok hücre kesme oturum için kullanılabilir.</li>
	<li>Hücre parçaları ile cam spot levha nem odasında tutun.</li>
	<li>Bölüm 4 görüntüleme hakkında ayrıntılı bilgi için iletişim kuralı ve Stentor rejenerasyon sonuçları yorumlanması için devam edin.</li>
</ol>3. Membranellar grubu ve sukroz veya üre tedavisi Oral aparatı rejenerasyon inducing
<ol><li>Sükroz kullanarak Membranellar band ve oral aparatı kaldırma<ol>
<li>Sükroz PSW içinde % 25 çözeltisi hazırlamak.</li>
		<li>% 25 sukroz 500 µL ek kapaklı bir microcentrifuge tüp içinde PSW ekleyin.</li>
		<li>3 microcentrifuge tüpler PSW 1 mL her tüp ile ek kapaklar ile hücreleri sükroz tedavi sonrası yıkama için hazırlayın.</li>
		<li>30-60 Stentor hücreler kültür ortamlarına 1 ml 1 mL pipet (Şekil 4, ok A) kullanarak bir ayrı microcentrifuge tüp içine toplamak.</li>
		<li>Tüm hücreleri 200 µL pipet tek beraberlikle kullanarak 125 µL son hacim tüpte toplamak. Onları (3.1.2 adımda hazırlanan) % 25 sukroz 500 µL ile tüp 625 µL % 20 sükroz çözüm (Şekil 4, ok B) elde etmek için transfer. Bir kronometre başlatın.</li>
		<li>Bu % 20 sükroz çözüm ve fiske-spin raf için 1 dk microcentrifuge tüpte Stentor kuluçkaya.</li>
		<li>Tek bir beraberlik tüm hücrelerde toplamak (daha kolay koleksiyonu için 200 µL maksimum kapasite için pipet ayarlayın).</li>
		<li>Kronometre sükroz tedavi 2 dk gösterir kadar hücreleri pipet ucu tut.</li>
		<li>Bir adımda 3.1.3 (Şekil 4, ok C) hazırlanan microcentrifuge tüpler içine Stentor çıkarma. Fiske-spin tüp raf.</li>
		<li>İki kez daha, bir kez her microcentrifuge tüpler PSW içeren kalan iki adım 3.1.3 (Şekil 4, okları D ve E) hazırlanan hücreleri yıkayın. Not: Tek beraberlik hücre toplama tekniği yıkar arasında önemli değildir.</li>
		<li>Bölüm 4 görüntüleme hakkında ayrıntılı bilgi için iletişim kuralı ve yorumu Stentor rejenerasyon dinamiklerinin (Şekil 4, okları F ve G) için devam edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Üre kullanarak Membranellar band ve oral aparatı kaldırma<ol>
<li>PSW %4 üre çözeltisi hazırlamak.</li>
		<li>300 µL % 4 üre ek kapaklı bir microcentrifuge tüp içinde PSW ekleyin.</li>
		<li>3 microcentrifuge tüpler PSW 1 mL hücreleri üre tedaviden sonra yıkamak için her tüp içeren ek kapaklar ile hazır olun.</li>
		<li>30-60 Stentor hücreler kültür ortamlarına 1 ml 1 mL pipet (Şekil 4, ok A) kullanarak bir ayrı microcentrifuge tüp içine toplamak.</li>
		<li>Tüp içinde 300 µL son Hacim 1 mL pipet tek beraberlikle kullanarak tüm hücreleri toplamak. Onları 300 µL % 4 üre (3.2.2. adımda hazırlanan) ile tüp 600 µL % 2 üre çözüm (Şekil 4, ok B) elde etmek için transfer. Bir kronometre başlatın.</li>
		<li>Bu % 2 üre çözüm ve fiske-spin raf için 1 dk microcentrifuge tüpte Stentor kuluçkaya.</li>
		<li>Tek bir beraberlik tüm hücrelerde toplamak.</li>
		<li>Kronometre üre tedavi 2 dk gösterir kadar hücreleri pipet ucu tut.</li>
		<li>Bir adımda 3.2.3 (Şekil 4, ok C) hazırlanan microcentrifuge tüpler içine Stentor çıkarma. Fiske-spin tüp raf.</li>
		<li>İki kez daha, bir kez her microcentrifuge tüpler PSW içeren kalan iki adım 3.2.3 (Şekil 4, okları D ve E) hazırlanan hücreleri yıkayın. Not: Tek beraberlik hücre toplama tekniği yıkar arasında önemli değildir.</li>
		<li>Bölüm 4 görüntüleme hakkında ayrıntılı bilgi için iletişim kuralı ve yorumu Stentor rejenerasyon dinamiklerinin (Şekil 4, okları F ve G) için devam edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. görüntüleme ve hücre yenilenmesini analiz
<ol><li>İdam dik bir mikroskop kullanarak kullanıyorsanız görüntü yeniden oluşturulmasını tek tek hücreler için damlacık yöntemi.<ol>
<li>PSW 100 µL cam spot kalıbının kuyuya koymak.</li>
		<li>Kültür ortamının (içinde bulundukları ortam) 4 µL 1 Stentor hücrede izole, 10 ya da 20 µL kullanarak pipet. 22 x 22 mm2 coverslip (Şekil 5) ortasında damlacık Kasası. Not: hücreleri bu 1) sağlıksız olup olmadığını (anormal şekilli veya ağır vacuolated) ya da 2) hala membranellar bant veya oral için aygıtlar (kimyasal tedavi deneyleri için) varsa, görüntüleme için kullanmayın.</li>
		<li>Stentor 4 daha fazla damlacıkları önceki damlacık çevresinde kültür medyada damlacıklar arasında yeterli boşluk bırakarak düzenleyin.</li>
		<li>Coverslip damlacıkları ile ters çevir ve hafifçe PSW adım 4.1 içinde eklendiği cam spot levha kuyusu üzerine getirin.</li>
		<li>Not: PSW iyi (Şekil 5) damlacıkları buharlaşma en aza indirmek olacaktır.</li>
		<li>Kalan hücreleri adımları 4.1.1 - 4.1.4 izleyerek görüntüleme için hazır olun.</li>
		<li>İstediğiniz zaman çözünürlüğü ile mikroskop altında Yenileyici hücreleri görüntü. Alternatif olarak, bir diseksiyon stereo mikroskop kullanarak rejenerasyon gözlemlemek. Not: Hücre kesme veya sukroz veya üre ile tedavi hemen sonra yeniden oluşturma işlemi başlar. Ancak, görünür yeni ağız yapıları yeniden oluşturma işlemi başlangıç sonra yaklaşık 3 h oluşturacak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her zaman noktası için yeniden oluşturma işlemi etapları birini her hücreye atayın. Bunu yapmak için her hücreye aşamaları (Şekil 4 ve Şekil 6) gösteren temsili resim karşılaştırın.<ol>
<li>Aşama 1 bir membranellar Grup henüz (Şekil 6A) var mı hücrelere atayın.</li>
		<li>Stage 2 membranellar grubu ile hücrelere atayın. Not: Bir membranellar Grup 3-6 h (Şekil 4, Şekil 6B) tedaviden sonra görünür. Sadece bir oral primordium görüntülenmeden önce bu sahne çok sonunda membranellar grubun posterior sonuna ek bir eğimi görünür.</li>
		<li>Stage 3 bir oral primordium hücrelerle atayın. Not: Bir oral primordium 6-8 h membranellar grubu (Şekil 4, Şekil 6C ve 6 D) posterior sonundaki tedaviden sonra görünen bir invagination var. Hücreleri ön bitiş ve karakteristik trompet hücre şekil (Şekil 4, Şekil 6E) adlı bir membranellar orkestra varken yeniden oluşturma işlemi tamamlandı. En Stentor hücreler tamamen yenilenme başlangıcından bu yana içinde 8-9 h yeniden oluşturulur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her birine bir yığın kutu arsa (Şekil 7) şeklinde her zaman için yeniden oluşturma işlemi aşamaları yüzdesi arsa. Not: Bu tür bir arsa Vaha'da hücreleri rejenerasyon dinamiklerinin görselleştirme sağlar.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kirschner, M., Gerhart, J., Mitchison, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+"vitalism".">Molecular "vitalism".</a> Cell. 100 (1), 79-88 (2000).</li><li>Shulman, J. M., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+single+cells.">Pattern formation in single cells.</a> Trends in Cell Biology. 9 (12), M60-M64 (1999).</li><li>Wloga, D., Frankel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+molecules+to+morphology:+cellular+organization+of+Tetrahymena+thermophila.">From molecules to morphology: cellular organization of Tetrahymena thermophila.</a> Methods in Cell Biology. 109, 83-140 (2012).</li><li>Frankel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pattern Formation: Ciliate Studies and Models. , (1989).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+experiments+concerning+primordium+formation+in+Stentor+coeruleus.">Grafting experiments concerning primordium formation in Stentor coeruleus.</a> Journal of Experimental Zoology Part A. 131 (1), 75-121 (1956).</li><li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+smallest+parts+of+Stentor+capable+of+regeneration;+a+contribution+on+the+limits+of+divisibility+of+living+matter.">On the smallest parts of Stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor.">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macronuclear+genome+of+Stentor+coeruleus+reveals+tiny+introns+in+a+giant+cell.">The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell.</a> Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).</li><li>Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-repairing+cells:+How+single+cells+heal+membrane+ruptures+and+restore+lost+structures.">Self-repairing cells: How single cells heal membrane ruptures and restore lost structures.</a> Science. 356 (6342), 1022-1025 (2017).</li><li>Slabodnick, M., Prevo, B., Gross, P., Sheung, J., Marshall, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cytoplasmic+flow+during+single-cell+wound+healing+in+Stentor+coeruleus.">Visualizing cytoplasmic flow during single-cell wound healing in Stentor coeruleus.</a> Journal of Visualized Experiments. 82 (82), 50848 (2013).</li><li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Stentor. , (1961).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+stentor+morphogenesis.">The kinase regulator mob1 acts as a patterning protein for stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), e1001861 (2014).</li><li>Harris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Stentor kültür sorunları bir dizi sunuyor. İlk olarak, çok sayıda hücre gerektirir deneyler gerçekleştirmek için bir çok sayıda Stentor kültürlerin Stentor konsantrasyon 20 hücre/mL aştığında sağlıksız hale kültürler korumak gerekiyor. İkinci olarak, Stentor kültürler kez kontamine organizmalar Stentor daha hızlı Böl ve (ortak bir kirletici Wrotek 's) kültür korkutur. Böylece, düzenli olarak kültür bir mikroskop altında incelemek ve kirletici kaldırmak gereklidir. Zaman zaman, yeni bir kültür hücreleri el ile kirlenmiş bir kültürden kurtardım az sayıda üzerinden yeniden başlatılması gerekiyor. Bu sağlıklı Stentor kültürleri korumak için gereken süreyi artırır. Üçüncü olarak, tek bir hücre 400 mL kültür genişleyen Stentor hücre döngüsü 3-5 gün olduğundan en az bir ay gerektirir. Dördüncü olarak, başka bir model aksine ciliates, Stentor nadiren kist formuna gidin ve onlar dondurulamaz.
Stentor kültürü çalışmalarının önemli bir yönü bir uygun gıda organizma seçimidir. Stentor kültür için çeşitli yöntemler daha önce tarif edildi. Onlardan biri olan Stentoryem kültür bakteriler için yağsız süt kullanmayı göstermektedir. Böyle bir tekniği Stentorkültür etkilidir; Ancak, genomik tekniklerin uygulanması tanımsız gıda organizmalar genomik Okunma kaynaklanan karışıklığı önlemek için saf örnekleri gerektirir. Geçerli iletişim kuralını kullanarak, Stentor kitle yetiştirilir ve sıralı yemeklerini Chlamydomonas, çünkü gıda organizma genomik kirlenme varlığı algılanabilir ve için kontrollü. Bilinmeyen nedenlerden dolayı Tartar Stentor önce nerede bulduğunu için döndürerek hisselerini doldurmak zorunda. Geçerli protokol ile biz yıllardır Stentor yetişmek mümkün olmuştur.
Rejenerasyon deneyler Stentor ile genellikle basit ama akılda tutulması gereken birkaç kritik bilgi vardır. Bölüm 2 açısından Stentor kesme hücreleri yarım dakika içinde hakim. Stentor daha gelişmiş mikrocerrahi prosedürleri mastering pratik bir hafta gerektirebilir. Süre sükroz veya üre tedavisi (Bölüm 3) görüntüleme başında en hücreler hala onların membranellar grup varsa, performans, 10-30 s otelde sükroz tedavi sonraki gerçekleştirilir için kuluçka süresini artırmak. Hücre ölümüne neden olur çünkü sükroz tedavi 3 dk kuluçka dışında zaman artırmak değil.
Stentor Imaging rejenerasyon uzun süreler görüntü büyük hücrelere yöntemleri gerektirir. Bölüm 4'te ayrıntılı görüntüleme yöntemi yalnızca dik bir mikroskopla kullanılabilir. Daha sonra ters bir mikroskop yerine kullanılabilir durumdaysa, hücreleri bir slayt veya coverslip küçük odalarında yerleştirilebilir. Vazelin ve kapak odadan buharlaşma önlemek için başka bir coverslip oluşturmak için bir yöntemdir. Alternatif olarak, tek bir hücre için bir oda istediğiniz boyuta delik bir 1 x 1 cm2 silikon rondela kare ile bir delik yaparak yapılabilir (malzemeler tablo), yer açıcı bir coverslip yerleştirerek, hücre odasında koymak ve odası ile başka bir coverslip kapsayan. Imaging, Stentor rejenerasyon her aşamasının karakteristik özellikleri gözlemlemek için doğru yönde değilseniz, sıkıca hücre sözleşme yapmak için plaka dokunun. Hücre yenilenme aşamasında tanımlamak için uzatmak seyretmek (tam çekiş alır yaklaşık 45 s). Hala yanlış yönde hücreyse, dokunarak tekrarlayın. Şekil 1 ve Şekil 6 ' da gösterilen görüntüleri stereo zoom mikroskop tarafından alındı; Ancak, tüm deneylerin ayrıntılı stereo mikroskop dissekan X 5 kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Kültür ve Stentor Imaging yanı sıra başka bir yeniden oluşturma işlemi, özellikle zaman aşamalarında tanımlamak gerekli miktarı izleme mücadeledir. Yenileyici hücre mükemmel oral primordium açıkça görünür bölge ile odaklı ise, sahne alanı'nın kimlik birkaç saniye sürer. Bazen, ancak, Stentor hücre yenilenme aşamasında, böylece tanımlamak için daha fazla zaman ayırdığınız açık atama engelleyen bir yönde olduğunu. Tek tek hücreleri Yenileyici miktar böylece evreleme ve beklemek gözlemci gerektiren geçici hassas azalan Yenileyici hücrelerin tümünü geciktirebilir sahne ve bu hücreyi taşındı yeniden görüntü için gereken süre önemli miktarda Yeni bir yönelim. Sonuç olarak, bu zaman ve emek yoğun deneydir. Bu nedenlerden dolayı bu Stentor hücreleri tespit ve rejenerasyon video mikroskobu verilerdeki aşamalarında atama için otomatik yöntemleri geliştirmek için son derece cazip olacaktır. Bunlar da daha tekrarlanabilir deneyler için sağlayacak örnek boyutu ve insan önyargı kaldırılması artırır.
Son derece hassas genomik ve proteomik yöntemleri ortaya çıkması çalışmalar tek hücre ulaşmak koymak başladı. Böyle tek hücreli analizleri için dev bir Stentor hücre boyutunu kanıtı-of-concept deneyler için bir arzu test deneği yapar. Mümkün, bu tür deneyler için Stentor kültür esastır ve çok yöntem tanımlamak burada daha da daha gelişmiş tek hücreli teknikleri gelişiminde bir rol oynaması gerektiğini.

Hücreleri enzimler, ama bileşenleri dikkatle doğru boyutta ölçekli ve iyi tanımlanmış pozisyonlarda düzenlenmiş oldukça karmaşık makineler basit çanta değildir. Tek tek hücreleri morfogenez hücre ve gelişim biyolojisi anahtar bir işlemi temsil eder, ama onun Moleküler mekanizma bilinmeyen1,2. BLOB'ları kültürlü bazı hücreler benzer olsa da, tek hücreli organizmalar son derece ciliates3,4' te görülen karmaşık kortikal desenleri tarafından örneği mimarileri, karmaşık.
Belki de en uç iyi biçimde yapılandırılmış bir hücre Stentor coeruleus, dev heterotrichous ciliate uzaktan Tetrahymena ve amip ile ilgili örnektir. Stentor 1 mm uzunluğunda ve 100'den fazla boyuna çizgili mavi pigment tüm hücre uzunluğu çalıştırmak Mikrotubul şeritler Paralel Yığınlar tarafından düzenlenen kirpikler satır içeren alternatif ile kaplı. Hücre trompet-(Şekil 1), bir membranellar bandı ve onun ön uç ve arka tarafında substrat hücre ekler bir holdfast sözlü bir aparat (OA) ile biçimlendirilmiştir. Açık ön-arka polarite ek olarak, hücre Ayrıca silier satırlar arasında yavaş yavaş bir saat yönünde artış aralığı öyle ki kendine özgü bir kiral desenlendirme gösterir. Bu bir süreksizlik en geniş satır ve hücre yüzeyine, bu bölgenin birleştiği en dar satır sonuç şerit kontrast odağı bilinen, ön uç yapıları başka bir hücre5, aşılı ikinci dizi oluşumu tetikleyebilir resmen Spemann'ın Organizer'a eşdeğer yapma. Böylece, gelişim biyolojisi tüm önemli işlemleri kendi analogları Stentoriçinde var: axiation, desen oluşumu ve indüksiyon. Bir embriyo bu işlemler farklı hücreler arasında ama Stentorkader farklılıklar tarafından tahrik edilmektedir, onlar tek bir hücrede bulunan farklı bölgeler arasındaki farklar kader tarafından yönlendirilmesi gerekir. Ne Stentor berisi bölgeler arasındaki farkları tanımlayan bir muamma.
Stentor herhangi bir bölümünü kesilirse, hücre eksik parçası normal saatler hücrede vermeye yeniden oluşturabilirsiniz. Bir hücre ise yarısında veya bile daha küçük parçalar halinde kesilmiş her parça normal görünümlü ama daha küçük bir hücreye yeniden düzenler ve hücre bölümleri6,7arasında doğru orantı geri yükler. Hatta küçük parçaları, 1/64th orijinal hücrenin boyutu küçük ama normalde vücutlu bir hücreye yeniden ve o zaman için tam boy6büyümek edebiliyoruz. Stentor böylece genellikle doku veya tüm organizmalar düzeyinde uygulanan cerrahi yöntemlerle organel boyutu ölçekleme ve hücre büyüme düzenleme mekanizmaları incelemek için benzersiz bir fırsat sunuyor.
Stentor cerrahi operasyonlar geniş bir aralıktan yeniden izin veren özellikler tüm genom8yaklaşık 50.000 kopya ile tek nodulated macronucleus (Şekil 1) içeren biridir. Bir hücre parçası macronuclear en az bir düğüm içeren sürece tam olarak yeniden oluşturmak için yeteneğine sahiptir. Stentor' nın yenilenme yeteneği altında yatan başka bir müthiş yara iyileşmesi kabiliyetini özelliğidir. Birçok hücre tipleri onların yarası9iyileşme yeteneğine sahip olmakla birlikte, Stentor fiziksel tedirginlikler olağanüstü bir aralıktan kurtarmak yapabiliyor. Stentor10 sitoplazmik akışı görselleştirme için yöntemler ile birlikte ciddi bir pertürbasyon Stentor kurtarma örneği olduğunu daha önce bildirdi. Bu yöntemler sitoplazma fiziksel durumunu nasıl yaralama ve sonraki rejenerasyon etkiler çalışma izin.
Stentor' ın büyük boy, olağanüstü rejenerasyon yeteneği ve çoğu (örneğin, organizatörler, axiation ve desenlendirme) çok hücreli embriyo görüldüğü gelişimsel olayların bildirimlerini gerçek sırasında birçok gelişme biyologlar çekti yüzyılın son Thomas Hunt Morgan7de dahil olmak üzere. 50 's ve 60 's sırasında mikrocerrahi yaklaşımlar bu tek hücreli organizma11rejeneratif ve morfogenetik işlemlerinde şaşırtıcı bir dizi gösterdi. Ancak, Stentor bir moleküler biyoloji modeli sistem olarak yakın zamanda geliştirilmiştir. Son birkaç yıl içinde Stentor genom sıralı ve8monte ve gelişmiş12yöntemi yedirerek, RNAi kullanarak gen ekspresyonu huzursuz oldu.
Stentor modern moleküler biyoloji sadece bir model organizma içine geliştirilmiştir nedenlerinden biri son zamanlarda büyük kültürleri kendi uzun hücre döngüsü (3-5 gün) nedeniyle büyüyen zorluk oldu. Ancak, daha az malzeme onlar için kullanılan ve tek bir Stentor hücre hacmi bile tek analizi için geliştirilen NEMS yöntemlerine başvurmadan bu yöntemler için yeterlidir daha modern genomik ve proteomik Yöntemler gerektirir Stentorçok daha küçük olan hücreler. Bölüm 1 iletişim kuralının tek Stentor hücreden büyük bir kültür oluşturmak için yordam ayrıntıları. Aynı yaklaşım bir hücre kesim tarafından elde edilen bir hücre parçası büyük bir kültür oluşturmak için kullanılabilir. Bölüm 1 da uzun süreler sağlıklı Stentor kültürleri korumak için yönergeler sağlar. Bölüm 2 Protokolü'nün hücreleri el ile bir cam iğne ile kesim tarafından hücre yenilenmesini inducing için yöntemler sağlar. Bölüm 3 iletişim kuralının belirli hücre yapıları (membranellar band ve oral aparatı) yenilenme inducing iki yöntem adamıştır: sükroz veya üre hücrelerle tedavi yol açar ve ardından bu yapılar, dökülme için onların rejenerasyon. Bölüm 4 iletişim kuralının tek tek hücreleri Yenileyici görüntüleme üzerinde uzun süreler için bir yöntemi ayrıntıları. Bölüm 4 rejenerasyon ve ipuçları rejenerasyon dinamiklerinin Analizi aşamalarında açıklaması ile sona erer.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Stentor coeruleus&lt;/em&gt; live culture</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>131598</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Chlamydomonas&lt;/em&gt; &lt;em&gt;reinhardtii&lt;/em&gt; on agar</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>152040</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurized springwater, 1-quart bottle</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>132458</td><td></td></tr><tr><td>Methyl cellulose, 1500 cP</td><td>Millipore Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex glass spot plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>13748B</td><td></td></tr><tr><td>Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>715740</td><td></td></tr><tr><td>2-cup glass container with glass lid</td><td>Pyrex</td><td>1095600</td><td></td></tr><tr><td>CultureWell silicone sheet material</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Fisher finest</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>TAP Growth Media, optimized for &lt;em&gt;Chlamydomonas&lt;/em&gt; culture</td><td>ThermoFisher</td><td>A1379801</td><td></td></tr><tr><td>Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Petrolatum, Petroleum Jelly, White</td><td>Spectrum</td><td>P1037</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary tubes.&lt;br/&gt; OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm.</td><td>Sutter Instrument</td><td>B120-90-10</td><td></td></tr><tr><td>Needle puller P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000 stereo microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiozoom V16, stereo zoom microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methods for the study of regeneration in stentor

Hücreler dış tedirginlikler kurtarmak için yerlerine yeniden gerekir. Tek hücreli ciliate Stentor coeruleus bir yara iyileşmesi çalışmaya mükemmel model organizma ve sonraki hücre yenilenmesini dir. Stentor genom Son zamanlarda, RNAi gibi modern moleküler biyoloji yöntemleri ile birlikte satışa sunuldu. Bu araçlar tek hücre yenilenme moleküler seviyede eğitim olanak sağlar. Protokol ilk bölümünü kurulması Stentor hücre kültürleri tek hücreler veya hücre parçaları, birlikte Stentor kültürleri korumak için genel kurallar içerir. Stentor büyük miktarlarda kültür Biyokimya, sıralama ve kütle spektrometresi gibi değerli araçlar kullanmak için izin verir. Sonraki bölümlerde iletişim kuralının Stentorrejenerasyon inducing için farklı yaklaşımlar kapsar. El ile kesme hücreleri bir cam iğneyle sükroz veya üre hücrelerle tedavi hücre ön sonunda bulunan belirli yapılara yenilenme eğitim izin verirken büyük hücreli parçaları, yenilenme eğitim sağlar. Evreleme ve rejenerasyon dinamiklerini analiz için bir bölüm birlikte görüntüleme bireysel Yenileyici hücreler için bir yöntem sağlanır. Rejenerasyon tüm süreci üç aşamalı olarak ayrılmıştır. Hücreleri aşamalarla nüfusu ilerleme dinamiği görselleştirme tarafından yenilenme zamanlamayla heterojenite gösterilmiştir.

Stentor kültürler güvenilir bir şekilde kurulan ve tek tek hücreler veya hücre parçaları Bölüm 1 iletişim kuralı kullanılarak saklanır. Büyük bir sağlıklı kültürün temsilcisi örnek Video 1' de gösterilen.
Zamanlı kurs rejenerasyon yenilenme adım 3.1, görüntüleme ve analiz yöntemi Bölüm 4 (Şekil 7) ele birlikte özetlenen başlatmak için sükroz tedavi yöntemini kullanarak Stentor ölçülmüştür. Bu arsa bir saat süren formaya hücreleri nüfus tarafından belirli herhangi bir sahne ulaşmak için geçen süre içinde olduğunu gösterir. Bu tür bir analiz hücreleri yenileyici bir nüfus yenilenme işleminde geçici heterojenite çalışma sağlar.
Şu ana kadar sükroz tedaviler (Şekil 4 ve Şekil 6) düzinelerce sonra gözlenen rejenerasyon zamanlama özeti aşağıdadır. Stentor hücreleri (Bu aşamada hemen sükroz fiyasko sonra başlar) herhangi bir membranellar grup olmadan yaşlar gibi baktığımda 1 aşamasıdır. Bir membranellar grup görünüp (sukroz tedaviden sonra 3-6 h) yetişen 3-6 h. Stage 2 için bu aşamada sürer. 3-4 h. Stage 3 bir oral primordium membranellar grubu (sukroz tedaviden sonra 6-8 h) posterior sonunda görünür ve her iki yapılar ön hücrenin sonuna doğru taşınır için bu aşamada sürer. Bu sahne için 1-2 saat sürer. Membranellar band ve sözlü aparatı hücrenin ön sonuna erişildiğinde, bu yeniden oluşturma işlemi tamamlandığında belirtti. Hücre karakteristik Stentor trompet benzeri şekli kabul etmiştir. Hücreleri tamamen rejenere 8-9 h sükroz tedaviden sonra vardı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig1.jpg"> Şekil 1. Anlık görüntüsünü Stentor. Membranellar bant ve sözlü aparatı hücre ön sonunda gösterilir. Holdfast hücrenin arka sonundadır. Stentor macronucleus nodulated olduğunu. İyi beslenmiş Stentor yeşil gıda çoğunlukla Chlamydomonasiçeren boşluklar vardır. Ölçek çubuğu olduğunu 0.5 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig2.jpg"> Şekil 2. Stentor kesme set-up. Hücre kesme el ile piyasada bulunan bir diseksiyon stereo mikroskop kullanarak hücre, bakarken bir cam iğne işleyerek gerçekleştirilir. Kağıt mendil amacı hücreleri daha iyi görmek için beyaz arka plan sağlamaktır. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig3.jpg"> Şekil 3. Anlık görüntülerini Video Stentor cam iğne ile kesmek için nasıl gösteren 3. Hemen iğne dokunana önce(a)A Stentor . (B) A Stentor yavaşça bir iğne ve cam slayt arasında sıkışmış. (C) A iğne gücüne tepki Stentor sözleşmeli. (D) A Stentor yavaşça iğneyi tarafı ile cepten basarak kesilmiş. (E) A Stentor şimdi ikiye ama değil ayrılmış. (F) iki Stentor parçaları. Ölçek çubuğu olan 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2.jpg"> Şekil 4. Bölüm 3 ve Bölüm 4 Protokolü'nün şematik görselleştirme. Bu sükroz veya üre tedavisi ve hücre yenilenmesini gözlenmesi gerçekleştirmek için resimli bir protokoldür. Alt panelinde belirtilen zaman yıkama 1 başından itibaren ölçülür. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig5.jpg"> Şekil 5. Kurulum rejenerasyon dik bir mikroskop ile görüntüleme ve/veya doğrudan gözlem için. Coverslip asılı her 4 µL damlacık içinde bir hücre yenilenme geçiren vardır. Cam spot levha kuyu su damlacıkları buharlaşma sınırlar. Paralel olarak birden çok hücre yenilenme takiben bu kurulum verir. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig6.jpg"> Şekil 6. Stentor anlık görüntülerde her aşamasında membranellar bant ve sözlü aparatı rejenerasyon. (A)sahne 1 bir gözyaşı damlası gibi hücre şekil ve membranellar grup yokluğu ile karakterize. (B) sahne 2 membranellar Grup, sürekli atıyor kirpikler tabanlı yapısı görünümünü tarafından karakterizedir. Membranellar bantları panelleri B beyaz kesikli çizgilerle işaretlenir - ö. (C ve D) Aşama 3 oral primordium (bir okla işaretli) görünümünü ile karakterizedir. Oral primordium membranellar grubun posterior sonunda bir invagination gibi görünüyor. Oral primordium sonra hücreyi ön doğru sözlü aparatı olmak yukarı taşıyın. Hücre karakteristik Stentor trompet benzeri şekli benimsemiştir ve sözlü aparatı (bir okla işaretli) hücre ön sonunda büyümüştür (E) yeniden oluşturma işlemi tamamlanır. Ölçek çubuğu olan 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig7.jpg"> Şekil 7. Kutu arsa gösteren yığılmış nasıl oranlar hücre yenilenme sükroz tedaviden sonra tüm evrelerinde değiştirir zamanla. Arsa yeniden oluşturma işlemi aşamaları Yenileyici hücreleri nüfusu içinde zamanlaması heterojenlik gösterir. "Trafiğe çıkış son" yenilenme tamamlanması gösterir. Hücre sayısı: 28. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57759/57759video1.jpg"> Video 1. Örnek bir sağlıklı Stentor kültür. Bir kültür Bu konsantre ise, genellikle, kültür bölme önerilir. Bu videoyu izlemek için <a href="/files/ftp_upload/57759/Video1.mp4" target="_blank">lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57759/57759video2.jpg"> Video 2. Stentor methylcellulose ile yavaşlama. Bu videoyu izlemek için <a href="/files/ftp_upload/57759/Video2.mov" target="_blank">lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/57759/57759video3.jpg"> Video 3. Kesme Stentor. Tek tek hücreleri el ile mikroskop hücre cam iğne basarak anatomi bir stereo altında birden fazla parçalara kesilebilir. Bu videoyu izlemek için <a href="/files/ftp_upload/57759/Video3.mov" target="_blank">lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Kültür ile sorun</td>
			<td>Muhtemel çözümü</td>
			<td>Mümkün önlenmesi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kültür Wrotek veya diğer büyük organizmalar tarafından boğulmuş olduğunu.</td>
			<td>Çok sayıda Stentor mümkün olduğu yeni bir kültür tabak içine kaldırın. Sonra hücreleri üç kez yıkayın.</td>
			<td>Stentor onları, ne zaman bile onları ticari bir tedarikçiden satın alırken iyice yıkayın.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kültür mantar veya diğer küçük organizmalar tarafından boğulmuş olduğunu.</td>
			<td>Bir köşe tanımlamak vardır en azından Stentor. O bölgede birçok Stentor kaldırmadan mümkün olduğu kadar medya kaldırın ve yeni PSW ekleyin. Yavaşça ama iyice distrubute için istilacı organizmaların karıştırın. Sonraki besleme atlayın ve Stentor onları yemek.</td>
			<td>Kültür düzenli olarak gözlemlemek ve medya için taze PSW değiş tokuş ederek küçük kirletici maddeleri kaldırın.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor birbirinin üstüne atma.</td>
			<td>Konsantrasyonu 20'den az hücre/mL olması kültür bölün.</td>
			<td>Kültürler daha sık bölün.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor hücreleri çiftleşme.</td>
			<td>Her 5 günde yerine her 4 günde besle.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Kültür karanlık atık malzemenin bir yeri vardır.</td>
			<td>Çok karanlık malzemenin hücreleri çıkarmadan mümkün olduğunca Stentor atık olmaktan çıkarın. Stentor karanlık malzeme iliştirilmişse, yukarı ve aşağı kendi atık Stentor hücrelerden serbest bırakmak ve sonra hücreleri çıkarmadan medya ile atık kaldırmak için pipet. Veya, bu Stentor kaldırmak ve buna göre yem daha az.</td>
			<td>Besleme Stentor daha az yemek kültürünün 100 mL başına 1 mL.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sağlıksız seyir (vacuolated/davul gibi şişmiş veya yuvarlak) Stentor.
</td>
			<td>Birçok Stentor hücreleri çıkarmadan mümkün olduğu kadar medya kaldırın ve yeni PSW ekleyin.</td>
			<td>Medya düzenli olarak değişimi.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Stentorkültür için sorun giderme kılavuzu.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Study of Regeneration in Stentor at JoVE.com

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Rejenerasyon Stentor içinde çalışma yöntemleri

Dev ciliate, Stentor coeruleus, rejenerasyon çalışma ve iyileşmesi için mükemmel bir sistemdir. Biz Stentor hücre kültürleri tek hücreler veya hücre parçaları kuran, rejenerasyon kesme hücreleri tarafından inducing, kimyasal olarak membranellar bant ve sözlü aparatı, görüntüleme ve hücre analizi rejenerasyon inducing için yordamlar mevcut rejenerasyon.

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

methods-for-the-study-of-regeneration-in-stentor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

11.7K Görüntüleme.  University of California San Francisco. Dev ciliate, Stentor coeruleus, rejenerasyon çalışma ve iyileşmesi için mükemmel bir sistemdir. Biz Stentor hücre kültürleri tek hücreler veya hücre parçaları kuran, rejenerasyon kesme hücreleri tarafından inducing, kimyasal olarak membranellar bant ve sözlü aparatı, görüntüleme ve hücre analizi rejenerasyon inducing için yordamlar mevcut rejenerasyon.

Video: Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

Teton Sisteminin Kullanımı Moleküler Mekanizmalar Zebra balığı Yenilenme Eğitim için

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Gelişim Biyolojisi

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Starlet Deniz Anemone Aboral physa Tam Polip Regeneration uyaran<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Despite the considerable progress made in the stent development in the last decades, cardiovascular diseases remain the main cause of death in western countries. Beside the benefits offered by the development of different drug-eluting stents, the coronary revascularization bears also the life-threatening risks of in-stent thrombosis and restenosis. Research on new therapeutic strategies is impaired by the lack of appropriate methods to study stent implantation and restenosis processes. Here, we describe a rapid and accessible procedure of stent implantation in mouse carotid artery, which offers the possibility to study in a convenient way the molecular mechanisms of vessel remodeling and the effects of different drug coatings.

A model of stent implantation in mouse carotid artery is described. Compared to other similar methods, this procedure is very rapid, simple and accessible, offering the possibility to study in a convenient way the vascular wall reaction to different drug-eluting stents and the molecular mechanisms of restenosis.

Restenoz Çalışmaları Karotis Arter Stent İmplantasyonu bir murin Modeli

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Tıp

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

Here we present a protocol that is based on spinal cord slices cultured on multi-electrode arrays to study functional regeneration of propriospinal connections in vitro.

Çok elektrot Dizileri Yetiştirilen Organotipik Omurilik Co-kültürler Fonksiyonel Rejenerasyon incelenmesi

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

Nörobilim

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

Planarian İmmobilizasyon, Kısmi Işınlama, ve Doku Nakli

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

Biyoloji

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Tek hücreli Yara Şifa sırasında Sitoplazmik Akışı görselleştirme<em&gt; Stentor coeruleus</em

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Yetişkin Zebra balığı Lateral Hat Rejenerasyon için bir Deneyi

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

A Standardized Murine Model of Extracorporeal Shockwave Therapy Induced Soft Tissue Regeneration

Shockwave therapy (SWT) shows promising regenerative effects in several different tissues. However, the underlying molecular mechanisms are poorly understood. Angiogenesis, a process of new blood vessel formation is a leading driver of regeneration in softer tissues as well as a recently discovered effect of SWT. How the mechanical stimulus of SWT induces angiogenesis and regeneration and which pathways are involved is not fully understood. To further improve the clinical use of SWT and gain valuable information about how mechanical stimulation can affect tissue and tissue regeneration, a standardized model of SWT is needed. We, hereby, describe a standardized, easy to implement murine model of shockwave therapy induced regeneration, utilizing the hind-limb ischemia model.

This article describes a standardized murine model of tissue regeneration via shockwave treatment.

Shockwave therapy (SWT) shows promising regenerative effects in several different tissues. However, the underlying molecular mechanisms are poorly ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that has emerged as an essential model for regeneration studies. Little is known about how revascularization occurs in the context of regeneration in these animals. Here we report a simple method for visualization of the vasculature in axolotl via perfusion of 1,1&#8217;-Dioctadecy-3,3,3&#8217;,3&#8217;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI is a lipophilic carbocyanine dye that inserts into the plasma membrane of endothelial cells instantaneously. Perfusion is done using a peristaltic pump such that DiI enters the circulation through the aorta. During perfusion, dye flows through the axolotl&#8217;s blood vessels and incorporates into the lipid bilayer of vascular endothelial cells upon contact. The perfusion procedure takes approximately one hour for an eight-inch axolotl. Immediately after perfusion with DiI, the axolotl can be visualized with a confocal fluorescent microscope. The DiI emits light in the red-orange range when excited with a green fluorescent filter. This DiI perfusion procedure can be used to visualize the vascular structure of axolotls or to demonstrate patterns of revascularization in regenerating tissues.

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Using a lipophilic 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) staining technique, Ambystoma mexicanum can undergo vascular perfusion to allow for easy visualization of the vasculature.

Vasküler Görselleştirme İçin Bir Yöntem Olarak DiI Perfüzyonu<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds of genes&#8212;many not associated with the oral apparatus (OA)&#8212;that are differentially regulated in phases throughout the regeneration process. It was hypothesized that this systemic reorganization and mobilization of cellular resources towards growth of a new OA will lead to observable changes in movement and behavior corresponding in time to the phases of differential gene expression. However, the morphological complexity of S. coeruleus necessitated the development of an assay to capture the statistics and timescale. A custom script was used to track cells in short videos, and statistics were compiled over a large population (N ~100). Upon loss of the OA, S. coeruleus initially loses the ability for directed motion; then starting at ~4 h, it exhibits a significant drop in speed until ~8 h. This assay provides a useful tool for the screening of motility phenotypes and can be adapted for the investigation of other organisms.

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

We present a protocol for the characterization of motility and behavior of a population of hundred micron- to millimeter-sized cells using brightfield microscopy and cell tracking. This assay reveals that Stentor coeruleus transitions through four behaviorally distinct phases when regenerating a lost oral apparatus.

Hücre İzleme Kullanılarak Oral Aparat Rejenerasyonu Sırasında ve Sonrasında Stentor Motilite Paternlerinin Analizi

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...

Rejenerasyon Stentor içinde çalışma yöntemleri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

PLAYLIST